一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] NK細(xì)胞是機(jī)體抵抗惡性腫瘤和病毒感染的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，起源于骨髓來源的 CD34+造血祖細(xì)胞，無需有抗體存在或預(yù)先致敏便可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤免疫治療的 重要效應(yīng)細(xì)胞。隨著對NK細(xì)胞識別人類腫瘤分子機(jī)制研宄的深入，以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫 瘤免疫治療引起重視并取得重大進(jìn)展。目前有關(guān)NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療的研宄主要集中 在自體NK細(xì)胞過繼免疫治療、異體NK細(xì)胞過繼免疫治療及基因修飾NK細(xì)胞免疫治療等， 并已取得顯著成效。但如何在保證臨床安全性的前提下提高NK細(xì)胞體外增殖效率和殺傷 活性一直是科研工作者和臨床醫(yī)生共同探索研宄的重點(diǎn)。
[0003] 目前主要是從培養(yǎng)基和血清種類，細(xì)胞刺激因子，輔助飼養(yǎng)細(xì)胞等各方面探索NK 細(xì)胞高效培養(yǎng)的捷徑。體外NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)體系中，常用培養(yǎng)基分別為CellGro SCGM， 1^]\〇-164〇培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基0，1￥〇了]\1361'11111-打66]^(1丨3)3大類。各培養(yǎng)基的使用 效果證實(shí)CellGro SCGM培養(yǎng)基比RPMI-1640和X-VivolO培養(yǎng)基能更有效支持NK細(xì)胞生 長活化與擴(kuò)增。已知IL-2、IL-15、IL-18和IL-12等細(xì)胞因子對NK細(xì)胞的活化與擴(kuò)增非常 重要，其中IL-15的作用尤為重要。IL-2是體外擴(kuò)增NK細(xì)胞體系中最常用的細(xì)胞因子，可 以在24h反應(yīng)期內(nèi)提高NK殺傷活性并刺激其增殖。近期Strivastava等研宄證實(shí)IL-15 單獨(dú)或聯(lián)合IL-2使用通常會導(dǎo)致最低限度NK細(xì)胞擴(kuò)增（Strivastava S，Lundqvist A， Childs RW. Cytotherapy，2008,10(8) :775-783)。大量研宄證明細(xì)胞因子對NK細(xì)胞的活化 和擴(kuò)增是必要的，但是僅有細(xì)胞因子并不能刺激NK細(xì)胞達(dá)到最理想的增殖狀態(tài)。Alici等 在多發(fā)性骨髓瘤患者體外NK細(xì)胞擴(kuò)增的研宄中使用IL-2和0KT3作為其細(xì)胞刺激因子，細(xì) 胞擴(kuò)增明顯（Alici E，Sutlu T，Bjork strand B，Gill jam M，et al. Blood，2008,111(6): 3155-3162)。另外絕大多數(shù)研宄人員認(rèn)為NK細(xì)胞持續(xù)增殖需要在細(xì)胞因子的基礎(chǔ)上增加 額外刺激信號，比如同種異體單核細(xì)胞、自體淋巴細(xì)胞、促分裂素活性淋巴細(xì)胞、臍血間充 質(zhì)干細(xì)胞等輔助飼養(yǎng)細(xì)胞。目前多采用病毒轉(zhuǎn)染的B淋巴細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞以提 高NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，但其安全性尚待探討。
[0004] 總體來說，目前的NK細(xì)胞擴(kuò)增效果仍不能滿足實(shí)際應(yīng)用，且Cellgro培養(yǎng)基和 IL-15的價格都非常昂貴，故一般在國內(nèi)使用的培養(yǎng)基均為普遍可以用來培養(yǎng)免疫細(xì)胞的 培養(yǎng)基，但細(xì)胞培養(yǎng)的效果奇差。如何找到一種成本低且操作便捷的NK細(xì)胞培養(yǎng)方法具有 巨大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一，為此，本發(fā)明的一個目的在于 提供了一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，旨在降低了 NK細(xì)胞的培養(yǎng)成本。
[0006] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0008] (1)從人外周血中分離單個核細(xì)胞；
[0009] (2)將單個核細(xì)胞接種到適合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，加入CD3單克隆抗體，重 組人白細(xì)胞介素2,自體血漿，培養(yǎng)3-5天；
[0010] (3)加入重組人白細(xì)胞介素2,自體血衆(zhòng)，培養(yǎng)；
[0011] ⑷收獲NK細(xì)胞。
[0012] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例提供的一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，還可以具有如下附 加的技術(shù)特征：
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述適合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基為AM-V培養(yǎng)基；X-VIVO 15培養(yǎng)基；H3培養(yǎng)基；GT-T551培養(yǎng)基；Alys-505N無血清培養(yǎng)基 ；RPMI1640+10%FBS培養(yǎng) 基；AM-V培養(yǎng)基；X-VIVO 15培養(yǎng)基和ALyS505NK培養(yǎng)基中的一種。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟（2)中⑶3單克隆抗體的濃度為50~300ng/mL。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述重組人白細(xì)胞介素-2的濃度為300-600U/mL。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述自體血漿的濃度為0~5%。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟（3)中的培養(yǎng)為擴(kuò)瓶培養(yǎng)。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟（3)中的培養(yǎng)為培養(yǎng)袋培養(yǎng)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述步驟（3)中的培養(yǎng)至少5天。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法得到的細(xì)胞主要由表型為CD3-CD56+的自然殺傷 細(xì)胞組成。
[0021] 本發(fā)明的技術(shù)效果為：
[0022] 1、本發(fā)明選用廉價的培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞，大大降低了成本，同時還保證了 NK細(xì) 胞的擴(kuò)增倍數(shù)和細(xì)胞毒性；
[0023] 2、本發(fā)明僅用了兩種細(xì)胞因子即CD3單克隆抗體和重組人白細(xì)胞介素2就實(shí)現(xiàn)了 對NK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。
[0024] 3、本發(fā)明在不加入任何血清時，同樣能實(shí)現(xiàn)對NK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增，還避免了過 多外界物質(zhì)的介入影響了 NK細(xì)胞；
[0025] 4、本發(fā)明操作簡便，加入因子種類少，節(jié)省了操作時間的同時減少了操作失誤的 可能性，使細(xì)胞的獲得效率更高且安全性更好。
[0026] 總之，本發(fā)明提供的一種NK細(xì)胞培養(yǎng)方法既保證了 NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)和細(xì)胞毒 性，又大大降低了 NK細(xì)胞的培養(yǎng)成本。
[0027] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說明】
[0028] 圖1是血液來源的單核細(xì)胞未經(jīng)誘導(dǎo)前NK含量圖；
[0029] 圖2是本發(fā)明提供的一種NK細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)后達(dá)到的效應(yīng)細(xì)胞圖；
[0030] 圖3是常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)后達(dá)到的效應(yīng)細(xì)胞圖。
[0031]圖4是本發(fā)明與常規(guī)培養(yǎng)方法NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較圖。
[0032] 圖5是本發(fā)明與常規(guī)培養(yǎng)方法所得NK細(xì)胞對K562細(xì)胞殺傷性的比較圖。
[0033] 圖6是使用本發(fā)明培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法培養(yǎng)的NK細(xì)胞第5天的細(xì)胞圖。
[0034] 圖7是使用本發(fā)明培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法培養(yǎng)的NK細(xì)胞第10天的細(xì)胞圖。
[0035] 圖8是使用本發(fā)明培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法培養(yǎng)的NK細(xì)胞第15天的細(xì)胞圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 來自外周血液的NK細(xì)胞培養(yǎng)
[0039] 材料與方法
[0040] 本發(fā)明中用到的RPMI-1640培養(yǎng)基選自GIBCO公司，重組人IL-2從市場購買而 來。
[0041] 步驟a:自體血漿的制備
[0042] 在生物安全柜中將注射器中的40mL-60mL抗凝全血平均分裝到2支50mL無菌離 心管中，用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，離心10min，離心完成后吸取上層血漿，56°C， 30min滅活補(bǔ)體，置于4°C水浴中放置15分鐘，再用離心機(jī)離心，離心速度為2500rpm，離心 20分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。標(biāo)記，置于-20°C冰箱中保存；
[0043] 步驟b:單個核細(xì)胞的分離
[0044] 向步驟a中所述的離心后未被吸取的血細(xì)胞中加入緩沖鹽溶液25mL，稀釋血細(xì) 胞，邊吹打邊旋轉(zhuǎn)離心管，混勻。取30mL混勻的稀釋血緩慢加到裝有淋巴細(xì)胞分離液的 50mL離心管內(nèi)。用離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速為2100rpm離心30分鐘