本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因組上單個核苷酸的變異(包括置換、顛換、缺失和插入)形成的遺傳標(biāo)記，相比微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其數(shù)量多，多態(tài)性豐富。一般而言，SNP是指變異頻率大于1％的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000個堿基就有一個SNP，人類基因組上的SNP總量大概是3×10⁶個。因此，SNP成為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對藥物敏感度或疾病的易感性等都可能與SNP有關(guān)。

隨著我國人口老齡化，心腦血管病發(fā)病率逐年攀升，心腦血管疾病早已成為人類健康的第一大殺手，心腦血管疾病的高致死率、致殘率和復(fù)發(fā)率已造成了極大的社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？寡“逅幬?尤其是阿司匹林)在心腦血管病的防治中起著至關(guān)重要的作用，但是目前的調(diào)查結(jié)果表明很多心腦血管病患者即使服用了抗血小板藥物，仍然反復(fù)再發(fā)卒中，這種現(xiàn)象稱為抗血小板藥物抵抗。

抗血小板藥物抵抗與諸多因素相關(guān)，如心腦血管病的相關(guān)危險因素(糖尿病、代謝綜合征、急性冠脈綜合征疾病等)，患者依從性或藥物劑量，藥物相互作用及基因多態(tài)性等。其中基因多態(tài)性因素是目前研究熱點(diǎn)。阿司匹林在體內(nèi)主要是通過與內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)氧酶(Cyclooxygenase，COX)的結(jié)合使其失活，從而抑制血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)的產(chǎn)生，達(dá)到抗血小板的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)影響阿司匹林作用的多個環(huán)節(jié)因子存在基因多態(tài)性，這種多態(tài)性直接影響其功能，從而使得不同個體服用阿司匹林后，對血小板的反應(yīng)不同。據(jù)不完全統(tǒng)計，臨床阿司匹林抵抗的患者高達(dá)40％。阿司匹林作為缺血性腦血管疾病二級預(yù)防的重要藥物，盡快明確阿司匹林抵抗相關(guān)基因多態(tài)性至關(guān)重要。

COX有兩種同工酶，即COX-1和COX-2。COX-l主要在成熟血小板表達(dá)，阿司匹林通過乙酰化COX-1活性位點(diǎn)530位的絲氨酸，不可逆抑制COX-1的活性，從而阻斷血栓素A2(TXA2)介導(dǎo)的血小板活化，用于預(yù)防血栓性血管事件的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)COX-1常見的4個多態(tài)性位點(diǎn)與阿司匹林抵抗的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SNP中A842G與阿司匹林抵抗有關(guān)，在用AA誘導(dǎo)測血小板聚集率時，阿司匹林抵抗患者中攜帶G等位基因的頻率，要遠(yuǎn)高于阿司匹林敏感者，用PFA-100測血小板功能時，攜帶G等位基因的患者，有著更短的閉孔時間。COX-2為誘導(dǎo)型酶，生理情況下，在大多數(shù)組織和細(xì)胞中檢測不到，離體情況下，許多刺激物，如生長因子、炎性細(xì)胞因子腫瘤誘導(dǎo)劑等可刺激細(xì)胞的COX-2表達(dá)。COX-2在動脈粥樣斑塊中表達(dá)，阿司匹林劑量需要達(dá)到抑制COX-1劑量的170倍，才能阻斷COX-2，小劑量阿司匹林不能完全抑制COX-2誘導(dǎo)的TXA2生成，也是阿司匹林抵抗的原因之一。COX-2基因啟動子-765G＞C多態(tài)位點(diǎn)研究表明GC雜合基因攜帶者與GG純合基因攜帶者相比較，前者對阿司匹林藥效不敏感的概率是后者的3.872倍。

血小板膜糖蛋白(Glycoprotein IIIa，GPIIIa)是主要的血小板整合素和激活劑，它是一種跨膜的糖蛋白復(fù)合物。其作用是作為受體，介導(dǎo)纖維蛋白原結(jié)合于血小板表面及隨后的血小板聚集。GPIIIa基因編碼的PLA存在多態(tài)性，表現(xiàn)為PLA1/A1和PLA2/A2純合型、PLA1/A2雜合型。超過30％的心血管病患者為PLA2/A2純合型，許多研究證實(shí)PLA2/A2純合型與血小板活性增強(qiáng)有關(guān)，此型患者應(yīng)用阿司匹林之后的抗血小板作用較差，說明此種單核苷酸多態(tài)性可能促成阿司匹林抵抗。迄今已發(fā)現(xiàn)5種GPIIIa的多態(tài)性，較為常見的是外顯子2第1565位氨基酸的突變，即T1565C(Leu33/Pro，rs5918)，分別決定了PLA1和PLA2兩種等位基因，編碼Leu的位點(diǎn)稱為PLA1，編碼蛋白的位點(diǎn)稱為PLA2。

目前，針對基因多態(tài)性檢測的方法有多種，最簡單的方法是PCR-RFLP，但該方法操作復(fù)雜，樣本多時易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染，且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果，可靠性低。DNA測序法雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但步驟繁瑣，過程復(fù)雜，容易出現(xiàn)樣本間的交叉污染而導(dǎo)致測序失敗，另外測序儀價格超出了一般臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的承受范圍。高分辨率溶解曲線法，快速，簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但是受儀器溫度控制，假陽性高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服以上現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明的提供了一組用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的核酸。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒及其檢測方法具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一組用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的核酸，該核酸包括以下的引物對和檢測探針：

COX-1基因A842G野生型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G突變型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

COX-2基因G-765C野生型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C突變型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

GPIIIa基因T1565C野生型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C突變型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括內(nèi)部質(zhì)控，所述內(nèi)部質(zhì)控包括質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括如下陽性對照物：

COX-1基因A842G野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；

COX-1基因A842G突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；

和質(zhì)控陽性對照物：含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

一種用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒用于實(shí)時熒光PCR檢測COX-1基因A842G位點(diǎn)、COX-2基因G-765C位點(diǎn)和GPIIIa基因T1565C位點(diǎn)的野生型和突變型，所述試劑盒包括如上所述的核酸，其中，各檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，或/和質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針的淬滅基團(tuán)。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、礦物油、陰性對照物：水。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

一種檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取DNA；

(2)對提取的所述DNA，同時進(jìn)行COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型體系和突變型體系的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增；其中，在COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型體系中含如上各基因的野生型引物對和對應(yīng)的檢測探針；在COX-1、COX-2和GPIIIa基因的反突變型體系中含如上各基因所述突變型引物對和對應(yīng)的檢測探針，各檢測探針的5＇端連接有熒光基團(tuán)，3＇端連接有淬滅基團(tuán)；

(3)收集熒光信號，選擇對應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；

(4)結(jié)果判定：待測樣品的所述COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的熒光信號，達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值ΔCt值來確定樣本中含COX-1、COX-2和GPIIIa基因的基因型。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，COX-1、COX-2和GPIIIa基因的所述野生型體系和所述突變型體系中均還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述探針的淬滅基團(tuán)。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在所述野生型體系和所述突變型體系中，各條引物和探針的終濃度為100-1000nmol/L；所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個循環(huán)；

第三階段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；

第三階段:30個循環(huán)中72℃時，收集熒光信號。

如上所述的方法，優(yōu)選地，所述檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質(zhì)控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1；

步驟(4)中，所述確定樣本DNA的各基因型，各基因?qū)?yīng)的野生型反應(yīng)體系與突變型反應(yīng)體系的Ct值按照如下計算確定樣本類型：

ΔCt＝|野生型Ct值-突變型Ct值|≤2.5為雜合型樣本；

ΔCt＝野生型Ct值-突變型Ct值>2.5為突變型樣本；

ΔCt＝突變型Ct值-野生型Ct值>2.5為野生型樣本。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，還設(shè)有陽性對照和陰性對照，所述陽性對照是分別將含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列的COX-1基因A842G野生型陽性對照物；含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列的COX-1基因A842G突變型陽性對照物；含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列的COX-2基因G-765C野生型陽性對照物；含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列的COX-2基因G-765C突變型陽性對照物；含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列的GPIIIa基因T1565C野生型陽性對照物；含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列的GPIIIa基因T1565C突變型陽性對照物為模板，加入各自基因?qū)?yīng)的反應(yīng)體系中進(jìn)行檢測；同時在該各自基因?qū)?yīng)的反應(yīng)體系均加入含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列的質(zhì)控陽性對照物；進(jìn)行所述野生型體系和突變型體系的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增；所述陰性對照為以無核酸酶水為模板，進(jìn)行各自基因的所述野生型體系和突變型體系的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增；

在步驟(4)中，所述陽性對照的野生型體系和突變型體系的FAM均有明顯的擴(kuò)增曲線，JOE有明顯的擴(kuò)增曲線且JOE信號的Ct值小于25，符合要求，檢測結(jié)果可靠；所述陰性對照的野生型體系和突變型體系的FAM都沒有明顯的擴(kuò)增曲線，符合要求，檢測結(jié)果可靠，否則應(yīng)重新配置檢測體系，重新進(jìn)行檢測。

本發(fā)明提供了一組用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的核酸及試劑盒，同時建立具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡單的檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的檢測方法，其檢測結(jié)果為阿司匹林抵抗提供指導(dǎo)性意義。

本發(fā)明提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷、通過直接探測PCR過程中熒光信號值的獲得檢測的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的易污染、出現(xiàn)假陽性，能有效避免非特異性擴(kuò)增難題，并且適合大批量樣本的檢測。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒及方法，用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性時，為了避免漏檢、及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，為了判斷檢測體系是否正常，還設(shè)有陰性對照和檢測引物的陽性對照；為了避免假陰性及漏檢，設(shè)有陽性對照，其陽性對照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢；為了避免假陽性及漏檢，設(shè)有陰性對照，其陰性對照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果及漏檢；檢測試劑盒及方法設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，有效避免漏檢、錯檢的可能。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明運(yùn)用ARMS引物分野生型和突變型基因，有如下有益效果和顯著進(jìn)步：

(1)靈敏度高，可以準(zhǔn)確檢出低至0.01ng/μL的基因組DNA，檢測結(jié)果可信，且對于保存時間過長以及口腔拭子這些提取濃度很低的樣本能準(zhǔn)確檢出。

(2)特異性強(qiáng)，對于高至500ng的基因組DNA樣本也能夠準(zhǔn)確檢出。因此，可以減少稀釋樣本的過程，提取出的樣本直接上母液都能準(zhǔn)確檢測而不會出現(xiàn)結(jié)果誤判。

(3)適用于多種樣本類型：本發(fā)明不僅能檢測常規(guī)的EDTA抗凝的全血細(xì)胞DNA，還能檢測提取質(zhì)量差的口腔拭子，還可以直接檢測全血細(xì)胞裂解紅細(xì)胞后的白細(xì)胞，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高。

(4)成本低，ARMS分型法相對Taqman探針分型法，不僅能保留Taqman的高靈敏度和高特異性，而且還能節(jié)約成本，ARMS引物合成快速簡單，合成成本低，擴(kuò)增效果更佳。

(5)檢測速度快，整個檢測過程只需要90分鐘。

(6)應(yīng)用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的Fast master Premix預(yù)混在反應(yīng)體系中，制備成可直接加入樣品檢測的試劑盒，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，操作更簡單，一步加樣，避免了氣溶膠污染引起的假陽性。

(7)安全：整個試劑盒不包含有毒有害物質(zhì)，對操作人員和環(huán)境無危害。

本發(fā)明涉及的COX-1、COX-2和GPIIIA基因多態(tài)性檢測試劑盒適用于臨床多種樣本類型檢測，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡單，安全無毒，成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒檢測樣本XY04中COX-1基因的擴(kuò)增曲線。

圖2為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒檢測樣本XY04中COX-2基因的擴(kuò)增曲線。

圖3為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒檢測樣本XY04中GPIIIa基因的擴(kuò)增曲線。

圖4為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒檢測樣本KQ07中COX-1基因的擴(kuò)增曲線。

圖5為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒檢測樣本KQ07中COX-2基因的擴(kuò)增曲線。

圖6為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒檢測樣本KQ07中GPIIIa基因的擴(kuò)增曲線。

圖7為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒靈敏度的擴(kuò)增曲線。

圖8為本發(fā)明一優(yōu)選試劑盒特異性的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，并非對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1引物、探針、驗(yàn)證模板設(shè)計

本發(fā)明的具體原理是：針對不同基因位點(diǎn)分別設(shè)計野生型和突變型ARMS引物和Taqman-MGB探針，結(jié)合熒光定量PCR反應(yīng)，對從人外周血細(xì)胞或口腔拭子中提取的基因組DNA進(jìn)行檢測，可以一次性在一條6聯(lián)PCR反應(yīng)條上實(shí)現(xiàn)對環(huán)氧化酶1(COX-1)基因A842G、環(huán)氧化酶2(COX-2)基因G-765C和血小板膜糖蛋白(GPIIIa)基因T1565C的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，通過實(shí)時熒光PCR儀上收集信號，計算野生型和突變型的ΔCt值來確定樣本DNA的基因型。

分別針對人類COX-1基因A842G位點(diǎn)、COX-2基因G-765C位點(diǎn)、GPIIIa基因T1565C位點(diǎn)設(shè)計各基因?qū)?yīng)的野生型上游引物、突變型上游引物、公用下游引物和公用檢測探針，通過多次試驗(yàn)、優(yōu)化、最后獲得的引物及檢測探針如下，核苷酸序列具體見表1：

COX-1基因A842G野生型ARMS引物：上游引物(AC1-FW)SEQ ID NO.1和下游引物(AC1-R)SEQ ID NO.3；

COX-1基因A842G突變型ARMS引物：上游引物(AC1-FM)SEQ ID NO.2，和下游引物SEQ ID NO.3；

COX-1基因A842G公用檢測探針(AC1-P)：SEQ ID NO:4；

COX-2基因G-765C野生型ARMS引物：上游引物(AC2-FW)SEQ ID NO.5，下游引物(AC2-R)SEQ ID NO.7；

COX-2基因G-765C突變型ARMS引物：上游引物(AC2-FM)SEQ ID NO.6，下游引物SEQ ID NO.7；

COX-2基因G-765C公用檢測探針(AC2-P)：SEQ ID NO:8；

GPIIIa基因T1565C野生型ARMS引物：上游引物(AGP-FW)SEQ ID NO.9，下游引物(AGP-R)SEQ ID NO.11；

GPIIIa基因T1565C突變型ARMS引物：上游引物(AGP-FM)SEQ ID NO.10，下游引物SEQ ID NO.11；

GPIIIa基因T1565C探針(AGP-P)：SEQ ID NO.12。

其中，COX-1基因A842G野生型引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為84bp，突變型引物擴(kuò)增片段長度為84bp。擴(kuò)增產(chǎn)物可作為陽性對照，即COX-1基因A842G野生型陽性對照物含SEQ ID No.16所示的核苷酸序列、COX-1基因A842G突變型陽性對照物含SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。

COX-2基因G-765C野生型引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為73bp，突變型引物擴(kuò)增片段長度為74bp。擴(kuò)增產(chǎn)物可作為陽性對照，即COX-2基因G-765C野生型陽性對照物含SEQ ID No.18所示的核苷酸序列、COX-2基因G-765C突變型陽性對照物含SEQ ID No.19所示的核苷酸序列。

GPIIIa基因T1565C野生型引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為81bp，突變型引物擴(kuò)增片段長度為79bp。擴(kuò)增產(chǎn)物可作為陽性對照，即GPIIIa基因T1565C野生型陽性對照物含SEQ ID No.20所示的核苷酸序列、GPIIIa基因T1565C突變型陽性對照物含SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；核苷酸序列具體見表1中所示。

進(jìn)一步，為了對實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)操作過程進(jìn)行質(zhì)控，同時檢測樣本的質(zhì)量，避免漏檢，本發(fā)明設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，選用IL6基因作為內(nèi)參基因，堿基序列為NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列編號為NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列編號為NT_007819.18第3147到3447位。針對這段序列設(shè)計的內(nèi)部控制引物和內(nèi)控探針，并對內(nèi)控的上下游引物進(jìn)行篩選，使非模版體系(NTC)沒有明顯的擴(kuò)增曲線(不起線)，樣本由明顯的擴(kuò)增曲線(起線)正常。并對上述的三對基因的引物對、探針及各自擴(kuò)增產(chǎn)物均不能產(chǎn)生交叉反應(yīng)，通過對內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實(shí)時熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，最后確定，質(zhì)控引物對(IL6-F、IL6-R)核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示，質(zhì)控探針(IL6-P)的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，具體見表1。

作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，其擴(kuò)增序列的大小為87bp，將該擴(kuò)增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對照物，即包含如SEQ ID No.22所示序列，作為驗(yàn)證是否漏檢的陽性對照。

表1本申請中引物探針及陽性對照物的序列

實(shí)施例2采用實(shí)時熒光PCR檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的方法

將實(shí)施例1篩選設(shè)計各基因的野生型上游引物、突變型上游引物、公用下游引物和公用檢測探針進(jìn)行合成，在檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，其中，熒光基團(tuán)可為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，淬滅基團(tuán)可為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

采用實(shí)時熒光PCR檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的方法。具體步驟如下：

(1)獲得待測樣品的DNA；

(2)應(yīng)用設(shè)計的檢測引物及檢測探針，對待測樣本的DNA中對COX-1、COX-2和GPIIIa基因的A842G、G-765C、T1565C位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增檢測，采用COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系，均用40μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系中組分如下：

10×PCR緩沖液：5～10μL

MgCl₂：2.0～5.0mmol

dNTP：0.2～0.8mmol

各條引物：0.1～1.0μmol

各條探針：0.1～1.0μmol

Fast master premix：5～10μL

樣品DNA模板：10μL

其余用超純水補(bǔ)足總體積：40μL。

實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)選為：

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個循環(huán)；

第三階段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；

第三階段:30個循環(huán)中，72℃時收集熒光信號。

(3)收集熒光信號，選擇對應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；

(4)結(jié)果判定：待測樣品的所述COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的熒光信號，達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值ΔCt值來確定樣本中含COX-1、COX-2和GPIIIa基因的基因型。

將各基因位點(diǎn)的野生型陽性對照物和突變型陽性對照物分別進(jìn)行上述各基因野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示，所設(shè)計的各基因檢測引物及反應(yīng)體系可有效擴(kuò)增出其對應(yīng)基因的野生型和突變型。

經(jīng)過多次樣品的檢測，最后確定可根據(jù)如下判斷樣本的各基因的類型：ΔCt＝|野生型Ct值-突變型Ct值|≤2.5為雜合型樣本；

ΔCt＝野生型Ct值-突變型Ct值>2.5為突變型樣本；

ΔCt＝突變型Ct值-野生型Ct值>2.5為野生型樣本。

對樣品進(jìn)行檢測時，為避免漏檢，如避免有的反應(yīng)體系中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個反應(yīng)體系中均設(shè)置有內(nèi)部質(zhì)控，即將質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針都加入上述各反應(yīng)體系中，其質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針具體序列如實(shí)施例1中所述。應(yīng)當(dāng)注意的是公用檢測探針與質(zhì)控探針熒光基團(tuán)標(biāo)記為不同檢測模式的熒光基團(tuán)。具體的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成按上述PCR反應(yīng)液組分配置。對于人血液樣品或咽拭子樣品的DNA檢測時，質(zhì)控探針的信號應(yīng)有明顯的擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果可靠，如果沒有明顯的擴(kuò)增曲線，說明檢加提取的檢測樣品，

在探針合成時，探針與熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相連，檢測探針的熒光-淬滅基團(tuán)為優(yōu)選為FAM-MGB，質(zhì)控探針的熒光-淬滅基團(tuán)優(yōu)選為JOE-BHQ1，當(dāng)然，其它熒光-淬滅基團(tuán)組合也同樣適用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，檢測時選擇相應(yīng)的熒光檢測模式。

本發(fā)明建立的方法中可用于每個反應(yīng)體系檢測單個檢測一種基因，即當(dāng)三種檢測探針都標(biāo)記為FAM-MGB時，應(yīng)分別配置各個基因的反應(yīng)體系，即COX-1基因A842G野生型反應(yīng)體系中對應(yīng)有COX-1基因A842G野生型引物對和COX-1基因A842G檢測探針，COX-1基因A842G突變型反應(yīng)體系中對應(yīng)有COX-1基因A842G突變型引物對和COX-1基因A842G檢測探針，其他兩組基因以此類推。

本發(fā)明建立的方法中可用于每個反應(yīng)體系檢測同時檢測三種基因，但是這三種基因的檢測探針標(biāo)記均不同的熒光基因與淬滅基團(tuán)，即COX-1基因A842G檢測探針、COX-2基因G-765C檢測探針、GPIIIa基因T1565C檢測探針應(yīng)分別標(biāo)記FAM-MGB、CY3-BHQ2、HEX-TAMRA，配置反應(yīng)體系時，應(yīng)將野生型反應(yīng)體系中可同時加入三種基因的野生型引物和三種基因的檢測探針，在突變型反應(yīng)體系中同時加入三種基因的突變型引物和三種基因的檢測探針，檢測時，根據(jù)熒光信號的不同來判斷各自基因的基因型，這種檢測方法加樣簡單，配置反應(yīng)體系只需配置2中體系野生型和突變性即可，加樣品時，只要將樣本分別加入這兩個體系即可進(jìn)行檢測。

為了避免假陰性及漏檢，檢測方法中還設(shè)有野生型反應(yīng)體系、突變性反應(yīng)體系和內(nèi)部質(zhì)控的陽性對照(STD)，其陽性對照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢；為了避免假陽性及漏檢，設(shè)有檢測引物和內(nèi)部質(zhì)控的陰性對照(NTC)，其陰性對照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果及漏檢；否則，應(yīng)重新進(jìn)行反應(yīng)體系的配置及檢測。陽性對照(STD)FAM信號Ct值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否有效的判定標(biāo)準(zhǔn)。

上述實(shí)時熒光PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時PCR系統(tǒng)(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

實(shí)施例3用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的試劑盒

用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的實(shí)時熒光PCR試劑盒包括以下成分：

COX-1基因A842G野生型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G突變型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

COX-2基因G-765C野生型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C突變型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.6，下游引物SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

GPIIIa基因T1565C野生型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C突變型引物對：核苷酸序列如SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

各自的檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

COX-1基因A842G野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；

COX-1基因A842G突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列。

為了避免漏檢，錯檢，還包括：作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針和質(zhì)控陽性對照物，

其中，質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于檢測探針的淬滅基團(tuán)，質(zhì)控陽性對照物含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

為了防止反應(yīng)體系在PCR擴(kuò)增過程中揮發(fā)，影響檢測效果，試劑盒還包括有礦物油。

為了便于反應(yīng)體系的配置，試劑盒還包括10×PCR緩沖液；DNA聚合酶，陰性對照物：超純水。其中DNA聚合酶可采用Fast master premix，采用ABI(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應(yīng)用市場上其他公司的PCR緩沖液與DNA聚合酶。

實(shí)施例4快速檢測試劑盒的制備

本實(shí)施例的試劑盒是在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，制備成可以直接加入檢測樣品后，進(jìn)行檢測的試劑盒。該試劑盒有檢測COX-1、COX-2、GPIIIa基因各自野生型和突變型體系的8聯(lián)PCR反應(yīng)條以及驗(yàn)證試劑盒性能分析時所需COX-1、COX-2、GPIIIa三個基因的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒及內(nèi)控質(zhì)粒，各成分如表2所示，具體反應(yīng)體系的配置見表3。其中，各基因的檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，則檢測樣本信號類型為FAM信號；內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控探針5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1，內(nèi)部質(zhì)控信號類型為JOE信號(內(nèi)控作為對試劑盒、DNA質(zhì)量以及操作本身的質(zhì)控)；檢測引物、探針可陽性對照物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表2試劑盒組成

表3反應(yīng)體系的配置

最后配置的各反應(yīng)體系進(jìn)行存放時，防止試劑盒放置時或進(jìn)行PCR擴(kuò)展時，反應(yīng)體系液體的揮發(fā)，在各反應(yīng)體系中均加入20μL礦物油，冷凍保存。

其中，AB premix全稱為Fast master premix，購自ABI(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，經(jīng)過大量試驗(yàn)、驗(yàn)證該試劑盒為一種高靈敏、高特異性、高效的檢測的檢測試劑盒。

實(shí)施例5：實(shí)時熒光PCR法擴(kuò)增臨床樣本DNA

一、臨床樣本DNA的提取

(1)、EDTA抗凝血樣品

本實(shí)施例是從EDTA抗凝血樣品(來自武漢大學(xué)中南醫(yī)院)中提取基因組DNA，并對其進(jìn)行定量，作為PCR檢測的模板。采用天根的血液基因組DNA提取試劑盒，具體操作見該DNA提取試劑盒說明書，最后，將提取的EDTA抗凝血樣品DNA用紫外分光光度計進(jìn)行定量，稀釋DNA濃度到1ng/μL。

(2)、口腔拭子樣本

本實(shí)施例是從口腔拭子(來自武漢大學(xué)中南醫(yī)院)中提取基因組DNA，并對其進(jìn)行定量，作為PCR檢測的模板。采用康為世紀(jì)的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，具體操作詳該DNA提取試劑盒說明書，最后，將提取的口腔拭子DNA用紫外分光光度計進(jìn)行定量，稀釋DNA濃度到1ng/μL。

二、檢測

本實(shí)施例為采用實(shí)施例4制備的試劑盒、上述方法提取的DNA樣品，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增。

檢測方法如下：

1)每次PCR反應(yīng)中，同時進(jìn)行非模板對照(No Template Control；NTC)、陽性對照和待測樣本的檢測，具體見實(shí)施例3中所述；

2)將陽性對照物取出解凍后震蕩混勻，并離心30s；

3)將實(shí)施例4制備的8聯(lián)PCR反應(yīng)條取出解凍后離心30s，防止反應(yīng)液在開蓋時濺出；

4)將ddH₂O(NTC)、實(shí)施例6中提取的DNA樣本、陽性對照物分別加入8聯(lián)PCR反應(yīng)條，每孔10μL；

5)將以上8聯(lián)PCR反應(yīng)條蓋好管蓋于離心機(jī)上離心30S，確保管壁上不沾有液滴；

6)將8聯(lián)PCR反應(yīng)條放于實(shí)時熒光PCR儀器中，按如下程序設(shè)定：

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個循環(huán)；

第三階段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；

第三階段:30個循環(huán)時，收集FAM和JOE信號。

本發(fā)明是利用ARMS引物區(qū)分野生型和突變型基因序列，通過反應(yīng)體系的突變型和野生型FAM信號的熒光強(qiáng)度差異來判斷檢測結(jié)果；JOE是內(nèi)控信號，用于檢測體系是否正常，樣本是否漏加及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，JOE信號應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct值小于25)；FAM是檢測信號，用于檢測樣本的基因多態(tài)性；在內(nèi)控信號達(dá)到要求后，以每個SNP位點(diǎn)的突變型和野生型FAM信號達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇1、2號管，根據(jù)FAM信號ΔCt值判斷檢測樣本COX-1 842的基因A842G位點(diǎn)的多態(tài)性；選擇3、4號管，根據(jù)FAM信號ΔCt值判斷檢測樣本COX-2-765的基因G-765C位點(diǎn)的多態(tài)性；選擇5、6號管，根據(jù)野生型和突變型FAM信號ΔCt值判斷檢測樣本GPIIIA1565的基因T1565C位點(diǎn)的多態(tài)性。判斷標(biāo)準(zhǔn)是ΔCt＝|野生型Ct值-突變型Ct值|≤2.5為雜合型樣本，ΔCt＝野生型Ct值-突變型Ct值>2.5為突變型樣本，ΔCt＝突變型Ct值-野生型Ct值>2.5為野生型樣本，樣本結(jié)果判定具體見表4。

表4各基因多態(tài)性檢測結(jié)果判定

對來自武漢大學(xué)中南醫(yī)院10人(一個人同時取血液和口腔兩種不同類型的樣本)的10個EDTA抗凝血樣品(編號為XY01-XY10)和10個口腔拭子(編號為KQ01-KQ10)的檢測結(jié)果見表5，其中，例舉兩個樣本各基因多態(tài)性的擴(kuò)增圖作為代表，EDTA抗凝的全血提取的基因組DNA樣本(編號XY04)的擴(kuò)增曲線，如圖1為COX-1基因A842G位點(diǎn)為AA即純野生型；如圖2為COX-2基因G-765C位點(diǎn)為GC即雜合型；如圖3為GPIIIa基因T1565C位點(diǎn)為TT及純野生型；口腔拭子提取的基因組DNA樣本(編號KQ 07)的擴(kuò)增曲線，如圖4為COX-1基因A842G位點(diǎn)為AA即雜合型；如圖5為COX-2基因G-765C位點(diǎn)為GG即純野生型；如圖6為GPIIIa基因T1565C位點(diǎn)為TC即雜合型。

表5樣本檢測結(jié)果

同時對上述這些樣本的DNA進(jìn)行測序，由武漢艾康健測序公司(采用Sanger金標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行測序檢測，并將兩者的檢測能力進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。

表6本發(fā)明檢測結(jié)果和Sanger測序金標(biāo)準(zhǔn)比較

表6的結(jié)果說明：EDTA抗凝血提取的基因組DNA和口腔拭子提取的基因組DNA用本發(fā)明的試劑盒檢測的結(jié)果和Sanger測序的結(jié)果完全一致，說明本發(fā)明的試劑盒和檢測方法準(zhǔn)確度高，適應(yīng)樣本廣。

實(shí)施例6：對實(shí)施例4中制備的試劑盒和實(shí)施例5檢測的陽性基因組DNA進(jìn)行靈敏度和特異性實(shí)驗(yàn)

1.靈敏度實(shí)驗(yàn)

對實(shí)施例4中制備的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，把實(shí)施例5提取的基因組DNA作為模板，分別進(jìn)行3種濃度梯度為1ng/μL(10ng/反應(yīng))、0.1ng/μL(1ng/反應(yīng))和0.01ng/μL(0.1ng/反應(yīng))在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，三種不同濃度的基因組DNA作為模板的進(jìn)行6個反應(yīng)體系的檢測，檢測結(jié)果顯示，均能準(zhǔn)確檢出0.01ng/μL的基因組DNA(結(jié)果擴(kuò)增圖如圖7所示，僅例出一個反應(yīng)體系的擴(kuò)增圖，其他反應(yīng)體系的擴(kuò)增圖在此不在贅述)。因此，本試劑盒可以準(zhǔn)確檢出低至0.01ng/μL的基因組DNA，且對于保存時間過長以及口腔拭子這些提取濃度很低的樣本能準(zhǔn)確檢出。

2.特異性實(shí)驗(yàn)

對實(shí)施例4中制備的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，把實(shí)施例5提取的陽性基因組DNA作為模板，分別進(jìn)行3種濃度為50ng/μL(500ng/反應(yīng))、10ng/μL(100ng/反應(yīng))和1ng/μL(10ng/反應(yīng))在熒光定量PCR儀上進(jìn)行6個反應(yīng)系統(tǒng)的檢測，結(jié)果顯示，三種不同濃度的基因組DNA作為模板的檢測，均能準(zhǔn)確檢出(結(jié)果擴(kuò)增圖如圖8所示，僅例出一個反應(yīng)體系的擴(kuò)增圖，其他反應(yīng)體系的擴(kuò)增圖在此不在贅述)，說明當(dāng)模板量為500ng時，檢測結(jié)果不會受過高濃度而影響結(jié)果的判讀。因此，對于高至500ng的基因組DNA樣本也能夠準(zhǔn)確檢出。因此，可以減少稀釋樣本的過程，提取出的樣本直接上母液都能準(zhǔn)確檢測而不會出現(xiàn)結(jié)果誤判。

以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> 用于檢測COX-1、COX-2和GPIIIa基因多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aactgagcac ctactacacg ctgca 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aactgagcac ctactacatg caggg 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcccagaggg tggttgtaag at 22

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttgtgtgcat tccctc 16

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggagaatt taccgttccc g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgaggagaat ttacctgtcc cc 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaaatactgt tctccgtacc ttcacc 26

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctctctttcc aagaaac 17

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ctgtcttaca ggacctgcca ct 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gtcttacagt ccctgccttc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

attctggggc acagttatcc t 21

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acctcgctgt gacctg 16

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acatgccagc cccacact 18

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gagatcaaga gaggccagac aaa 23

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

agccaagttg ctgcttcctc cctgtg 26

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aactgagcac ctactacatg ctggacactg caccaggaga tttgtgtgca ttccctcatt 60

gaatcttaca accaccctct ggga 84

<210> 17

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

aactgagcac ctactacatg ctgggcactg caccaggaga tttgtgtgca ttccctcatt 60

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<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

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<211> 74

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

tgaggagaat ttacctttcc cccctctctt tccaagaaac aaggaggggg tgaaggtacg 60

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<210> 20

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ctgtcttaca ggccctgcct ctgggctcac ctcgctgtga cctgaaggag aatctgctga 60

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<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

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<210> 22

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

acatgccagc cccacactgg tggcatagga agccaagttg ctgcttcctc cctgtgcact 60

cccatttgtc tggcctctct tgatctc 87