本發(fā)明涉及蔬菜加工與食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法。

背景技術(shù)：

榨菜是中國特產(chǎn)，屬于世界三大醬菜之一。榨菜在中國的種植面積廣，產(chǎn)量高，是主要的腌制加工蔬菜之一。傳統(tǒng)的榨菜鹽漬多采用高鹽濃度、自然發(fā)酵為主。傳統(tǒng)的自然發(fā)酵存在耗工耗時(shí)、發(fā)酵周期長、雜菌易污染、產(chǎn)品風(fēng)味不純、食用安全性差等一系列應(yīng)用上的弊端。榨菜鹽漬的現(xiàn)代化，是以制作過程的可控性以及標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及周年穩(wěn)定均衡生產(chǎn)為代表的一種生產(chǎn)技術(shù)模式，其中采用純菌接種就是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)，即通過人工分離鹽漬蔬菜鹵水中的腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、乳酸乳桿菌等主要菌種，經(jīng)凍干、復(fù)配后制作成直投式發(fā)酵劑用于榨菜鹽漬。由于直投式發(fā)酵劑具有活菌含量高(10⁹～10¹²cfu/g)、安全性好、保質(zhì)期長、使用方便、避免菌種退化等特點(diǎn)，且利于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)以及能有效抑制雜菌、縮短發(fā)酵周期、降低亞硝酸鹽含量等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了榨菜鹽漬自然發(fā)酵的諸多不足，可以解決上述弊端，在傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

榨菜的鹽漬過程是微生物的發(fā)酵過程。正是利用微生物的發(fā)酵原理，榨菜在自然發(fā)酵過程中，豐富的微生物菌群對榨菜制品的保藏和形成各自獨(dú)特的風(fēng)味起到很大的作用，榨菜鹽漬過程中乳酸菌代謝產(chǎn)生的高濃度礦物質(zhì)、乳酸和生物活性物質(zhì)是構(gòu)成泡菜獨(dú)特風(fēng)味的重要原因。乳酸發(fā)酵是榨菜鹽漬過程中各種發(fā)酵作用種的最主要的發(fā)酵作用。主要的乳酸菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、明串株菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬。在一定程度上，鹽漬榨菜的品質(zhì)和風(fēng)味很多程度上是由發(fā)酵過程中的乳酸菌菌群決定的。

但由于一些菌群的不可培養(yǎng)性或較差重復(fù)性，導(dǎo)致傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方式難以全面、客觀地反映榨菜鹽漬過程中的菌群結(jié)構(gòu)和變化，因此目前根據(jù)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)所制得的發(fā)酵劑生產(chǎn)的榨菜難以真正反映其風(fēng)味與品質(zhì)，出現(xiàn)了風(fēng)味單一、發(fā)酵味不醇厚等問題。另外，傳統(tǒng)微生物種類鑒定的方法一般采用表型特征鑒定，但此法存在操作步驟繁瑣、工作量大、周期長、某些檢測結(jié)果不穩(wěn)定等問題。因此，根據(jù)不同蔬菜的發(fā)酵特性，尋找更為優(yōu)良、有效的發(fā)酵劑制備方法對于傳統(tǒng)蔬菜加工方式意義重大。

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的微生物鑒定方法常常難以鑒定眾多的生長習(xí)性復(fù)雜的微生物，因而基于基因組序列的分子鑒定受到廣泛關(guān)注。在細(xì)菌基因組中，編碼16S rRNA的rDNA基因具有良好的進(jìn)化保守性，適宜分析的長度(約為1540bp)，以及與進(jìn)化距離相匹配的良好變異性，所以成為細(xì)菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)序列。16S rDNA序列分析的一個(gè)顯著特點(diǎn)是能及時(shí)鑒定出生長緩慢或生化反應(yīng)惰性的細(xì)菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對傳統(tǒng)直投發(fā)酵劑存在發(fā)酵制品風(fēng)味單一、發(fā)酵風(fēng)味不醇厚等問題，提出了一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，該方法可定向篩選出主導(dǎo)榨菜鹽漬及榨菜風(fēng)味、品質(zhì)的不同乳酸菌屬，特異性和目標(biāo)導(dǎo)向性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，不必反復(fù)純化。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案：

一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，至少包括以下步驟：

(1)于榨菜鹽漬池中取樣，樣品置于無菌冷凍管中，立即放入液氮中保存，然后置于超低溫冰箱中，

(2)提取樣品DNA并做瓊脂糖凝膠電泳檢測后做PCR，擴(kuò)增16S rDNA，所述的PCR擴(kuò)增的特異性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)，特異性引物的下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)，PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槲⑸?6S rDNA的V4-V5可變區(qū)域，測序前需對所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，

(3)將步驟(2)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序并做比對分析，確定優(yōu)勢菌群種類與組成比例，

(4)優(yōu)勢菌株的定向篩選，

(5)定向篩選菌株的高密度增殖培養(yǎng)，

(6)離心并冷凍干燥，

將步驟(5)經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液加入脫脂奶粉，搖勻后離心，去除上清培養(yǎng)液，收集試管底部菌體；收集的菌體加入凍干保護(hù)劑后做冷凍干燥，其中：菌體與凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:3-1:2.5，

(7)將步驟(6)得到的各定向篩選和高密度增值培養(yǎng)的菌株冷凍干燥粉按照16S rDNA測序確定的優(yōu)勢菌群種類與組成比例混合，制得榨菜專用直投式發(fā)酵劑。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(1)中取樣采用3點(diǎn)取樣法，采集點(diǎn)分別位于鹽漬池中心、鹽漬池對角線兩點(diǎn)，每處采集3次樣品，采集后混勻。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(4)優(yōu)勢菌株的定向篩選按如下操作：在所述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在定向培養(yǎng)基上，然后在35～37℃恒溫箱中定向培養(yǎng)36～72h，觀察菌落；然后將定向培養(yǎng)的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定實(shí)驗(yàn)；根據(jù)鑒定結(jié)果，將定向篩選后的菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(5)定向篩選菌株的高密度增殖培養(yǎng)按如下步驟操作：將上述步驟(4)定向篩選與純化培養(yǎng)的菌株進(jìn)行高密度增值培養(yǎng)，高密度增值培養(yǎng)基為MRS瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h；所述的MRS瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克、硫酸錳0.05克、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升，加熱溶解后，校正pH＝6.2～7.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(6)中將步驟(5)經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液，加入2.7～3.5％經(jīng)高溫滅菌的脫脂奶粉，搖勻后以4000-5000rpm轉(zhuǎn)速于-5～10℃條件下離心25-30分鐘。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(6)中凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳25-30克、乳糖10-15克、葡糖糖5-12克、維生素C5-6.5克、D-山梨醇5-7.2克、L-谷氨酸5-6克和蒸餾水250mL；凍干保護(hù)劑加熱溶解后，121℃高壓滅菌15-20分鐘后備用。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(6)中冷凍干燥的主要工藝參數(shù)為：-50～-70℃預(yù)凍12-24h后，-60～80℃凍干24-72h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)與采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)制備的傳統(tǒng)發(fā)酵劑相比，本發(fā)明通過高通量測序鑒定微生物菌群的16SrDNA，能準(zhǔn)確的獲得榨菜自然發(fā)酵后詳細(xì)微生物群落結(jié)構(gòu)與組成比例，并確定主要的乳酸菌菌群，從而準(zhǔn)確的判斷不同微生物菌群對榨菜自然發(fā)酵進(jìn)程與制品品質(zhì)的影響。所使用的目標(biāo)菌種具有多樣性、特異性，避免了傳統(tǒng)發(fā)酵劑菌種單一、菌群良莠不齊、非特異性等缺點(diǎn)。

(2)本發(fā)明定向制備獲得的榨菜專用發(fā)酵劑具有特異性與目標(biāo)導(dǎo)向性特征。根據(jù)不同地方榨菜加工的不同工藝及品質(zhì)、風(fēng)味需求，通過配比菌種構(gòu)成提高發(fā)酵效率，產(chǎn)物穩(wěn)定、亞硝酸鹽含量顯著降低(圖3和圖4)，避免了傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵過程中所導(dǎo)致的發(fā)酵風(fēng)味不純的缺點(diǎn)。

(3)與傳統(tǒng)篩選方法制備的發(fā)酵劑相比，一種基于16S rDNA測序定向制備榨菜專用直投式發(fā)酵劑的方法在發(fā)酵劑制備過程中，菌種專一性強(qiáng)、活性高，所制得的發(fā)酵劑干粉易于儲(chǔ)藏與運(yùn)輸。

附圖說明

圖1榨菜樣品16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。

圖2榨菜中細(xì)菌在不同分類水平的分布。

圖3自然發(fā)酵榨菜中亞硝酸鹽含量柱形圖。

圖4本發(fā)明榨菜專用發(fā)酵劑的榨菜中亞硝酸鹽含量柱形圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。

實(shí)施例1

一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

(1)于榨菜鹽漬池中取樣，采用3點(diǎn)取樣法，采集點(diǎn)分別位于鹽漬池中心、鹽漬池對角線兩點(diǎn)，每處采集3次樣品。采集后混勻，置于15ml的無菌冷凍管中，立即放入液氮中保存，然后置于-70℃超低溫冰箱中。

(2)將步驟(1)采集的樣品用DNA提取試劑盒提取微生物的脫氧核糖核酸(英文縮寫DNA)，所有樣品的DNA提取步驟均參照DNA提取試劑盒說明書。對提取到的樣品基因組DNA進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)(3)將步驟(2)提取的DNA用特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增微生物的16SrDNA，特異性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)、下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(即PCR)擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槲⑸?6S rDNA的V4-V5可變區(qū)域，測序前對所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

(4)將步驟(3)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序。篩選測序所得數(shù)據(jù)并與已有數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行序列比對，獲得菌群的可操作分類單元(OTUs)；且與現(xiàn)有16S V4-V5數(shù)據(jù)庫比對。根據(jù)標(biāo)簽序列和reads，榨菜腌漬后乳桿菌屬(Lactobacillus)占有比例為72.7％，分別為：食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、Lactobacillus versmoldensis(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，比例分別為：22.7％、37％、8％、2.6％、2.4％(圖2)。

(5)食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、Lactobacillus versmoldensis、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的定向篩選：

(5.1)食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在MRS培養(yǎng)基，然后在35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h，觀察菌落。挑選出呈乳白色、不透明、圓形光滑的單菌落，進(jìn)行斜面培養(yǎng)48～72h；接入液體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48～60h。MRS瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克；硫酸錳0.05克、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正pH為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.2)Lactobacillus versmoldensis的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在MRS培養(yǎng)基，然后在36～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h，觀察菌落。挑選出呈乳白色、不透明、圓形光滑的單菌落，進(jìn)行斜面培養(yǎng)48～72h；接入液體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72h。MRS瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克；硫酸錳0.05克、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正pH為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將活化后的菌株，按3％接種量接種于膽鹽質(zhì)量濃度分別為0、0.3、0.6g/l的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)16h。然后篩選進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.3)腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的定向篩選：取步驟(1)中1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在YGPB培養(yǎng)基上，然后挑取典型菌落于YGPB培養(yǎng)基上平板上劃線，并置于25℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)2～3天，觀察菌落生長狀況。YGPB培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉浸膏8g、酵母浸膏3g、NaCl 5g、磷酸二氫鉀2.5g、磷酸氫二鉀2.5g、硫酸鎂0.2克；硫酸錳0.05克、pH6.8，瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正pH為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.4)植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在定向MRS培養(yǎng)基上，于35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h，觀察菌落，挑選出有溶鈣圈、呈乳白色、不透明、圓形光滑的單菌落，在MRS平板上劃線培養(yǎng)48～72h；斜面培養(yǎng)后，接入液體培養(yǎng)MRS培養(yǎng)48～72h。MRS瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克；硫酸錳0.05克、1％碳酸鈣、0.05‰的納他霉素、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正pH為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.5)短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在MRS改良培養(yǎng)基，然后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，觀察菌落，挑選出呈乳白色、不透明、圓形光滑的單菌落，在MRS改良培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48h。斜面培養(yǎng)后，接入液體MRS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h。MRS改良培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g和蒸餾水1000ml。溶解后，校正pH為6.5，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(6)定向篩選菌株的高密度增殖培養(yǎng)。將步驟(5)定向篩選與純化培養(yǎng)的食品乳桿菌、Lactobacillus versmoldensis、腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和短乳桿菌進(jìn)行高密度增值培養(yǎng)，高密度增值培養(yǎng)基為MRS瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)64～72h。MRS瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克、硫酸錳0.05克、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正pH為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

(7)定向篩選菌株的收集：將步驟(6)得到的經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液，加入3.5％經(jīng)高溫滅菌的脫脂奶粉，搖勻后以5000rpm轉(zhuǎn)速于-5℃條件下離心30分鐘，去除上清培養(yǎng)液，收集試管底部菌體。

(8)直投式發(fā)酵劑的冷凍干燥。將步驟(7)收集的菌體加入凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳30克、乳糖15克、葡糖糖12克、維生素C6.5克、D-山梨醇7.2克、L-谷氨酸6克和蒸餾水250mL。凍干保護(hù)劑加熱溶解后，121℃高壓滅菌20分鐘。菌體與凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:3。冷凍干燥條件為：-70℃預(yù)凍24h后，-80℃凍干24h。

(9)榨菜專用直投式發(fā)酵劑的制備。按照16S rDNA測序結(jié)果所確認(rèn)的乳酸菌的組成，將上述的凍干的食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、Lactobacillus versmoldensis、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)按照22.7％、37％、8％、2.6％、2.4％比例混合，制得榨菜專用直投式發(fā)酵劑。經(jīng)檢測，活菌含量為10⁹～10¹²cfu/g。

將本發(fā)明制得的榨菜專用直投式發(fā)酵劑用于榨菜鹽漬，與自然發(fā)酵的榨菜比較，風(fēng)味一致，而亞硝酸鹽含量明顯降低；同時(shí)采用本發(fā)明的榨菜專用直投式發(fā)酵劑用于榨菜鹽漬，具有產(chǎn)物穩(wěn)定的特點(diǎn)，避免了傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵過程中所導(dǎo)致的發(fā)酵風(fēng)味不純的缺點(diǎn)。本發(fā)明榨菜專用直投式發(fā)酵劑制得的榨菜與自然發(fā)酵榨菜中亞硝酸鹽含量比較，結(jié)果如圖3和圖4所示?？梢钥闯?，本發(fā)明的榨菜專用直投式發(fā)酵劑能顯著降低榨菜中亞硝酸鹽的含量，亞硝酸鹽含量幾乎只有自然發(fā)酵的一半。這是由于自然發(fā)酵菌群較為復(fù)雜，短時(shí)期內(nèi)難以形成優(yōu)勢菌群且產(chǎn)酸速度慢而直接影響對有害微生物的抑制；本發(fā)明的榨菜專用直投式發(fā)酵劑則能在短時(shí)期內(nèi)迅速形成優(yōu)勢菌群并快速產(chǎn)酸而使有害微生物得到有效抑制，因此使有害微生物對硝酸鹽的還原作用能力大為削弱，抑制和減少了亞硝酸鹽的生成。

實(shí)施例2

其他同實(shí)施例1，不同之處在于：

步驟(7)：將步驟(6)得到的經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液，加入2.7％經(jīng)高溫滅菌的脫脂奶粉，搖勻后以4000rpm轉(zhuǎn)速于10℃條件下離心25分鐘，去除上清培養(yǎng)液，收集試管底部菌體。

步驟(8)直投式發(fā)酵劑的冷凍干燥。將步驟(7)收集的菌體加入凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳25克、乳糖10克、葡糖糖5克、維生素C5克、D-山梨醇5克、L-谷氨酸5克和蒸餾水250mL；凍干保護(hù)劑加熱溶解后，121℃高壓滅菌15分鐘后備用。菌體與凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:2.5。冷凍干燥條件為：-50℃預(yù)凍12h后，-60℃凍干72h。

經(jīng)檢測，本實(shí)施例與實(shí)施例1達(dá)到同樣技術(shù)效果，不再贅述。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種基于16S rDNA測序的榨菜專用直投式發(fā)酵劑定向制備方法

<130> Z164859

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgccagcmg ccgcgg 16

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgtcaattc mtttragttt 20

<210> 3

<211> 450

<212> DNA

<213> Lactobacillus alimentarius

<400> 3

gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca atgccgcgtg agtgaagaag 60

gttttcggat cgtaaaactc tgttgttgaa gaagaacata tgtgagagta actgttcacg 120

tactgacggt attcaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaaga gaatgtaggc ggttcattaa 240

gtttgaagtg aaagccctcg gctcaaccga ggaagtgctt cgaaaactgg tgaacttgag 300

tgcagaagag gaaagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 360

caccagtggc gaaggcggct ttctggtctg taactgacgc tgagattcga aagcatgggt 420

agcaaacagg attagaaacc cgagtagtcc 450

<210> 4

<211> 451

<212> DNA

<213> Lactobacillus versmoldensis

<400> 4

gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag 60

gttttcggat cgtaaaactc tgttgttgaa gaagaacatg cgtgagagta actgttcatg 120

tattgacggt attcaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc gagtgcaggc ggtttattag 240

gtctgatgtg aaagccctcg gctcaaccga ggaagtgcat cggaaaccgg taaacttgag 300

tgcagaagag gagagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 360

caccagtggc gaaggcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggt 420

agcaaacagg attagaaacc cgagtagtcc g 451

<210> 5

<211> 450

<212> DNA

<213> Leuconostoc mesenteroides

<400> 5

gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc tgatggagca acgccgcgtg tgtgatgaag 60

gctttcgggt cgtaaagcac tgttgtatgg gaagaaaagt taaggtaggg aatgacctta 120

gcctgacggt accataccag aaagggacgg ctaaatacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtatgtcccg agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcagac ggttggttaa 240

gtctgatgtg aaagcccgga gctcaactcc ggaaaggcat tggaaactgg ttaacttgag 300

tgcagtagag gtaagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 360

caccagcggc gaaggcggct tactggactg taactgacgt tgaggctcga aagtgtgggt 420

agcaaacagg attagatacc ctagtagtcc 450

<210> 6

<211> 450

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 6

gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag 60

gttttcggat cgtaaaactc tgttgttgga gaagaatgta tctgatagta actgatcagg 120

tagtgacggt atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa 240

gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag 300

tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa 360

caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt 420

agcaaacagg attagaaacc ctagtagtcc 450

<210> 7

<211> 450

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevis

<400> 7

gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca atgccgcgtg agtgaagaag 60

ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacact cttgagagta actgttcagg 120

agttgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa 240

gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agaagtgcat cggaaactgg gagacttgag 300

tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 360

caccagtggc gaaggcggct gtctagtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt 420

agcaaacagg attagatacc cttgtagtcc 450