本發(fā)明涉及藥物化學領域，具體涉及一類新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物、它們的制備方法及其作為一類新的抗腫瘤藥物先導化合物的應用。

背景技術：

刺芒柄花素(Formononetin)為天然植物紅車軸草的花序及帶花枝葉，屬于異黃酮類化合物，對于預防乳腺癌、前列腺癌等癌癥有一定的作用?？鼓[瘤機制表明，天然產物刺芒柄花素通過IGF1/PI3K/Akt通路誘導乳腺癌細胞的周期阻滯，可作為候選抗腫瘤藥物。但是，刺芒柄花素作為候選抗腫瘤藥物的主要缺陷為活性較弱，在應用過程中收到很大限制。例如Xin Chen小組報道了刺芒柄花素的體外抗增殖活性，其對結腸癌細胞HCT-116、神經母腫瘤細胞SH-SY5Y及前列腺癌細胞DU-145的活性分別僅為60.97μM,>100μM,>100μM(European Journal of Medicinal Chemistry,2012,54,175-187)。

氨基二硫代甲酸酯是一種重要的抗腫瘤活性基團，通常由氨基化合物和二硫化碳合成。多個研究小組利用藥物拼接原理將氨基二硫代甲酸酯和其它藥效基團進行連接，合成得到了一些具有優(yōu)秀抗腫瘤活性的化合物。例如本課題組在查爾酮中引入氨基二硫代甲酸酯(如下式)，合成了一系列抗腫瘤活性優(yōu)于先導化合物的新型查爾酮衍生物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26,3918-3922)。

以氨基二硫代甲酸酯為母體，設計合成含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，同樣具有研究價值，對拓寬刺芒柄花素類化合物的研究領域具有重要意義，目前沒見相關文獻報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供系列新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，解決天然產物刺芒柄花素抗腫瘤活性弱的問題。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種簡單高效，綠色環(huán)保的合成含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物的方法。

本發(fā)明的再一個目的在于提供所述化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明通過藥物拼接原理，引入氨基二硫代甲酸酯基團合成了新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，所述一類新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物結構式如下：

為芐基哌嗪基、乙基哌嗪基、甲?；哙夯⒓谆哙夯?、嗎啡啉基、四氫吡咯基、叔丁氧羰基哌嗪基。

n代表碳原子的個數，為0,1,2。

優(yōu)選如下化合物之一：

本發(fā)明所述新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物主要通過下列步驟制得：

1.通式(1a～1d)的制備方法：

溶劑中，將刺芒柄花素在堿性條件下和1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷反應，體系濃縮至干，加入適量乙醇重結晶得到化合物1a～1d，所用的堿性化合物是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、十二水磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉中的一種；所用的溶劑為乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃、二氧六環(huán)中之一或其中任意兩種的混合物；反應在0-90℃之間進行。

刺芒柄花素與1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷的摩爾比范圍：1:1～1:1.2.

2.通式(I1～I9)的制備方法：

溶劑中，化合物1a～1d其中之一與取代仲胺化合物、二硫化碳在弱堿性條件下反應，待反應完成后，抽濾，濾液濃縮重結晶即得到通式(I1～I9)化合物；所用的溶劑為丙酮、乙腈、乙醇、甲醇中之一或其中任意兩種或三種的混合物；反應在0-30℃之間進行，重結晶溶劑為乙醇。所用的弱堿性化合物是磷酸鈉、十二水磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉中的一種。

所述取代仲胺化合物為：芐基哌嗪、乙基哌嗪、甲?；哙?、甲基哌嗪、嗎啡啉、四氫吡咯、叔丁氧羰基哌嗪。

化合物1a～1d與取代仲胺化合物、二硫化碳的摩爾比：1:1.2:1.5。

本發(fā)明創(chuàng)新點及優(yōu)點在于：通過藥物拼接原理，以氨基二硫代甲酸酯為母體，經過簡單的2步反應，設計合成了9個含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，解決天然產物刺芒柄花素抗腫瘤活性弱的問題。顯著提高了刺芒柄花素的抗腫瘤活性，有望將其應用于抗腫瘤藥物的制備，拓寬了刺芒柄花素類化合物的研究領域。

附圖說明

圖1為不同濃度的本發(fā)明衍生物I-8在48h下，對前列腺癌細胞細胞周期的影響。

具體實施方式

為了對本發(fā)明進行更好的說明，特舉實施例如下：

實施例1通式(1a～1d)的制備

100ml四氫呋喃中，將10g刺芒柄花素、6.2g碳酸鉀和7g 1,2-二溴乙烷或7.5g 1,3-二溴丙烷或8g 1,4-二溴丁烷反應，80℃加熱攪拌。反應6h后，體系濃縮至干，加入10ml乙醇重結晶得到化合物1a～1d。

實施例2通式(I1～I9)的制備

10ml丙酮中，1g化合物(1a～1d)與600mg取代仲胺、300mg二硫化碳、440mg磷酸鈉室溫條件下反應，待反應完成后，抽濾，濾液濃縮，3ml乙醇重結晶即得到通式(I1～I9)化合物。

通式(I1～I9)結構表征如下：

I-1：產率83％.白色固體.Mp:124～125℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.42(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.38–7.29(m,4H),7.29–7.22(m,1H),7.17(d,J＝2.2Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.92(s,2H),3.79(s,3H),3.51(s,2H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.22–2.09(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ194.74,174.60,162.81,158.99,157.38,153.45,137.53,130.04,128.91,128.22,127.09,126.96,124.05,123.35,117.63,115.02,113.60,101.12,67.14,61.27,55.13,51.93,32.72,27.86.HR-MS(ESI):Calcd.C₃₁H₃₃N₂O₄S₂,[M+H]⁺m/z:561.1885,found:561.1882.

I-2：產率85％.黃色固體.Mp:167～168℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.91(s,2H),3.79(s,3H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.47–2.39(m,4H),2.36(q,J＝7.2Hz,2H),2.21–2.10(m,2H),1.01(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ194.69,174.60,162.82,158.99,157.38,153.46,130.05,126.96,124.05,123.35,117.62,115.03,113.61,101.13,67.15,55.14,51.71,50.99,32.69,27.87,11.85.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₆H₃₁N₂O₄S₂,[M+H]⁺m/z:499.1729,found:499.1725.

I-3：產率78％.白色固體.Mp:174～176℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.18(d,J＝2.2Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(t,J＝6.1Hz,4H),3.97(s,2H),3.79(s,3H),3.64–3.55(m,4H),3.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.24–2.11(m,2H),2.03(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.33,174.61,168.68,162.81,158.99,157.38,153.47,130.05,126.97,124.04,123.35,117.62,115.05,113.61,101.13,67.15,55.15,44.41,32.69,27.81,21.21.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₆H₂₉N₂O₅S₂,[M+H]⁺m/z:513.1510,found:513.1518.

I-4：產率78％.黃色固體.Mp:167～169℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.92(s,2H),3.79(s,3H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.44–2.32(m,4H),2.20(s,3H),2.14(dd,J＝13.7,7.0Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ194.86,174.60,162.81,158.99,157.38,153.47,130.04,126.96,124.04,123.35,117.62,115.03,113.60,101.12,67.15,55.13,53.94,45.03,32.71,27.86.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₅H₂₉N₂O₄S₂,[M+H]⁺m/z:485.1574,found:485.1569.

I-5：產率79％.白色固體.Mp:156～158℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(t,J＝6.1Hz,4H),3.94(s,2H),3.79(s,3H),3.72–3.60(m,4H),3.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.23–2.11(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.39,174.60,162.81,158.99,157.38,153.47,130.05,126.97,124.04,123.35,117.62,115.03,113.60,101.12,67.14,65.56,55.13,32.56,27.84.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₄H₂₆NO₅S₂,[M+H]⁺m/z:472.1257,found:472.1252.

I-6：產率81％.白色固體.Mp:159～161℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.2Hz,2H),3.79(s,3H),3.76(d,J＝6.9Hz,2H),3.62(t,J＝6.8Hz,2H),3.40(t,J＝7.2Hz,2H),2.23–2.10(m,2H),2.07–1.96(m,2H),1.91(p,J＝6.7Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ190.61,174.60,162.83,158.99,157.39,153.47,130.05,126.96,124.05,123.35,117.62,115.04,113.60,101.11,67.15,55.13,54.93,50.53,32.03,28.03,25.53,23.71.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₄H₂₆NO₄S₂,[M+H]⁺m/z:456.1306,found:456.1303.

I-7：產率79％.白色固體.Mp:140～142℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(d,J＝1.8Hz,1H),7.11(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.6Hz,2H),4.38(t,J＝6.2Hz,2H),4.26(s,2H),3.97(s,2H),3.80(s,3H),3.77(t,J＝6.2Hz,2H),3.48(s,4H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.25,190.44,175.10,162.88,159.52,157.85,154.03,130.55,127.56,124.33,123.87,118.19,115.46,114.10,101.78,79.89,75.53,67.15,55.63,35.36,28.49.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₈H₃₃N₂O₆S₂,[M+H]⁺m/z:557.1788,found:557.1780.

I-8：產率83％.白色固體.Mp:165～167℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.42(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.17(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.95(s,2H),3.79(s,3H),3.44(dd,J＝15.1,7.3Hz,6H),2.22–2.10(m,2H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.33,174.59,162.80,158.98,157.37,153.68,153.44,130.04,126.95,124.04,123.34,117.62,115.02,113.59,101.10,79.35,67.14,55.13,32.69,27.99,27.81,18.53.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₉H₃₅N₂O₆S₂,[M+H]⁺m/z:571.1940,found:571.1937.

I-9：產率85％.白色固體.Mp:143～144℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.41(s,1H),8.02(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.15(d,J＝2.2Hz,1H),7.07(dd,J＝8.9,2.2Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(s,2H),4.16(t,J＝5.8Hz,2H),3.94(s,2H),3.51–3.42(m,4H),1.95–1.76(m,4H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ196.13,175.10,163.47,159.48,157.89,154.18,153.92,130.54,127.41,124.55,123.83,118.01,115.51,114.09,101.51,79.86,68.48,55.62,36.24,28.49,28.09,25.55.HR-MS(ESI):Calcd.C₃₀H₃₇N₂O₆S₂,[M+H]⁺m/z:585.2096,found:585.2093.

上述化合物的抗腫瘤活性測定：

1.實驗方法：

篩選所用化合物均是由本發(fā)明合成、純化而得；樣品儲備液：稱取1-2mg樣品置于1.5mL EP管中，然后用DMSO配制成濃度是128×10³μg/mL的溶液，4℃保存放置，實驗時根據所需濃度利用培養(yǎng)基稀釋。

2.初篩

取對數生長期的細胞，消化計數后，用培養(yǎng)基調整細胞密度，接種至96孔板中，培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋好的藥物(50μg/mL、100μg/mL)，每個濃度設6個復孔，另設空白對照組及陰性對照組。藥物作用48h后，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去液體，加入150mL的DMSO，振蕩均勻，酶標儀490nm處檢測吸光度值，計算抑制率，計算公式如下：

抑制率(％)＝(1-給藥組吸光度值/空白組吸光度值)×100％

3、細篩

50μg/mL時抑制率大于50％的樣品，重新設置濃度進行細篩。即將待測樣品以0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL濃度加入96孔板中，培養(yǎng)48h后，檢測。試驗結果采用SPSS軟件計算IC₅₀值和相關系數。

4、實驗結果：

表1上述化合物對三種腫瘤細胞的抗腫瘤活性評價數據：

^a人類胃癌細胞^b人類食管癌細胞^c人類前列腺癌細胞

實驗結果表明，本發(fā)明所提供的含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物對EC109，MGC-803和PC-3三種腫瘤細胞具有一定的抑制作用。其中化合物I8的體外抗前列腺腫瘤活性約為刺芒柄花素的28倍，可作為進一步開發(fā)的候選或者先導化合物，應用于制備抗腫瘤藥物。

進一步對活性較好的化合物I-8進行了抗前列腺癌機制研究，發(fā)現(xiàn)I-8能阻斷前列腺癌細胞細胞周期于G1期。相應結果見附圖1。