本發(fā)明屬于垃圾處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降解高油脂餐廚垃圾的復(fù)合菌劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

餐廚垃圾是是城市生活垃圾的重要組成部分，占到城市生活總量的40-60％。餐廚垃圾鹽分高，含油量可達20％，產(chǎn)量大、產(chǎn)地分散；餐廚垃圾以淀粉、食物纖維類、蛋白質(zhì)、油脂等為主要成分，極易腐敗發(fā)酸發(fā)臭，滋生有害生物?，F(xiàn)有技術(shù)中由于以往缺少相應(yīng)的處理條件，往往要么將餐廚垃圾與其他垃圾混在一起送往垃圾填埋場填埋，但是這種處理方式選址較困難，不僅要考慮地形、地質(zhì)條件、防止地表水、地下水污染，而且需要選擇遠離市區(qū)，因此運輸距離較遠。要么用于堆肥，但是重金屬等可能隨堆肥制品污染地下水，建立穩(wěn)定的堆肥市場較困難?；蛘叻贌?，焚燒投資大，對垃圾的熱值有一定的要求，而且可能會成為向大氣排放有害物質(zhì)的新污染源，使一些有價值的組分喪失掉。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種降解高油脂餐廚垃圾的復(fù)合菌劑。

本發(fā)明的目的之二在于提供所述降解高油脂餐廚垃圾的復(fù)合菌劑的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種降解高油脂餐廚垃圾的復(fù)合菌劑，包括按質(zhì)量份計算的如下菌種組成：地衣芽孢桿菌劑20-30份、黑曲霉菌劑20-30份、枯草芽孢桿菌劑40-50份、釀酒酵母菌劑20-30份和洋蔥假單胞菌劑為20-30份。

其中，所述地衣芽孢桿菌劑由地衣芽孢桿菌粉和菌粉載體組成、所述黑曲霉菌劑由黑曲霉菌粉和菌粉載體組成、所述枯草芽孢桿菌劑由枯草芽孢桿菌粉和菌粉載體組成、所述釀酒酵母菌劑由釀酒酵母菌粉和菌粉載體組成、所述洋蔥假單胞菌劑由洋蔥假單胞菌粉和菌粉載體組成；其中各單一菌劑中所述菌粉載體的質(zhì)量百分比為85％-95％。

所述菌粉載體為麩皮和木屑按照質(zhì)量比1:1混合均勻并滅菌而得。

所述地衣芽孢桿菌粉、黑曲霉菌粉、枯草芽孢桿菌粉、釀酒酵母菌粉和洋蔥假單胞菌粉分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）經(jīng)過逐級增加油脂含量的梯度培養(yǎng)條件下進行富集培養(yǎng)而得。

所述地衣芽孢桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和洋蔥假單胞菌均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號分別為地衣芽孢桿菌 CICC 10037；黑曲霉 CICC 2041；枯草芽孢桿菌 CICC10027；釀酒酵母 CICC1015；洋蔥假單胞菌 CICC 20699。

所述地衣芽孢桿菌粉的制備：吸取地衣芽孢桿菌母液，依次進行在液體活化培養(yǎng)、一級梯度周期培養(yǎng)、二級梯度周期培養(yǎng)，最后擴大培養(yǎng)制得地衣芽孢桿菌粉；所述液體活化培養(yǎng)基為：蛋白胨5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、氯化鈉5g/L、pH值為7.0-7.5；

一級梯度培養(yǎng)基為：蛋白胨5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L、PH值為7.0-7.5；

二級梯度培養(yǎng)基為：蛋白胨5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5 g/L、pH值為7.0-7.5；

擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測細菌OD₆₀₀值，直至OD₆₀₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為18h；最后通過高速離心收集菌體，并冷凍干燥，制得地衣芽孢桿菌粉。

所述黑曲霉菌粉的制備：吸取黑曲霉母液，依次進行在液體活化培養(yǎng)、一級梯度周期培養(yǎng)、二級梯度周期培養(yǎng)，最后擴大培養(yǎng)制得黑曲霉菌粉；

所述液體活化培養(yǎng)基為：蔗糖20g/L、動植物油5g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀 0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為6.0-6.5；

一級梯度培養(yǎng)基為：蔗糖10g/L、動植物油15g/L、硝酸鈉5 g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為6.0-6.5；

二級梯度培養(yǎng)基為：蔗糖5g/L、動植物油20 g/L、硝酸鈉5 g/L、氯化鉀 0.5 g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為6.0-6.5；

擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測黑曲霉OD₅₂₀值，直至OD₅₂₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為21h；最后通過高速離心收集菌體，并冷凍干燥，制得黑曲霉菌粉。

所述枯草芽孢桿菌粉的制備：吸取枯草芽孢桿菌母液，依次進行在液體活化培養(yǎng)、一級梯度周期培養(yǎng)、二級梯度周期培養(yǎng)，最后擴大培養(yǎng)制得枯草芽孢桿菌粉；所述液體活化培養(yǎng)為：葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L；

一級梯度培養(yǎng)基為：葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉3 g/L、牛肉膏0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為7.0-7.5；

二級梯度培養(yǎng)基為：葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為7.0-7.5；

擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測細菌OD₆₀₀值，直至OD₆₀₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為18h；最后通過高速離心收集菌體，并冷凍干燥，制得枯草芽孢桿菌粉。

所述釀酒酵母菌粉的制備：吸取釀酒酵母母液，依次進行在液體活化培養(yǎng)、一級梯度周期培養(yǎng)、二級梯度周期培養(yǎng)，最后擴大培養(yǎng)制得釀酒酵母菌粉；所述液體活化培養(yǎng)為：20％馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基；

一級梯度培養(yǎng)基為：10％馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基和動植物油10 g/L，培養(yǎng)基pH值為7.0-7.5；

二級梯度培養(yǎng)基為：5％馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基和動植物油20g/L，培養(yǎng)基pH值為7.0-7.5；

擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測細菌OD₆₀₀值，直至OD₆₀₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為24h；最后通過高速離心收集菌體，并冷凍干燥制得釀酒酵母菌粉。

所述洋蔥假單胞菌粉的制備：吸取洋蔥假單胞菌母液，依次進行在液體活化培養(yǎng)、一級梯度周期培養(yǎng)、二級梯度周期培養(yǎng)，最后擴大培養(yǎng)制得洋蔥假單胞菌粉；所述液體活化培養(yǎng)為：蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5 g/L、氯化鈉5g/L；

一級梯度培養(yǎng)基為：蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L，培養(yǎng)基pH值為7.0-7.5；

二級梯度培養(yǎng)基為：蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖5 g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5g/L，培養(yǎng)基pH值為7.0-7.5；

擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測細菌OD₆₀₀值，直至OD₆₀₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為27h；最后通過高速離心收集菌體，并冷凍干燥制得洋蔥假單胞菌粉。

其中，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）具有較強的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，可促進有機質(zhì)中營養(yǎng)素的降解，在復(fù)雜環(huán)境中能抵抗較大的PH和鹽分變動，同時抑制致病菌的生長繁殖。

黑曲霉（Aspergillus niger）是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等，黑曲霉具有裂解大分子有機物和難溶無機物，便于微生物吸收利用。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在生長過程中能產(chǎn)生多種菌素、短桿菌Taipe肽等活性物質(zhì)，能抑制致病菌的生長，同時自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，對有毒有害物質(zhì)有很強的分解和清理作用，也被廣泛應(yīng)用于飼料、污水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖等工業(yè)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是發(fā)酵中最常用的生物種類，擁有豐富的酶系統(tǒng)，對高糖、高油脂、高滲透壓環(huán)境具有很強的耐受性，代謝產(chǎn)物多，綜合利用光，在現(xiàn)代工業(yè)如食品、釀酒、生物工程等行業(yè)中有廣泛的用途。

洋蔥假單胞菌：（Pseudomonas cepacia）環(huán)境適應(yīng)性較強，在營業(yè)基質(zhì)缺乏情況下仍能生長，菌種所產(chǎn)生的脂肪酶對各種有機溶劑(醇等)、熱、氧化劑、表面活性劑、去污劑、蛋白酶等均有較好的抗性,是目前在有機合成、洗滌劑添加劑、生物柴油合成中應(yīng)用得最為廣泛的脂肪酶之一。

本發(fā)明選取幾種耐高油脂的高效分解菌種，在逐級梯度油脂含量的培養(yǎng)條件下進行富集培養(yǎng)，做成單一菌粉后混合做成復(fù)合菌劑，復(fù)合菌劑中推薦菌劑比例為地衣芽孢桿菌為20-30份，黑曲霉為20-30份，枯草芽孢桿菌40-50份，釀酒酵母20-30份，洋蔥假單胞菌為20-30份。

進行餐廚垃圾降解實例發(fā)現(xiàn)，有效提高了復(fù)合菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾的程度，結(jié)果顯示和未進行梯度培養(yǎng)的菌種相比，通過梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)的復(fù)合菌劑在處理含油量較低的情況下，降解能力基本相同（86.3％，84.5％）；但在含油量為10％的情況下，降解能力可提高7.9％（88.2％。80.3％）；在含油量20％的情況下，降解能力可提高10.9％（84.3％，73.4％）。這證明通過梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)的復(fù)合菌劑具備了明顯的耐高油脂的適應(yīng)性，并通過菌種之間的協(xié)同作用可提高脂肪利用率，并作為碳源進行新陳代謝，對高油脂的餐廚垃圾具有明顯的降解優(yōu)勢。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。

1.1 對于地衣芽孢桿菌，吸取1ml地衣芽孢桿菌母液，接種至裝有100ml的上述培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，液體活化培養(yǎng)基成分為：蛋白胨5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、氯化鈉5g/L、pH值保持中性（7.0-7.5）；

在培養(yǎng)溫度為36-38℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。重復(fù)此培養(yǎng)步驟5天，經(jīng)過加動植物油的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)過的地衣芽孢桿菌對油脂有一定適應(yīng)性，隨后油脂濃度進行逐級增大培養(yǎng)。

取經(jīng)5天活化培養(yǎng)的菌株液1ml接種至裝有100ml一級梯度培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，一級梯度培養(yǎng)基成分為：蛋白胨5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L、pH值保持中性（7.0-7.5），在培養(yǎng)基溫度為36-38℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min條件下培養(yǎng)24h，重復(fù)此培養(yǎng)步驟5天。

取經(jīng)5天一級梯度培養(yǎng)的菌株液1ml接種至裝有100ml二級梯度培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，二級梯度培養(yǎng)基成分為蛋白胨5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5g/L、pH值保持中性（7.0-7.5），在培養(yǎng)基溫度為36-38℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min條件下培養(yǎng)24h，重復(fù)此培養(yǎng)步驟5天。

隨后取1ml經(jīng)5天培養(yǎng)的二級梯度的菌液放入1000ml的3L發(fā)酵罐中進行放大培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測細菌OD₆₀₀值，直至OD₆₀₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為18h。通過高速離心收集菌體，并冷凍干燥做成菌粉。

1.2 吸取1ml黑曲霉母液，接種至裝有100ml的上述培養(yǎng)基的250ml三角瓶中液體活化培養(yǎng)基成分為：蔗糖20 g/L、動植物油5g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為6.0-6.5；在培養(yǎng)溫度為28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。重復(fù)此培養(yǎng)步驟5天。

取經(jīng)5天活化培養(yǎng)的黑曲霉菌液1ml接種至裝有100ml一級梯度培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，一級梯度培養(yǎng)基成分為：蔗糖10g/L、動植物油15 g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為6.0-6.5； 培養(yǎng)溫度為28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)24h。重復(fù)此步驟5天。

取經(jīng)5天一級梯度培養(yǎng)的菌株液1ml接種至裝有100ml二級梯度培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，二級梯度培養(yǎng)基成分為蔗糖5g/L、動植物油20g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養(yǎng)基pH值為6.0-6.5；在培養(yǎng)基溫度為36-38℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min條件下培養(yǎng)24h，重復(fù)此培養(yǎng)步驟5天。

隨后取1ml經(jīng)5天培養(yǎng)的二級梯度的菌液放入1000ml的3L發(fā)酵罐中進行放大培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為二級梯度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中每隔3個小時測黑曲霉OD₅₂₀值，直至OD₅₂₀為0.8±0.05，培養(yǎng)時間約為21h。高速離心收集菌體，并冷凍干燥做成菌粉。

1.3 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、洋蔥假單胞菌培養(yǎng)過程類似。其中枯草芽孢桿菌活化培養(yǎng)基為葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L；一級梯度培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L；二級梯度培養(yǎng)基為葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L，培養(yǎng)基pH值保持中性（7.0-7.5）。培養(yǎng)基溫度為36-38℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。放大培養(yǎng)時測OD₆₀₀（0.8±0.05），培養(yǎng)時間約為18h。

釀酒酵母活化培養(yǎng)基為20％馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基（將去皮馬鈴薯200g切成小塊，加入蒸餾水1000ml，煮沸半小時，紗布過濾后，補足1000ml，貯存?zhèn)溆?。）；一級梯度培養(yǎng)基為10％馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基，動植物油10g/L；二級梯度培養(yǎng)基為5％馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基，動植物油20g/L，培養(yǎng)基pH值保持中性（7.0-7.5）。

培養(yǎng)基溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min；放大培養(yǎng)時測OD₅₆₀（0.8±0.05），培養(yǎng)時間約為24h。

洋蔥假單胞菌活化培養(yǎng)基為蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、氯化鈉5g/L；一級梯度培養(yǎng)基為蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖10 g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L；二級梯度培養(yǎng)基為蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5g/L。培養(yǎng)基pH值保持中性（7.0-7.5），培養(yǎng)溫度為36-38℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min；放大培養(yǎng)時測OD₆₀₀（0.8±0.05），培養(yǎng)時間約為27h。

1.4 菌粉載體制作：將麩皮：木屑按照質(zhì)量比1:1混合均勻并滅菌作為載體，將用上述培養(yǎng)方式培養(yǎng)的菌粉和載體在無菌操作條件下充分混勻制作為單一菌劑，單一菌劑中菌粉質(zhì)量比約為10％。

將制作好的單一菌劑按照一定比例混合均勻即得復(fù)合菌劑。推薦比例為地衣芽孢桿菌為20-30份，黑曲霉為20-30份，枯草芽孢桿菌40-50份，釀酒酵母20-30份，洋蔥假單胞菌為20-30份。

上述實施例，只是本發(fā)明的較佳實施例，并非用來限制本發(fā)明實施范圍，故凡以本發(fā)明權(quán)利要求所述的特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

餐廚垃圾降解實例：

本次餐廚垃圾樣品為3份，每份餐廚垃圾均為1000g，并進行人工配制。其中第一份為淀粉200g，青菜葉300g，豬瘦肉500g（含油量＜10％）；第二份為淀粉200g，青菜葉300g，豬瘦肉400g，動植物油100g（含油量約10％）；第三份為淀粉200g，青菜葉300g，豬瘦肉300g，動植物油200g（含油量約20％）。每份樣品的菜葉和豬肉均剁碎后和淀粉混勻作為餐廚垃圾樣品。

同時設(shè)置對照組實驗，將未進行過梯度培養(yǎng)的原各菌種進行放大培養(yǎng)至各相應(yīng)的OD值為（0.8±0.05），并按照相同的方式制作成對照組復(fù)合菌劑。

將兩組復(fù)合菌劑均和餐廚垃圾按照4:1的質(zhì)量比進行混合，并分別放入餐廚垃圾處理機中進行通風(fēng)攪拌，保持溫度為37℃。

餐廚垃圾降解率計算采用以下公式進行：降解率=（A-B）/C×100％。其中A表示處理機、餐廚垃圾、復(fù)合菌劑投入后的總重量；B表示處理機、餐廚垃圾、復(fù)合菌劑處理24h后的總重量；C表示投入的餐廚垃圾的總重量。

通過24h后的降解后，實驗組和對照組的餐廚垃圾降解率分別如下：

從結(jié)果來看，和對照組相比，通過梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)的復(fù)合菌劑在處理含油量較低的情況下，降解能力基本相同（86.3％，84.5％）；但在含油量為10％的情況下，降解能力提高7.9％（88.2％，80.3％）；在含油量20％的情況下，降解能力提高10.9％（84.3％，73.4％）。這證明通過梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)的復(fù)合菌劑具備了明顯的耐高油脂的適應(yīng)性，并通過菌種之間的協(xié)同作用可將脂肪充分利用并作為碳源進行新陳代謝，對高油脂的餐廚垃圾具有明顯的降解優(yōu)勢。