本發(fā)明涉及一種提高枯草芽孢桿菌普魯蘭酶分泌的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)是一種水解普魯蘭糖、支鏈淀粉等分支多糖類物質(zhì)中α-1，6糖苷鍵的脫支淀粉酶。在工業(yè)生產(chǎn)中普魯蘭酶通常與α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、環(huán)糊精葡糖苷轉(zhuǎn)移酶協(xié)同作用來獲得葡萄糖、果糖、麥芽糖漿、環(huán)糊精、直鏈淀粉等產(chǎn)品。由于普魯蘭酶的加入可以明顯提高這些產(chǎn)品的產(chǎn)量同時(shí)縮短生產(chǎn)周期，因此在低分子糖漿，啤酒，酒精燃料，抗性淀粉等物質(zhì)的生產(chǎn)企業(yè)中應(yīng)用廣泛。

然而普魯蘭酶在枯草芽孢桿菌中的分泌量卻相對(duì)較低，例如，重組菌株Bacillus subtilisWB800-pMA0911-PUL表達(dá)了來源于Bacillus naganoensis的普魯蘭酶，其胞外普魯蘭酶酶活僅為3.9U·ml^-1，將載體pMA0911中的HpaII啟動(dòng)子用強(qiáng)啟動(dòng)子P₄₃替換掉，胞外酶活提高到8.7U·ml^-1，但分泌量仍然較低[Wan Song,Yao Nie,Xiao Qing Mu,Yan Xu,Enhancement of extracellular expression of Bacillus naganoensispullulanase from recombinant Bacillus subtilis:Effects of promoter and host.Protein Expression and Purification,2016,124:23-31]。再如，有研究者將枯草芽孢桿菌中用于表達(dá)普魯蘭酶的啟動(dòng)子和信號(hào)肽都進(jìn)行優(yōu)化，但胞外普魯蘭酶酶活僅為2.82U·ml^-1，分泌量十分有限[Y.P.Wang,Y.H.Liu,Z.X.Wang,F.P.Lu,Influence of promoter and signal peptide on the expression of pullulanase in Bacillus subtilis.Biotechnology Letter,2014,36:1783-1789]，這就很大程度上限制了普魯蘭酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

由于非離子型表面活性劑通常具有親水基團(tuán)和疏水集團(tuán)，當(dāng)這些集團(tuán)與枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜接近時(shí)會(huì)破壞其肽聚糖，磷脂等物質(zhì)的排列方式和結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞的透性增大。據(jù)我們所知，尚未有通過非離子型表面活性劑的添加來提高枯草芽孢桿菌中普魯蘭酶分泌效率的報(bào)道。本研究通過一些非離子型表面活性劑的添加和濃度的優(yōu)化提高了枯草芽孢桿菌中普魯蘭酶的分泌效率，降低了工業(yè)上普魯蘭酶的胞外生產(chǎn)純化成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供了一種重組表達(dá)普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌，是以枯草芽孢桿菌WB800為宿主，以枯草芽孢桿菌168來源的啟動(dòng)子ylb(F4)替換掉pP43NMK上的啟動(dòng)子P43得到的載體作為表達(dá)載體，表達(dá)Anoxybacillus sp.WB42來源的普魯蘭酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組表達(dá)普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1)將Anoxybacillus sp.WB42來源的普魯蘭酶基因pulA和質(zhì)粒pP43NMK同時(shí)用限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII雙酶切，純化回收后的載體pP43NMK與目的基因pulA，進(jìn)行連接得到pP43NMK-pulA；

(2)以枯草芽孢桿菌168來源的啟動(dòng)子ylb(F4)替換掉pP43NMK-pulA上的啟動(dòng)子P43，得到pPylbNMK-pulA；

(3)將重組質(zhì)粒pPylbNMK-pulA轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800菌株，得到重組表達(dá)普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明還提供應(yīng)用所述重組枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)普魯蘭酶的方法，是將重組枯草芽孢桿菌的種子液接種至LB液體培養(yǎng)基中，在35～37℃、180～200rpm培養(yǎng)，當(dāng)菌體將要進(jìn)入生長穩(wěn)定期時(shí)，加入終濃度為0.4～0.6％的甜菜堿或0.2～0.4％的吐溫-80或0.2～0.5％的司盤80。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將重組枯草芽孢桿菌的種子液按接種量1％接種至LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm培養(yǎng)，當(dāng)菌體將要進(jìn)入生長穩(wěn)定期時(shí)，加入終濃度為0.4％的甜菜堿或0.2％的吐溫-80或0.4％的司盤80。

本發(fā)明通過構(gòu)建重組表達(dá)普魯蘭酶的枯草芽孢桿菌，并在以此重組菌發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的過程中，添加終濃度為0.4％的甜菜堿或0.2％的吐溫-80或0.4％的司盤80，普魯蘭酶的分泌效率可以達(dá)到76.13％、68.72％和72.84％，胞外pulA酶活分別達(dá)到22.95IU/ml、19.13IU/ml、20.11IU/ml。

附圖說明

圖1基因片段pulA PCR產(chǎn)物的核酸電泳圖

圖2啟動(dòng)子ylb(F4)PCR產(chǎn)物的核酸電泳圖(3，4泳道)

圖3全質(zhì)粒PCR產(chǎn)物pPylbNMK-pulA的核酸電泳圖

圖4添加表面活性劑后Bacillus subtilis WB800-pPylbNMK-pulA的生長曲線

圖5 Bacillus subtilisWB800-pPylbNMK-pulA發(fā)酵上清液SDS-PAGE(箭頭所指為目的蛋白pulA，大小約84Kd)；1.對(duì)照，2.甜菜堿，3.甘氨酸，4.P-40，5.曲拉通X-100，6.吐溫-80，7.十二烷基硫酸鈉，8.月桂酰肌氨酸鈉，9.司盤-80，10.S-185

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1重組菌株Bacillus subtilis WB800-pPylbNMK-pulA的構(gòu)建

(1)普魯蘭酶基因的克隆

根據(jù)Anoxybacillus sp.WB42來源的普魯蘭酶基因序列設(shè)計(jì)引物，引物如下：

上游引物P1：

GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCTAACGGTTCATCGGACGTTTG，酶切位點(diǎn)為KpnI；

下游引物P2：CCCAAGCTTTTAAGTCAGTCCTTTCACAAGCACGACTG，酶切位點(diǎn)為HindIII；

擴(kuò)增體系：

模板1μL(Anoxybacillus sp.WB42基因組DNA)

上游引物P1 1μL

下游引物P2 1μL

dNTP(2.5mM each)4μL

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL

PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL

H₂O 32.5μL

用于擴(kuò)增目的基因的PCR條件：

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果附圖1，其大小與目的基因大小相似，目的基因pulA序列見序列SEQ ID NO.1。

(2)E.coli JM109-pP43NMK-pulA重組菌株的構(gòu)建

用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN公司)從E.coli JM109-pP43NMK中提取質(zhì)粒pP43NMK(張曉舟.枯草桿菌新型表達(dá)系統(tǒng)和遺傳操作體系的建立和應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006).

將上述提取的目的基因pulA和質(zhì)粒pP43NMK同時(shí)用限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII雙酶切，體系如下：

KpnI 1μL

HindIII 1μL

10×QC Buffer2μL

pulA/pP43NMK 10μL人工序列

H₂O 6μL

酶切于37℃，反應(yīng)4-6h即可，用DNA純化試劑盒(TOYOBO公司)對(duì)DNA進(jìn)行純化回收。

pP43NMK與目的基因pulA的連接：將上述純化回收后的載體pP43NMK與目的基因pulA連接，體系如下：

連接酶solutionI 5μL

pP43NMK 1μL

目的基因pulA 4μL

16℃，過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109菌株，并挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測(cè)序(上海睿迪公司)。(3)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子ylb(F4)的克隆

參考文獻(xiàn)中報(bào)道的啟動(dòng)子ylb(F4)序列(Xiaoxia Yu,Jiangtao Xu,Xiaoqing Liu,Xiaoyu Chu,Ping Wang,Jian Tian,NingfengWu&YunliuFan.Identification of a highly effici entstationary phase promoter in Bacillus subtilis.Scientific Reports.|5:18405|DOI:10.1038/srep18405(2015))設(shè)計(jì)引物，引物如下：

上游引物P3：(與載體pP43NMK的P43啟動(dòng)子上游同源)GACCGAGATTTTTTTGAGCAACTGGATCCACTTCTCAAAGATCCCATGTGC

下游引物P4：(與基因pulA序列的5’端反向互補(bǔ))GCTTCAAACGTCCGATGAACCGTTAGCATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTT

擴(kuò)增體系：

模板1μL(Bacillus subtilis 168基因組DNA)

上游引物P3 1μL

下游引物P4 1μL

dNTP(2.5mM each)4μL

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL

PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL

H₂O 32.5μL

用于擴(kuò)增啟動(dòng)子ylb(F4)序列的PCR條件：

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2，其大小與目標(biāo)序列大小相似，啟動(dòng)子ylb(F4)序列見SEQ ID NO.6。

(4)重組質(zhì)粒pPylbNMK-pulA的構(gòu)建

以上述擴(kuò)增的啟動(dòng)子ylb(F4)片段為引物，測(cè)序正確的質(zhì)粒pP43NMK-pulA為模板進(jìn)行全質(zhì)粒PCR，用啟動(dòng)子ylb(F4)替換掉pP43NMK-pulA上的啟動(dòng)子P43。

擴(kuò)增體系：

模板1μL(質(zhì)粒pP43NMK-pulA)

上下游引物(擴(kuò)增得到的啟動(dòng)子ylb(F4)片段)2μL

dNTP(2.5mM each)4μL

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL

PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL

H₂O 32.5μL

用于得到線性重組子pPylbNMK-pulA的PCR條件：

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3。

將上述得到的線性重組子pPylbNMK-pulA用限制性內(nèi)切酶DpnI消化，體系如下：

DpnI 1μL

pPylbNMK-pulA 5μL

10×QC Buffer 1μL

H₂O 1μL

37℃，反應(yīng)10h即可。

將上述經(jīng)過DpnI消化的線性重組子pPylbNMK-pulA轉(zhuǎn)化E.coli JM109，并挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測(cè)序(上海睿迪公司)。

(5)將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pPylbNMK-pulA轉(zhuǎn)入Bacillus subtilis WB800菌株。

實(shí)施例2

(1)用接種環(huán)沾取少量Bacillus subtilisWB800-pPylbNMK-pulA菌液，在含有50μg/ml卡那霉素的固體LB平板上劃線，之后放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天挑取單菌落至裝有10mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，加入終濃度為50μg/ml的卡那霉素，在37℃，200rpm搖床上培養(yǎng)約10h作為種子液。

(2)將種子液以1％的接種量分別接種至50mlLB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為50μg/ml的卡那霉素，在37℃，200rpm搖床上培養(yǎng)并定時(shí)取樣在600nm吸光值下測(cè)量菌體OD。當(dāng)菌體將要進(jìn)入生長穩(wěn)定期時(shí)(搖瓶發(fā)酵的第21.5h)分別加入終濃度為0.2％的非離子型表面活性劑甜菜堿，甘氨酸，P-40，曲拉通X-100，吐溫80，十二烷基硫酸鈉，月桂酰肌氨酸鈉，司盤80，S-185，菌體生長情況如圖1。

(3)在搖瓶發(fā)酵的第48h分別從上述10個(gè)發(fā)酵搖瓶中取500μl菌液，在4℃，12000rpm條件下，離心10min，分離出上清液作為細(xì)胞外蛋白樣品液。菌體用1M pH5.8的HAc-NaAc緩沖液洗滌3次后加入500μl pH8.0的含有200μg/ml溶菌酶的TE緩沖液重懸，并于37℃金屬浴中放置2h，使枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁充分分解，用超聲破碎儀在42％功率下破碎5min，之后在4℃，12000rpm條件下，離心10min，收集上清作為細(xì)胞內(nèi)蛋白樣品液。

(4)用DNS顯色法分別測(cè)定第48h細(xì)胞外蛋白樣品液和細(xì)胞內(nèi)蛋白樣品液的普魯蘭酶活力，并計(jì)算出第48h相對(duì)胞外pulA酶活、相對(duì)總pulA酶活、分泌效率及相對(duì)細(xì)胞密度，結(jié)果如表1。

DNS顯色法測(cè)普魯蘭酶酶活具體步驟：在1.5mlEP管中加入40μl濃度為6％的普魯蘭糖底物，再加入10μl1MpH5.8的HAc-NaAc緩沖液，放入65℃的金屬浴中保溫5min，快速加入20μl酶液并于旋渦振蕩器混勻，65℃反應(yīng)15min后加入70μlDNS試劑終止反應(yīng)。將溫度升高至100℃保溫6min，并將最終反應(yīng)液稀釋72倍，用于測(cè)量其在476nm下的吸光值。普魯蘭酶活力定義為在上述特定條件下，單位體積反應(yīng)液中1min內(nèi)普魯蘭酶催化生成1μmol還原力的還原糖所需要的酶量。

表1 不同種表面活性劑對(duì)Bacillus subtilis WB800-pPylbNMK-pulA中pulA分泌的影響

注：相對(duì)胞外pulA酶活＝胞外pulA酶活(不同種表面活性劑)/胞外pulA酶活(對(duì)照)×100％；

分泌效率＝胞外pulA酶活/總pulA酶活×100％

相對(duì)總pulA酶活＝總pulA酶活(不同種表面活性劑)/總pulA酶活(對(duì)照)×100％；

相對(duì)細(xì)胞密度＝OD₆₀₀(不同種表面活性劑)/OD₆₀₀(對(duì)照)×100％

從表1中可以看出加入表面活性劑甜菜堿、吐溫-80、司盤-80后，總pulA酶活較對(duì)照沒有明顯下降，且這三種表面活性劑對(duì)細(xì)胞的裂解作用不如甘氨酸、NP-40、TritonX-100、S-185那樣強(qiáng)烈，對(duì)pulA的分泌效率分別達(dá)到54.21％，59.07％，62.58％，胞外pulA酶活分別達(dá)到15.17IU/ml，17.55IU/ml，16.02IU/ml。

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，我們對(duì)甜菜堿、吐溫-80、司盤-80這三種表面活性劑進(jìn)行濃度的調(diào)整，結(jié)果分別如下表2，3，4。

表2 不同濃度甜菜堿對(duì)B.subtilis WB800-pPylbNMK-pulA中pulA分泌的影響

注：相對(duì)胞外pulA酶活＝胞外pulA酶活(不同濃度表面活性劑)/胞外pulA酶活(0.2％甜菜堿)×100％；

分泌效率＝胞外pulA酶活/總pulA酶活×100％

相對(duì)總pulA酶活＝總pulA酶活(不同濃度表面活性劑)/總pulA酶活(0.2％甜菜堿)×100％；

相對(duì)細(xì)胞密度＝OD₆₀₀(不同濃度表面活性劑)/OD₆₀₀(0.2％甜菜堿)×100％

表3 不同濃度吐溫-80對(duì)Bacillus subtilis WB800-pPylbNMK-pulA中pulA分泌的影響

注：相對(duì)胞外pulA酶活＝胞外pulA酶活(不同濃度表面活性劑)/胞外pulA酶活(0.1％吐溫-80)×100％；

分泌效率＝胞外pulA酶活/總pulA酶活×100％

相對(duì)總pulA酶活＝總pulA酶活(不同濃度表面活性劑)/總pulA酶活(0.1％吐溫-80)×100％；

相對(duì)細(xì)胞密度＝OD₆₀₀(不同濃度表面活性劑)/OD₆₀₀(0.1％吐溫-80)×100％

表4不同濃度司盤-80對(duì)Bacillus subtilis WB800-pPylbNMK-pulA中pulA分泌的影響

注：相對(duì)胞外pulA酶活＝胞外pulA酶活(不同濃度表面活性劑)/胞外pulA酶活(0.1％司盤-80)×100％；

分泌效率＝胞外pulA酶活/總pulA酶活×100％

相對(duì)總pulA酶活＝總pulA酶活(不同濃度表面活性劑)/總pulA酶活(0.1％司盤-80)×100％；

相對(duì)細(xì)胞密度＝OD₆₀₀(不同濃度表面活性劑)/OD₆₀₀(0.1％司盤-80)×100％

從上述表中可以看出表面活性劑甜菜堿、吐溫-80、司盤-80的添加濃度分別為0.4％、0.2％、0.4％時(shí)對(duì)pulA的分泌效果最優(yōu)，其中0.4％甜菜堿，0.2％吐溫-80，0.4％司盤-80對(duì)pulA的分泌效率可以達(dá)到76.13％，68.72％和72.84％，胞外pulA酶活分別達(dá)到22.95IU/ml，19.13IU/ml，20.11IU/ml。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種提高枯草芽孢桿菌普魯蘭酶分泌的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2136

<212> DNA

<213> Anoxybacillus sp.WB42

<400> 1

atgctaacgg ttcatcggac gtttgaagca tatttagata caatggaaac gattacgatt 60

ttagtaccga aatcgtattg ccaagggata gtgcgctcat ttaccatcca aacgccaaac 120

ggagaacgac gcgcactaca aattacgaaa cgcgaagatt tatggacgag cattaaatat 180

gagtgcatcc ccgatgttcc ggtggaaatc ggaaaaagtt atttcattta tgaagaacat 240

ggggcgttta ccgatttgca aatgggagcg gttattcgca ccgaagcatt tgatgagcag 300

ttttattatg acggtgacct tggcattacg tacagcaacg atgccacaac gtttaaactt 360

tgggcaccga cagcaacaga ggtaaaacta aagctcatta acaaagcagg aaaagaagaa 420

caaatctcga tgcagcgcgg agaaaaaggg gtatggtgcg cgacagtact cggtaattta 480

gatgggatat actatacgta tttagcgtgt attaaccttg tttggcgaga agcggtcgac 540

ccgtatgctg tagcggtatc ggtgaatgga gaatacgggg tcgtcgtcga tctcgccaaa 600

acgcgagtgc ccaaaccagc gctacctccg cttactgccc cagtcgatgc cattatttat 660

gaaatgcacg ttcgtgattt tacaattgat cctcatagcg gcgttgtcca taaaggaaag 720

tatctaggac tgactgaatt tccaacaaca gaaccgtctg gaacagtgac ggggcttgct 780

tatttgaaac aacttggggt tacacacgta gagctgcttc cggtgaacga ttttgccggg 840

gtcgatgaac gtgaaccgga aaaagagtac aactgggggt acaatccgct tcactacaac 900

gcgccggaag gaagttatgc gaccgatcct tacgatccgt atgcgcgtat tcatgaattg 960

aaacgagcaa ttcgcgcttt gcagcaagaa ggtattcgtg tcattctcga tgtcgtttat 1020

aaccacgttt acattcgcga acagtcgtca ctagaaaaac tcgtgcctgg gtattatttt 1080

cgccatgata tttacggtat gccatcgaac gggacagggg tcggaaatga tcttgccccc 1140

gagcgcaaaa tggttcgcaa gctcattgtc gattccgttc gtttctggct tacagagtat 1200

ggcattgatg ggtttcgttt tgatttaatg ggcattctcg atattgacac gatgaaagaa 1260

gtcgaggcag ttgttcgtgc gctccatcca tccgctctat tgctcggcga aggatgggat 1320

ttgccgacac cattgccgtc ggaaaaaaaa gcaacgatgc aaaatgccca ccttctgccg 1380

acgattgcct tttttaacga tcggtttcgc gattatgtca aagggagtac gtttcattta 1440

ggggaacaag gatttgttct aggaaacagc gcacatcgcg aacaagtgaa acgagtaatc 1500

gaaggaagcc atcatttgtt ttctcaacca acgcaaacgg ttaactacgt cgaatcacac 1560

gacaaccata cgctttggga caaaatgagc atcgccaact attacgagcg agaaaccatt 1620

cgtaaaaaac gacaaaaatt agcgacagcg atgaccttat tagcacaagg cattccattt 1680

ttgcatagcg gccaagaatt ttaccgtaca aaacaaggag tagaaaatag ttataacgct 1740

ccagatgaca ttaaccgcat cgattggacg agaaaaagca tgcacgaaca agacgtccgt 1800

tacgtgcaag gattgattcg gctgcggaaa tggcacggtg cttttcgttt tcaaacagtg 1860

gaagaaataa gaaaccatct tgtatggctt gaaccgatgc cgtcgacagt gctcgctttt 1920

catctttacg acgtatcagc gtatgggccg tggcgtgata ttattgtcat tcaccataat 1980

gaagaaacac ggctagcagt tgcgctccct gatgaagaaa gatggtatgt cgtatgtgat 2040

gaaacaagga gtggaatcga tcctctttac gcggcgacaa aaaaaatcga gctgcaagga 2100

attggaacag tcgtgcttgt gaaaggactg acttaa 2136

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggtaccat tataggtaag agaggaatgt acacatgcta acggttcatc ggacgtttg 59

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaagcttt taagtcagtc ctttcacaag cacgactg 38

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaccgagatt tttttgagca actggatcca cttctcaaag atcccatgtg c 51

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcttcaaacg tccgatgaac cgttagcata caaatctccc cctttgttgt t 51

<210> 6

<211> 103

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis 168

<400> 6

acttctcaaa gatcccatgt gcttaaaatt aaagtttaaa tatttggatt ttttaaataa 60

agcgtttaca atatatgtag aaacaacaaa gggggagatt tgt 103