本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種在CHO(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢細(xì)胞)細(xì)胞中利用piggyBac轉(zhuǎn)座子快速高效表達(dá)蛋白的方法。

背景技術(shù)：

DNA轉(zhuǎn)座子是天然存在于動物細(xì)胞基因組中的重復(fù)序列。PiggyBac轉(zhuǎn)座子最初發(fā)現(xiàn)于昆蟲細(xì)胞中，核心原件包括轉(zhuǎn)座酶和末端反向重復(fù)序列。PiggyBac轉(zhuǎn)座子的基因序列以及末端反向重復(fù)序列已經(jīng)公開，其在GENBANK中的編號為GU937109.1和ABS12111.1。PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)能夠通過“剪切和粘貼”的方式在基因組和質(zhì)粒間轉(zhuǎn)移DNA序列。與其他轉(zhuǎn)座系統(tǒng)相比，piggyBac轉(zhuǎn)座酶可以將兩個(gè)末端反向重復(fù)序列以及二者之間的序列精確插入基因組核酸序列為TTAA的位置，且不造成原位置的堿基增加或缺失。隨著對轉(zhuǎn)座子機(jī)理研究的不斷深入以及在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用的逐漸成熟，轉(zhuǎn)座子被越來越多的用于干細(xì)胞誘導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)移等動物細(xì)胞工程領(lǐng)域中。

快速高效的蛋白表達(dá)在科研和工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的需求。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)可以在兩周內(nèi)表達(dá)近克級別蛋白，然而其表達(dá)量通常遠(yuǎn)低于穩(wěn)定細(xì)胞群，而且其質(zhì)粒游離于基因組外的特點(diǎn)又限制了工作體積的放大，所以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染較難滿足較大規(guī)模的產(chǎn)品需求。傳統(tǒng)的穩(wěn)定細(xì)胞群構(gòu)建過程中，含有目標(biāo)蛋白的DNA序列隨機(jī)插入基因組中。此整合概率通常低于萬分之一，因此造成轉(zhuǎn)染后細(xì)胞群在抗生素篩選階段恢復(fù)緩慢。雖然傳統(tǒng)的穩(wěn)定細(xì)胞群表達(dá)量較高，然而其長達(dá)數(shù)月之久的構(gòu)建時(shí)間也很難適應(yīng)如今行業(yè)發(fā)展的需求。

現(xiàn)有技術(shù)中，也有報(bào)道利用其他轉(zhuǎn)座子構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞表達(dá)蛋白的方法，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，現(xiàn)有技術(shù)中采用Tol2轉(zhuǎn)座子的方法一般都需要一個(gè)月以上的時(shí)間才能構(gòu)建獲得穩(wěn)定細(xì)胞群，將該方法用于生產(chǎn)目標(biāo)蛋白仍然存在生產(chǎn)效率低下的缺陷。其他轉(zhuǎn)座子，如Sleeping Beauty,Tol2和Mos1在CHO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座效率均不及piggyBac。因此，本領(lǐng)域亟需一種利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)快速高效表達(dá)蛋白的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是制藥研發(fā)早起，對克級別蛋白的需求與日俱增。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)雖然表達(dá)周期短，但較低的表達(dá)量導(dǎo)致量產(chǎn)蛋白的難度較大。一般的穩(wěn)定細(xì)胞群雖然表達(dá)量較高，然而其長達(dá)數(shù)月的構(gòu)建周期難以跟上快速發(fā)展的生物制藥領(lǐng)域的需求。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種數(shù)周內(nèi)完成構(gòu)建高表達(dá)目標(biāo)蛋白的哺乳動物細(xì)胞群，并可直接用于放大生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該方法是利用piggyBac轉(zhuǎn)座子在CHO細(xì)胞中快速高效表達(dá)蛋白。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的利用piggyBac轉(zhuǎn)座子在CHO細(xì)胞中獲得快速高效表達(dá)目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞群的方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建含有編碼目標(biāo)蛋白基因和抗生素篩選基因的基因片段的質(zhì)粒，構(gòu)建含有piggyBac轉(zhuǎn)座子序列的質(zhì)粒；

2)將步驟1)中構(gòu)建的質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染同時(shí)引入CHO細(xì)胞中；

3)對步驟2)中轉(zhuǎn)染后細(xì)胞直接在搖瓶中進(jìn)行抗生素篩選；

4)將步驟3)篩選后的細(xì)胞每隔2～4天通過批次補(bǔ)料的方法生產(chǎn)目標(biāo)蛋白，整個(gè)穩(wěn)定細(xì)胞群構(gòu)建時(shí)間由原來的數(shù)月縮短至數(shù)天，優(yōu)選為一到兩周，一般一周的時(shí)間就可滿足大多數(shù)蛋白表達(dá)。

上述步驟1)，可將目標(biāo)蛋白序列構(gòu)建至含有抗生素基因的質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)座酶序列所在質(zhì)粒上無須含有抗生素基因。

具體的，目標(biāo)蛋白可以是抗體，融合蛋白，重組蛋白或者酶中任意一種。

具體的，抗生素篩選基因可以是嘌呤霉素，殺稻瘟菌素，博萊霉素或潮霉素等真核動物抗生素中任意一種或者幾種。

具體的，含有編碼目標(biāo)蛋白基因和抗生素篩選基因的基因片段的上游和下游分別有一個(gè)piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別的末端反向重復(fù)序列。

較佳的，若目標(biāo)蛋白包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄單元(如抗體的重鏈和輕鏈)，可將不同轉(zhuǎn)錄單元克隆至含有不同抗生素基因的載體中。

較佳的，待轉(zhuǎn)染宿主CHO細(xì)胞已經(jīng)過馴化，可在無血清條件下懸浮培養(yǎng)。

較佳的，步驟1)，使用去內(nèi)毒素的試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

較佳的，步驟2)，含有編碼目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒與含有轉(zhuǎn)座子序列的質(zhì)粒的推薦質(zhì)量比為10:1。

較佳的，步驟3)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)，向轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中加入等體積含有兩倍正常濃度篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基。

較佳的，步驟3)，每隔2～4天使用含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基傳代。

較佳的，步驟4)，待細(xì)胞活率恢復(fù)到90％左右，將步驟3)篩選后的細(xì)胞稀釋進(jìn)入生產(chǎn)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過批次補(bǔ)料的工藝表達(dá)目標(biāo)蛋白。

本發(fā)明利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)能夠整合質(zhì)粒DNA片段進(jìn)入基因組中的特性，實(shí)現(xiàn)了在CHO細(xì)胞中快速高效的表達(dá)蛋白。本發(fā)明的優(yōu)勢在于：1)采用本方法可以快速構(gòu)建表達(dá)目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定的細(xì)胞群，經(jīng)過抗生素篩選在一周時(shí)間即可構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞群，可以滿足絕大多數(shù)蛋白的表達(dá)。2)采用本方法獲得的穩(wěn)定細(xì)胞群可以高效的表達(dá)蛋白，在抗生素篩選一周后，最高可達(dá)近1克/升以上(如圖3所示)，而現(xiàn)有技術(shù)中對于相同目標(biāo)蛋白，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)量均僅為200毫克/升左右，本方法的蛋白表達(dá)量顯著提高。3)本方法的整個(gè)篩選周期在一到兩周時(shí)間達(dá)到最優(yōu)的效果，一般在兩周時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)較好的效果，從轉(zhuǎn)染到批次補(bǔ)料結(jié)束短至兩周半的方法。4)此方法操作簡便，整個(gè)周期和現(xiàn)有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染工藝相當(dāng)?shù)磉_(dá)量遠(yuǎn)高于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，可作為大體積瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的替代方案。由piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的細(xì)胞群篩選和體積放大可同步進(jìn)行，因此也無須像傳統(tǒng)穩(wěn)定細(xì)胞群一樣保存已構(gòu)建的細(xì)胞，省去了大量液氮存儲和管理的成本。另外，由于目標(biāo)蛋白穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，細(xì)胞表達(dá)量在數(shù)周內(nèi)穩(wěn)定，因此對于需要培養(yǎng)體積高達(dá)200L的蛋白生產(chǎn)，從轉(zhuǎn)染到批次補(bǔ)料結(jié)束也可以在一個(gè)月內(nèi)完成。

附圖說明

圖1是不同抗生素篩選時(shí)間對穩(wěn)定細(xì)胞群最終表達(dá)量的影響；

圖2是不同穩(wěn)定細(xì)胞群在抗生素篩選一周后的表達(dá)量；

圖3是細(xì)胞群表達(dá)量的穩(wěn)定性評估。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案的進(jìn)一步詳細(xì)描述如下：

實(shí)施例1

本實(shí)例利用piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建不同的穩(wěn)定細(xì)胞群，利用抗生素篩選2天、5天或7天后，進(jìn)行批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)表達(dá)蛋白，從而獲得合適的抗生素篩選時(shí)間。具體地說，包括以下步驟：

步驟1，將目標(biāo)蛋白的基因和抗生素基因克隆至含有一對piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別的末端反向重復(fù)序列之間。對于抗體或Fc融合蛋白等含有多個(gè)表達(dá)單元的目標(biāo)蛋白，可將不同表達(dá)單元克隆至含有不同抗生素基因的載體上。

步驟2，使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有轉(zhuǎn)座酶和目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒。所有質(zhì)粒不需要進(jìn)行酶切線性化。

步驟3，宿主細(xì)胞為已經(jīng)經(jīng)過懸浮馴化的CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天宿主細(xì)胞期望密度在3.5至4.5E6/毫升之間。

步驟4，對于編碼人IgG1抗體的細(xì)胞群A，將20微克含有抗體的質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒(二者質(zhì)量比為10:1)和60微克聚醚酰亞胺(Polyetherimide，縮寫為PEI)依次加入10毫升宿主細(xì)胞中，混勻后將搖管放回?fù)u床中。

步驟5，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)，向每管中加入10毫升含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基。抗生素種類根據(jù)步驟1中質(zhì)粒含有的抗生素基因選擇，抗生素濃度根據(jù)未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的殺傷曲線確定。此步驟加入的抗生素濃度為正常篩選培養(yǎng)基的抗生素濃度的二倍，使得加入篩選培養(yǎng)基后，最終抗生素濃度仍為正常篩選抗生素濃度。

步驟6，加壓后每隔2～4天使用含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基傳代，接種密度需要根據(jù)細(xì)胞活率和傳代時(shí)間做出相應(yīng)的調(diào)整。

步驟7，一周后，全部4組細(xì)胞活率可恢復(fù)至90％左右，將細(xì)胞按照統(tǒng)一接種密度稀釋進(jìn)入生產(chǎn)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。充分混勻后將細(xì)胞放入搖床中。

步驟8，根據(jù)細(xì)胞生長狀況，根據(jù)不同的細(xì)胞選擇適宜的補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。

對比例：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)(為現(xiàn)有技術(shù)，在此不贅述)，細(xì)胞群A的蛋白表達(dá)量為150mg/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。利用piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建細(xì)胞群的方法，在抗生素篩僅2天、5天或7天后，分別經(jīng)過批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，14天后可獲得蛋白表達(dá)量分別為112mg/L，207mg/L和285mg/L。其中，抗生素篩2天組可獲得的蛋白表達(dá)量就基本能夠達(dá)到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)量水平，抗生素篩5天組或7天組可獲得的蛋白表達(dá)量明顯高于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組。相比之下，本方法在一周之內(nèi)可構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞群，隨著篩選時(shí)間的增加，批次補(bǔ)料后的表達(dá)量也顯著增加。綜合權(quán)衡細(xì)胞群的構(gòu)建時(shí)間和表達(dá)量，篩選周期一周就可以滿足絕大多數(shù)蛋白表達(dá)。

實(shí)施例2

本實(shí)例利用piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建編碼人IgG1抗體的B、C、D、E四組不同的穩(wěn)定細(xì)胞群，利用抗生素篩選一周后，進(jìn)行批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)表達(dá)蛋白，記錄補(bǔ)料天數(shù)為10天和14天的蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)。具體地說，包括以下步驟：

步驟1，將目標(biāo)蛋白的基因和抗生素基因克隆至含有一對piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別的末端反向重復(fù)序列之間。對于抗體或Fc融合蛋白等含有多個(gè)表達(dá)單元的目標(biāo)蛋白，可將不同表達(dá)單元克隆至含有不同抗生素基因的載體上。

步驟2，使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有轉(zhuǎn)座酶和目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒。所有質(zhì)粒不需要進(jìn)行酶切線性化。

步驟3，宿主細(xì)胞為已經(jīng)經(jīng)過懸浮馴化的CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天宿主細(xì)胞期望密度在3.5至4.5E6/毫升之間。

步驟4，對于每個(gè)細(xì)胞群B～E，將20微克含有目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒(二者質(zhì)量比為10:1)和60微克聚醚酰亞胺(Polyetherimide，縮寫為PEI)依次加入10毫升宿主細(xì)胞中，混勻后將搖管放回?fù)u床中。

步驟5，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)，向每管中加入10毫升含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基?？股胤N類根據(jù)步驟1中質(zhì)粒含有的抗生素基因選擇，抗生素濃度根據(jù)未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的殺傷曲線確定。此步驟加入的抗生素濃度為正常篩選培養(yǎng)基的抗生素濃度的二倍，使得加入篩選培養(yǎng)基后，最終抗生素濃度仍為正常篩選抗生素濃度。

步驟6，加壓后每隔2～4天使用含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基傳代，接種密度需要根據(jù)細(xì)胞活率和傳代時(shí)間做出相應(yīng)的調(diào)整。

步驟7，一周后，全部4組細(xì)胞活率可恢復(fù)至90％左右，將細(xì)胞按照統(tǒng)一接種密度稀釋進(jìn)入生產(chǎn)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。充分混勻后將細(xì)胞放入搖床中。

步驟8，根據(jù)細(xì)胞生長狀況，根據(jù)不同的細(xì)胞選擇適宜的補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。

對比例：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)(為現(xiàn)有技術(shù)，在此不贅述)，細(xì)胞群B、C、D、E的蛋白表達(dá)量均在150～200mg/L之間。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。四組不同的細(xì)胞群，在抗生素篩選一周后，分別經(jīng)批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，記錄補(bǔ)料10天和補(bǔ)料14天后的蛋白表達(dá)量。其中，補(bǔ)料10天時(shí)，四組細(xì)胞群的蛋白表達(dá)量分別為121mg/L，91mg/L，104mg/L和146mg/L；補(bǔ)料14天時(shí)，四組細(xì)胞群的蛋白表達(dá)量分別為251mg/L，295mg/L，342mg/L和482mg/L，細(xì)胞群E的產(chǎn)量最高可達(dá)近500毫克/升。而對于相同目標(biāo)蛋白，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)量最高僅達(dá)到200毫克/升?？梢姴捎帽景l(fā)明的方法，其蛋白表達(dá)量明顯高于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。與此同時(shí)，對于可能進(jìn)行抗體藥物開發(fā)的候選蛋白來講，在產(chǎn)品質(zhì)量方面，利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞群生產(chǎn)的蛋白和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)品相比與日后產(chǎn)品更接近。和傳統(tǒng)的細(xì)胞群生產(chǎn)，此種方法在產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量相似的同時(shí)大幅縮短的周期。因此，利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株在許多藥物開發(fā)早期樣品制備方面較傳統(tǒng)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和傳統(tǒng)細(xì)胞群均有較大的優(yōu)勢。

實(shí)施例3

本實(shí)例通過評估利用piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞群表達(dá)量的穩(wěn)定性，來預(yù)估這種方法的適用生產(chǎn)體積。具體地說，包括以下步驟：

步驟1，將目標(biāo)蛋白的基因和抗生素基因克隆至含有一對piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別的末端反向重復(fù)序列之間。對于抗體或Fc融合蛋白等含有多個(gè)表達(dá)單元的目標(biāo)蛋白，可將不同表達(dá)單元克隆至含有不同抗生素基因的載體上。

步驟2，使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有轉(zhuǎn)座酶和目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒。所有質(zhì)粒不需要進(jìn)行酶切線性化。

步驟3，宿主細(xì)胞為已經(jīng)經(jīng)過懸浮馴化的CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天宿主細(xì)胞期望密度在1至2E6/毫升之間。

步驟4，對于編碼人IgG1抗體的細(xì)胞群F，將60微克含有目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒(二者質(zhì)量比為10:1)轉(zhuǎn)染進(jìn)入5毫升宿主細(xì)胞中，混勻后將搖管放回?fù)u床中。

步驟5，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)，向每管中加入5毫升含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基?？股胤N類根據(jù)步驟1中質(zhì)粒含有的抗生素基因選擇，抗生素濃度根據(jù)未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的殺傷曲線確定。此步驟加入的抗生素濃度為正常篩選培養(yǎng)基的抗生素濃度的二倍，使得加入篩選培養(yǎng)基后，最終抗生素濃度仍為正常篩選抗生素濃度。

步驟6，加壓后每隔2～4天使用含有篩選抗生素的傳代培養(yǎng)基傳代，接種密度需要根據(jù)細(xì)胞活率和傳代時(shí)間做出相應(yīng)的調(diào)整。

步驟7，抗生素篩選一周，兩周和三周后，分別將細(xì)胞按照特定的密度稀釋進(jìn)入生產(chǎn)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。充分混勻后將細(xì)胞放入搖床中。

步驟8，根據(jù)細(xì)胞生長狀況，根據(jù)不同的細(xì)胞選擇適宜的補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在抗生素篩選一周，兩周和三周后，細(xì)胞群F均通過批次補(bǔ)料放大生產(chǎn)14天，生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量依次為1.1克/升，1.9克/升和1.8克/升。結(jié)合傳代時(shí)體積的放大和表達(dá)量的穩(wěn)定性，抗生素篩選兩周后可滿足50升以上的批次補(bǔ)料生產(chǎn)。通過批次補(bǔ)料放大生產(chǎn)，對于需要培養(yǎng)體積高達(dá)200L的蛋白生產(chǎn)，從轉(zhuǎn)染到批次補(bǔ)料結(jié)束也可以在一個(gè)月內(nèi)完成。

綜上所述，上述各實(shí)施例及附圖僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，皆應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。