本發(fā)明屬于食品發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合風(fēng)味菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

醬油是我國的傳統(tǒng)調(diào)味品，是在各類微生物分泌的酶的作用下，通過一系列生化反應(yīng)，形成的具有氨基酸等營養(yǎng)成分以及獨(dú)特醬香風(fēng)味的產(chǎn)品。醬油釀造過程中，所用的相關(guān)微生物及其酶系作用對于醬油品質(zhì)的好壞具有決定性作用。目前我國醬油主要的發(fā)酵微生物是米曲霉，但隨著醬油工業(yè)化的發(fā)展，單一菌種發(fā)酵已經(jīng)無法生產(chǎn)出風(fēng)味濃郁的產(chǎn)品，因此醬油發(fā)酵微生物菌種的篩選及應(yīng)用成為了提升醬油發(fā)酵技術(shù)的主要途徑之一。

現(xiàn)代醬油發(fā)酵多采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝及封閉式的發(fā)酵設(shè)備，相較傳統(tǒng)、開放的工藝來說，可以有效地防止發(fā)酵過程中雜菌的污染，但也失去了部分自然接種帶來的對醬油發(fā)酵風(fēng)味有貢獻(xiàn)的微生物。目前醬油發(fā)酵中添加的風(fēng)味菌主要有酵母菌、乳酸菌等，其添加工藝比較隨意，難以發(fā)揮最優(yōu)的效果；有些風(fēng)味菌需經(jīng)自行擴(kuò)培后添加，由于風(fēng)味菌必須具備高耐鹽性，這使其擴(kuò)培工藝復(fù)雜，掌握不好往往還會(huì)出現(xiàn)菌量不達(dá)標(biāo)，嚴(yán)重影響添加效果。因此，選育醬油風(fēng)味菌，并根據(jù)其對風(fēng)味的提升作用研發(fā)生產(chǎn)直投式混配型醬油風(fēng)味菌劑，是增進(jìn)釀造醬油風(fēng)味、提升釀造醬油品質(zhì)、簡化混合菌種發(fā)酵工藝的有效途徑，這也是目前醬油混合菌種發(fā)酵工藝中的空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上背景技術(shù)中提到的不足和缺陷，提供一種復(fù)合風(fēng)味菌劑及其制備方法和在醬油增香中的直投式應(yīng)用，應(yīng)用后可以顯著提高醬油中的氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性風(fēng)味成分含量，使醬油醬香濃郁、品質(zhì)優(yōu)良，且應(yīng)用方式簡單方便。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種復(fù)合風(fēng)味菌劑，所述復(fù)合風(fēng)味菌劑主要由耐鹽枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌粉和耐鹽球擬酵母(Torulopsis halophilus)菌粉按1:1～1.4的質(zhì)量比混合配制而成。

上述的復(fù)合風(fēng)味菌劑，優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌菌粉是由保藏編號為CCTCC NO：M2015791的枯草芽孢桿菌菌株制成，該枯草芽孢桿菌菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，其命名為枯草芽孢桿菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO：M 2015791。該枯草芽孢桿菌CS1.03的保藏日期為2015年12月29日，保藏單位的地址位于中國湖北武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)。

上述優(yōu)選的枯草芽孢桿菌CS1.03是從傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)醬醪中分離篩選出一株獨(dú)特的優(yōu)勢菌。該枯草芽孢桿菌CS1.03的鑒定過程包括：對枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行16S rDNA序列鑒定分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)，鑒定此菌株為枯草芽孢桿菌種。

經(jīng)過我們的檢測分析，本發(fā)明的上述枯草芽孢桿菌CS1.03可以產(chǎn)高酶活的淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶以及乳酸等有機(jī)酸。我們創(chuàng)造性地將此菌株添加于醬油發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)可以有效改善發(fā)酵醬油的品質(zhì)問題，從而達(dá)到提升產(chǎn)品品質(zhì)、提高氨基氮含量及豐富醬油風(fēng)味的效果。

上述的復(fù)合風(fēng)味菌劑中，優(yōu)選的，所述耐鹽球擬酵母菌粉是由購于安琪酵母股份有限公司的耐鹽球擬酵母S4為原料制成。

在上述本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選的枯草芽孢桿菌CS1.03可以產(chǎn)高酶活的淀粉酶、蛋白酶，因此在醬油發(fā)酵前期中能夠促進(jìn)原料中蛋白質(zhì)及淀粉的降解，除降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有風(fēng)味能力的氨基酸外，還能降解淀粉產(chǎn)生大量的還原糖以及有機(jī)酸、酮類、酚類等物質(zhì)，還原糖及氨基酸在醬油發(fā)酵過程中能產(chǎn)生羰氨反應(yīng)，生成醬油的風(fēng)味成分及色澤。而我們特別配選的耐鹽球擬酵母S4具有良好的產(chǎn)乙醇能力及酯化能力，其發(fā)酵產(chǎn)物乙醇能在耐鹽球擬酵母S4的進(jìn)一步作用下與枯草芽孢桿菌CS1.03產(chǎn)生的有機(jī)酸很好的酯化形成具有濃郁香味的酯類物質(zhì)。同時(shí)枯草芽孢桿菌CS1.03及耐鹽球擬酵母S4對4-乙基愈創(chuàng)木酚等醬油特征風(fēng)味物質(zhì)的形成均有十分重要的貢獻(xiàn)。我們經(jīng)過反復(fù)篩選、對比和試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩種菌株的復(fù)配具有協(xié)同作用，同時(shí)添加這兩種菌株發(fā)酵能夠明顯地提升醬油品質(zhì)。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的復(fù)合風(fēng)味菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將耐鹽枯草芽孢桿菌和耐鹽球擬酵母進(jìn)行菌體高鹽高密度擴(kuò)大培養(yǎng)，得到高濃度的耐鹽枯草芽孢桿菌菌液和耐鹽球擬酵母菌液；

(2)在步驟(1)所得的耐鹽枯草芽孢桿菌菌液和耐鹽球擬酵母菌液中分別加入保護(hù)劑；

(3)將步驟(2)所得的耐鹽枯草芽孢桿菌菌液和耐鹽球擬酵母菌液進(jìn)行噴霧干燥，得到耐鹽枯草芽孢桿菌菌粉和耐鹽球擬酵母菌粉；

(4)將步驟(3)所得的耐鹽枯草芽孢桿菌菌粉和耐鹽球擬酵母菌粉按質(zhì)量比混合后，得到復(fù)合風(fēng)味菌劑。

上述的制備方法，優(yōu)選的：所述步驟(1)中，耐鹽枯草芽孢桿菌菌液的具體制備包括：接種4％～5％對數(shù)期的所述耐鹽枯草芽孢桿菌至一枯草芽孢桿菌高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基中，在35℃～38℃下震蕩培養(yǎng)(優(yōu)選100-300r/min)50～56h，直至培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到1.4～2.5×10⁹CFU/mL；

所述枯草芽孢桿菌高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：0.3％～0.4％牛肉膏、0.8％～1％蛋白胨、0.1％～0.2％蔗糖、0.2％～0.5％磷酸氫二鉀、0.05％～0.1％硫酸鎂和18％～20％氯化鈉，pH6.8～7.0。

上述的制備方法，優(yōu)選的：所述步驟(1)中，耐鹽球擬酵母菌液的具體制備包括：接種4％～5％對數(shù)期的所述耐鹽球擬酵母至一耐鹽球擬酵母高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基中，在26℃～30℃下震蕩培養(yǎng)(優(yōu)選100-300r/min)48～55h，直至培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到2.0～2.8×10⁹CFU/mL；

所述耐鹽球擬酵母高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：4％～4.5％葡萄糖、1.5％～2％玉米漿、1％～1.5％酵母膏、0.2％～0.5％磷酸氫二鉀、0.05％～0.1％硫酸鎂和18％～20％氯化鈉，pH6.5～7.0。

上述的制備方法，優(yōu)選的：所述步驟(2)中，所述保護(hù)劑包含脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、低聚果糖和甘油：且前述四種組分在菌液中的添加量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)分別為4.5％～5％、4.5％～5％、3.5％～4％和1.5％～2％。

上述的制備方法，優(yōu)選的：所述步驟(3)中，噴霧干燥的具體工藝條件包括：進(jìn)口溫度120℃～130℃，入料流量15mL/min，壓力0.2MPa，熱風(fēng)流量30M³/h，出口溫度65℃～78℃。

上述的制備方法，優(yōu)選的：所述步驟(3)中，經(jīng)噴霧干燥后得到的耐鹽枯草芽孢桿菌菌粉中的活菌數(shù)為1.1～1.5×10⁹CFU/g，所述耐鹽球擬酵母菌粉的活菌數(shù)為1.2～1.5×10⁹CFU/g。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述本發(fā)明的復(fù)合風(fēng)味菌劑在醬油增香中的應(yīng)用，應(yīng)用時(shí)無需對復(fù)合風(fēng)味菌劑進(jìn)行活化，直接投入到醬油發(fā)酵液中使用。具體優(yōu)選的，該復(fù)合風(fēng)味菌劑是在高鹽稀態(tài)法醬油發(fā)酵的1/3期加入，添加量為1.0～1.5g/Kg原料，無需活化，直接加入醬醪中攪拌均勻發(fā)酵。

在上述本發(fā)明的應(yīng)用中，我們通過對添加復(fù)合菌劑發(fā)酵的醬油和普通發(fā)酵醬油進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量測定以及感官評定和電子鼻分析，結(jié)果表明添加本發(fā)明復(fù)合菌劑發(fā)酵后的醬油氨基酸態(tài)氮含量、感官評分以及醬香風(fēng)味物質(zhì)均高于普通醬油，尤其是醬油風(fēng)味有了十分明顯的提升。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明的復(fù)合風(fēng)味菌劑中的活菌數(shù)量多，無需活化，可直接在醬油發(fā)酵中使用，省去了添加菌種發(fā)酵的擴(kuò)大培養(yǎng)環(huán)節(jié)，使用簡單方便。

(2)本發(fā)明將風(fēng)味菌制作成復(fù)合菌劑后，還能有效防止菌種老化、退化，有利于保持風(fēng)味菌的活力。

(3)使用本發(fā)明的復(fù)合風(fēng)味菌劑后，能明顯提高發(fā)酵醬油中氨基酸態(tài)氮、風(fēng)味物質(zhì)等含量，提升醬油品質(zhì)，改進(jìn)高鹽稀態(tài)工藝中菌種單一帶來的風(fēng)味不足的缺點(diǎn)，也易于控制生產(chǎn)工藝，保證產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定。

生物材料保藏情況說明

本發(fā)明涉及的保藏生物材料為一株枯草芽孢桿菌菌株，該枯草芽孢桿菌菌株被命名為枯草芽孢桿菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO：M 2015791，保藏單位的地址位于中國湖北武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)。該枯草芽孢桿菌CS1.03的保藏日期為2015年12月29日。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03接種培養(yǎng)24h后的平板圖照片。

圖2為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03的革蘭氏染色圖。

圖3為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03的淀粉水解試驗(yàn)圖。

圖4為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03分子學(xué)鑒定試驗(yàn)中16S rDNA序列片段的電泳圖。

圖5為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03分子學(xué)鑒定試驗(yàn)中的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖6為本發(fā)明復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵制得的醬油與對照組醬油的氨基酸態(tài)氮含量結(jié)果對比圖。

圖7為本發(fā)明復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵制得的醬油與對照組醬油的感官評價(jià)結(jié)果對比圖。

圖8為本發(fā)明復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵制得的醬油雷達(dá)圖。

圖9為未添加本發(fā)明復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵制得的對照組醬油雷達(dá)圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實(shí)施例對本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體的實(shí)施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

實(shí)施例：

一、復(fù)合風(fēng)味菌劑產(chǎn)品

一種本發(fā)明的復(fù)合風(fēng)味菌劑，其主要由耐鹽枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌粉和耐鹽球擬酵母菌粉按1:1的質(zhì)量比混合配制而成。其中的枯草芽孢桿菌菌粉是由保藏編號為CCTCC NO：M 2015791的枯草芽孢桿菌菌株制成，其中的耐鹽球擬酵母菌粉是由購于安琪酵母股份有限公司的耐鹽球擬酵母S4為原料制成。

本實(shí)施例中選用的枯草芽孢桿菌菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，其命名為枯草芽孢桿菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO：M 2015791。該枯草芽孢桿菌CS1.03的保藏日期為2015年12月29日，保藏單位的地址位于中國湖北武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)。

該菌株的鑒定過程如下：

將從傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)醬醪中分離篩選出一株獨(dú)特的枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行鑒定，其過程包括：對枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)，初步確定為芽孢桿菌屬；再對枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行16S rDNA序列鑒定分析(鑒定結(jié)果見說明書后所附序列表)，確證此菌株為枯草芽孢桿菌種。

1.形態(tài)學(xué)鑒定

(1)將枯草芽孢桿菌CS1.03接種于高鹽牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，32℃培養(yǎng)24h后(參見圖1)，菌落表面干燥，有褶皺狀突起。

(2)對枯草芽孢桿菌CS1.03菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察菌株形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)此菌為革蘭氏陽性菌(參見圖2)，有芽孢，菌體個(gè)體形態(tài)呈桿狀，大小約為0.5×2μm～0.5×3μm。

上述的高鹽牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備步驟為：準(zhǔn)備5g牛肉膏，10g蛋白胨，180g氯化鈉，15-20g瓊脂，1000mL蒸餾水，pH 7.0；121℃滅菌30min。

2.生理生化特征試驗(yàn)研究

(1)進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)和V.P.試驗(yàn)，結(jié)果如下表1所示，該試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌CS1.03產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，產(chǎn)過氧化氫酶，V.P.試驗(yàn)為陽性；符合芽孢桿菌的特征。

表1 枯草芽孢桿菌CS1.03的大分子試驗(yàn)結(jié)果

注：+代表結(jié)果呈陽性；-代表結(jié)果呈陰性。

上述葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備步驟包括：準(zhǔn)備1.0g磷酸氫二銨、0.2g氯化鉀、0.2g硫酸鎂、0.2g酵母膏、0.008g溴甲酚紫和1000mL蒸餾水，pH自然；121℃滅菌30min；滅菌后加入5g葡萄糖。

上述V.P.試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備步驟包括：準(zhǔn)備7g蛋白胨，5g葡萄糖，5g氯化鈉，1000mL蒸餾水，pH自然；121℃滅菌30min。

(2)進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)，如圖3所示，通過透明圈的大小判斷出本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03的淀粉酶酶活高。

上述淀粉水解培養(yǎng)基的制備步驟包括：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1％的可溶性淀粉；121℃滅菌30min。

(3)進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)，結(jié)果如下表2所示，由表2可以看出，本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03可以耐受18％(w/v)的NaCl濃度，適宜在高鹽發(fā)酵中應(yīng)用。

表2 枯草芽孢桿菌CS1.03的耐鹽性試驗(yàn)

注：+代表能夠生長；++代表生長狀況較好；+++代表生長狀況良好。

上述耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備步驟包括：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同質(zhì)量的氯化鈉即可。

3.分子學(xué)鑒定

(1)引物設(shè)計(jì)：采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)如下：

Forward primer：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Reverse primer：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

兩引物間距離約為1500bp。

(2)DNA模板制備：從培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌CS1.03斜面挑取少量菌體于50μL菌落PCR模板提取緩沖體系中，80℃變性15min，4000r/min離心10～15min，取上清液作為模板。

(3)PCR獲取16S rDNA片段：

反應(yīng)體系：50uL反應(yīng)體系中共含有PCR Premix 25μL，F(xiàn)orward primer(20pmol/uL)0.5μL，Reverse primer(20pmol/uL)0.5μL，模板1μL，16S-free H₂O 23μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min；變性94℃1min、退火55℃1min、延伸72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

(4)電泳：采用瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果。

電泳條件：90V恒壓，時(shí)間20-30min，結(jié)果見圖4。

(5)16S rDNA序列測序

該枯草芽孢桿菌CS1.03的16S rDNA基因序列測定結(jié)果如后附的序列表1。

(6)測序結(jié)果比對

測序結(jié)果通過GenBank中的Blast搜索數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列的同源性比較分析，并用MAGE4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌CS1.03與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的親緣關(guān)系最近(登錄號：GQ305125.1)，相似度為100％。

二、復(fù)合風(fēng)味菌劑的制備

一種上述本實(shí)施例的復(fù)合風(fēng)味菌劑的制備方法，包括以下步驟：

1.將耐鹽枯草芽孢桿菌和耐鹽球擬酵母進(jìn)行菌體高鹽高密度擴(kuò)大培養(yǎng)，得到高濃度的耐鹽枯草芽孢桿菌菌液和耐鹽球擬酵母菌液。

1.1上述耐鹽枯草芽孢桿菌菌液的具體制備包括：接種5％對數(shù)期的上述枯草芽孢桿菌CS1.03至一枯草芽孢桿菌高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基中，在35℃下震蕩培養(yǎng)(200r/min)55h，直至培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到2.1×10⁹CFU/mL；

上述枯草芽孢桿菌高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、0.2％蔗糖、0.5％磷酸氫二鉀、0.1％硫酸鎂和20％氯化鈉，pH6.8。

1.2上述耐鹽球擬酵母菌液的具體制備包括：接種5％對數(shù)期的上述耐鹽球擬酵母S4(購于安琪酵母股份有限公司)至一耐鹽球擬酵母高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基中，在28℃下震蕩培養(yǎng)(200r/min)50h，直至培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到2.3×10⁹CFU/mL；

上述耐鹽球擬酵母高鹽高密度擴(kuò)培培養(yǎng)基包含以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：4％葡萄糖、2％玉米漿、1％酵母膏、0.5％磷酸氫二鉀、0.1％硫酸鎂和20％氯化鈉，pH6.5。

2.在上述步驟1制得的耐鹽枯草芽孢桿菌菌液和耐鹽球擬酵母菌液中分別加入保護(hù)劑。保護(hù)劑包含脫脂奶粉、β-環(huán)糊精、低聚果糖和甘油：且前述四種組分在菌液中的添加量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)分別為5％、5％、3.5％和1.5％。

3.將上述步驟2制得的耐鹽枯草芽孢桿菌菌液和耐鹽球擬酵母菌液進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥的具體工藝條件包括：進(jìn)口溫度120℃，入料流量15mL/min，壓力0.2MPa，熱風(fēng)流量30M³/h，出口溫度65～78℃，得到耐鹽枯草芽孢桿菌菌粉和耐鹽球擬酵母菌粉。經(jīng)噴霧干燥后得到的耐鹽枯草芽孢桿菌菌粉中的活菌數(shù)為1.4×10⁹CFU/g，耐鹽球擬酵母菌粉的活菌數(shù)為1.3×10⁹CFU/g。

4.將上述步驟3所得的耐鹽枯草芽孢桿菌菌粉和耐鹽球擬酵母菌粉按1:1的質(zhì)量比混合后，得到直投式醬油增香復(fù)合風(fēng)味菌劑，真空封口包裝。

三、復(fù)合風(fēng)味菌劑的應(yīng)用

經(jīng)檢測分析，本實(shí)施例的上述枯草芽孢桿菌CS1.03可以產(chǎn)高酶活的淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶以及乳酸等有機(jī)酸。耐鹽球擬酵母菌在醬油過程中產(chǎn)生醇和酯類等與醬油風(fēng)味及其相關(guān)的物質(zhì)，對醬油獨(dú)特風(fēng)味的形成有十分重要的貢獻(xiàn)。我們創(chuàng)造性地將上述兩種菌株制作成復(fù)合風(fēng)味菌劑，并添加于醬油發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)可以有效改善發(fā)酵醬油的品質(zhì)，從而達(dá)到提升產(chǎn)品品質(zhì)、提高氨基氮含量及豐富醬油風(fēng)味的效果。

本發(fā)明的復(fù)合風(fēng)味菌劑在高鹽稀態(tài)法醬油發(fā)酵的1/3期加入，添加量為1.0～1.5g/Kg原料，無需活化，直接與醬醪攪拌均勻發(fā)酵。

氨基酸態(tài)氮含量分析：取添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵的醬油原油和未添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵的醬油原油進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量測定，測定方法參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.39-2003中的4.2.1，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵的醬油氨基酸態(tài)氮的含量比未添加的普通發(fā)酵醬油高23.0％。

感官評價(jià)分析：感官評價(jià)根據(jù)食品感官評定的基本原則，設(shè)計(jì)邀請十個(gè)不同地域、性別、年齡的人分別對醬油的色、香、味、體按100分制進(jìn)行品評并打分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵醬油和對照組醬油品評平均分?jǐn)?shù)見圖7。結(jié)果表明，添加復(fù)合風(fēng)味菌劑后的醬油感官評價(jià)明顯優(yōu)于未添加的普通發(fā)酵醬油，提升了39.0％。

表3：醬油毛油的品評原則

電子鼻檢測分析：對添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵醬油和對照組醬油進(jìn)行電子鼻檢測分析，在測試過程中，3、4、5、10號傳感器不靈敏，除去不靈敏的傳感器，結(jié)果如圖8、圖9。從圖8和圖9中可以看出，相比于對照組醬油，添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵醬油的芳烴化合物(1號傳感器)、烷類物質(zhì)(6號傳感器)、醇類物質(zhì)(8號傳感器)明顯增多，這三類物質(zhì)都是醬油風(fēng)味的有利物質(zhì)，尤其是醇類物質(zhì)，其含量的增加能夠使醬油具有更好的風(fēng)味。此外，添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵醬油的硫化物等不利風(fēng)味物質(zhì)(7、9號傳感器)相比于對照組醬油有明顯的降低。綜合分析，添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵醬油中有利風(fēng)味物質(zhì)高于對照組醬油，不利風(fēng)味物質(zhì)低于對照組物質(zhì)，所以添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵的醬油風(fēng)味優(yōu)于對照組醬油。

上述各項(xiàng)檢測結(jié)果表明，復(fù)合風(fēng)味菌劑能夠有效的提升醬油中的有利風(fēng)味物質(zhì)含量，同時(shí)抑制不利風(fēng)味物質(zhì)的生成，對醬油品質(zhì)的提高和風(fēng)味的提升具有明顯的作用。

　　<110> 長沙理工大學(xué) 加加食品集團(tuán)股份有限公司

　　<120> 一種復(fù)合風(fēng)味菌劑及其制備方法和在醬油增香中的直投式應(yīng)用

　　<160> 3

　　<210> 1

　　<211> 1464bp

　　<212> DNA

　　<213> 枯草芽孢桿菌

　　<400> 1

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

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caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

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tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440

ccgaaggtgg gacagatgat tggg 1464

　　<210> 2

　　<211> 20bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 2

　　Agagtttgat cctggctcag 20

　　<210> 3

　　<211> 20bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 2

　　aaggaggtga tccagccgca 20