本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
由于各種原因?qū)е碌难荔w缺損和牙齒缺失，已成為危害口腔乃至人體健康的主要疾病，其發(fā)病率逐年增加。目前，主要是借助于各種牙科材料充填來(lái)應(yīng)對(duì)牙齒缺損疾病，雖然在一定程度上能阻止病變的繼續(xù)發(fā)展，但卻不能解決根本問(wèn)題。對(duì)于牙齒缺失盡管解決途徑很多，但最有效和最根本的辦法還是牙齒生物性再生。
隨著組織再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，為牙體缺損和牙齒缺失的有效治療帶來(lái)了希望。目前已有許多研究利用牙源性上皮和牙源性間充質(zhì)的相互作用再生出了牙齒組織。常用的牙源性間充質(zhì)包括牙乳頭細(xì)胞和牙髓組織細(xì)胞。由于牙乳頭細(xì)胞在臨床上難以獲得，因此，目前用于牙體及牙齒再生的種子細(xì)胞首選是牙髓組織來(lái)源的細(xì)胞，其中最重要的是牙髓干細(xì)胞。
中國(guó)專利申請(qǐng)CN104711219A公開(kāi)了一種牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM，1L培養(yǎng)基中含有SITE100*，抗壞血酸200-400mM，SITE為細(xì)胞生長(zhǎng)必需的組份，抗壞血酸和纖連蛋白有助于牙髓干細(xì)胞形成細(xì)胞外基質(zhì)，利于牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)，含有PDGF1-10ug，氫化可的松1-10ug，EGF1-5ng，b-FGF1-5ng，PTH50-200ng，地塞米松1-20mM。
臨床使用牙髓干細(xì)胞的前提是對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行大量的擴(kuò)增，現(xiàn)有的擴(kuò)增方法最常規(guī)的是使用添加10％胎牛血清的培養(yǎng)基，臨床使用含動(dòng)物源的培養(yǎng)基不僅會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，異源病毒感染，而且采用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞，生長(zhǎng)比較緩慢，在傳代超過(guò)5次之后其分化功能細(xì)胞的潛能會(huì)大大降低。雖然，已經(jīng)研發(fā)出不含血清的培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，但是價(jià)格昂貴。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基成分明確且價(jià)格較低，不含有胎牛血清及不含任何動(dòng)物來(lái)源成份，安全性高，能夠顯著提高牙髓細(xì)胞的擴(kuò)增速度，且不影響牙髓干細(xì)胞的多向分化能力。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子3-5μg/L，羧甲基殼聚糖2-4g/L，過(guò)氧化氫酶5-8mg/L，硫辛酸0.14-0.18mg/L，輔酶Q10 0.3-0.6μM，層粘連蛋白15-25μg/L，亞麻酸2-5μM，煙酰胺8-14μM，牛磺酸2-4mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子2-6μg/L，氯化膽堿70-80μM，薯蕷皂苷元0.5-2mg/L。
一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，優(yōu)選的方案是，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子4μg/L，羧甲基殼聚糖3g/L，過(guò)氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，?；撬?mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子5μg/L，氯化膽堿76μM，薯蕷皂苷元1.4mg/L。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM或F12培養(yǎng)基。
另外，本發(fā)明還提供了培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、?；撬?、血小板衍生生長(zhǎng)因子和氯化膽堿，攪拌20-40分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續(xù)攪拌30-40分鐘，靜置1-3小時(shí)，加入過(guò)氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.8-7.1，用0.2-0.25微米濾膜過(guò)濾除菌，即得。
優(yōu)選地，所述步驟S1攪拌30分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S1繼續(xù)攪拌35分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S1靜置2小時(shí)。
優(yōu)選地，所述步驟S1調(diào)節(jié)步驟S2所得混合物的pH至7.0。
優(yōu)選地，所述步驟S2用0.23微米濾膜過(guò)濾除菌。
本發(fā)明培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括表皮生長(zhǎng)因子、羧甲基殼聚糖、氯化膽堿和薯蕷皂苷元等。本發(fā)明培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基中各成分協(xié)同作用，能夠顯著提高牙髓干細(xì)胞的擴(kuò)增速度，且不影響牙髓干細(xì)胞的多向分化能力。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)本發(fā)明提供的培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基成分明確且價(jià)格較低。
(2)本發(fā)明提供的培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基不含有胎牛血清及不含任何動(dòng)物來(lái)源成份，安全性高。
(3)本發(fā)明提供的培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基能夠顯著提高牙髓細(xì)胞的擴(kuò)增速度，且不影響牙髓干細(xì)胞的多向分化能力。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所用羧甲基殼聚糖可購(gòu)自浙江澳興生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基可購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基可購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，薯蕷皂苷元可購(gòu)自西安通澤生物科技有限公司。
實(shí)施例1、一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子3μg/L，羧甲基殼聚糖2g/L，過(guò)氧化氫酶5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，輔酶Q10 0.3μM，層粘連蛋白15μg/L，亞麻酸2μM，煙酰胺8μM，?；撬?mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子2μg/L，氯化膽堿70μM，薯蕷皂苷元0.5mg/L。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、?；撬?、血小板衍生生長(zhǎng)因子和氯化膽堿，攪拌20分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續(xù)攪拌30分鐘，靜置1小時(shí)，加入過(guò)氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.8，用0.2微米濾膜過(guò)濾除菌，即得。
實(shí)施例2、一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子5μg/L，羧甲基殼聚糖4g/L，過(guò)氧化氫酶8mg/L，硫辛酸0.18mg/L，輔酶Q10 0.6μM，層粘連蛋白25μg/L，亞麻酸5μM，煙酰胺14μM，?；撬?mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子6μg/L，氯化膽堿80μM，薯蕷皂苷元2mg/L。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、牛磺酸、血小板衍生生長(zhǎng)因子和氯化膽堿，攪拌40分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續(xù)攪拌40分鐘，靜置3小時(shí)，加入過(guò)氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至7.1，用0.25微米濾膜過(guò)濾除菌，即得。
實(shí)施例3、一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子4μg/L，羧甲基殼聚糖3g/L，過(guò)氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，?；撬?mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子5μg/L，氯化膽堿76μM，薯蕷皂苷元1.4mg/L。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、?；撬帷⒀“逖苌L(zhǎng)因子和氯化膽堿，攪拌30分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續(xù)攪拌35分鐘，靜置2小時(shí)，加入過(guò)氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至7.0，用0.23微米濾膜過(guò)濾除菌，即得。
對(duì)比例1、一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子4μg/L，水溶性殼聚糖3g/L，過(guò)氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，?；撬?mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子5μg/L，氯化膽堿76μM，薯蕷皂苷元1.4mg/L。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將羧甲基殼聚糖替換為水溶性殼聚糖。
對(duì)比例2、一種培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：表皮生長(zhǎng)因子4μg/L，羧甲基殼聚糖3g/L，過(guò)氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，?；撬?mg/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子5μg/L，氯化膽堿76μM，葫蘆素B 1.4mg/L。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將薯蕷皂苷元替換為葫蘆素B。
試驗(yàn)例一、本發(fā)明培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)效果
1、受試培養(yǎng)基：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基。
2、培養(yǎng)干細(xì)胞來(lái)源：來(lái)源于牙髓的牙髓干細(xì)胞。
3、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
用無(wú)菌鑷子夾取牙髓組織，切除根尖部1mm的牙髓組織；用眼科彎剪將牙髓組織剪成1mm3，置于50mL離心管中，加入13mL的組織消化液，封口后充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至恒溫空氣搖床中，37℃、200rpm消化15min；加入等體積的培養(yǎng)基反復(fù)吹打離散細(xì)胞團(tuán)塊，通過(guò)70μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，2000rpm離心3min；利用PBS清洗1～2次，沉淀用培養(yǎng)基重懸，以5×103個(gè)/mL接種培養(yǎng)皿中，混勻細(xì)胞懸液，放于37℃、濕度為95％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24小時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)一次細(xì)胞數(shù)量。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
用本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，與對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)以及培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和5天的細(xì)胞數(shù)量如表1所示。
表1：不同培養(yǎng)基對(duì)牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量
由表1可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，生長(zhǎng)在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基中牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量，明顯大于生長(zhǎng)在對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基中牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。這說(shuō)明，本發(fā)明培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以明顯促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖，本發(fā)明培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果好。
試驗(yàn)例二、對(duì)增殖后的牙髓干細(xì)胞體外分化為成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，成脂肪細(xì)胞的潛能分析影響實(shí)驗(yàn)
1、受試培養(yǎng)基：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基。
2、培養(yǎng)干細(xì)胞來(lái)源：來(lái)源于牙髓的牙髓干細(xì)胞。
3、體外細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)
將細(xì)胞傳代擴(kuò)增至P10代，使用LONZA的成脂，成骨，成軟骨檢測(cè)試劑盒對(duì)P10代牙髓干細(xì)胞進(jìn)行分化檢測(cè)。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)的牙髓干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的比率在85％以上。而對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)的牙髓干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的比率在65％。因此，本發(fā)明所得培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以有效的保持牙髓干細(xì)胞的多向分化能力。