破骨細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法和培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法與流程

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種破骨細(xì)胞培養(yǎng)基、其制備方法和培養(yǎng)破骨細(xì)胞方法。

背景技術(shù)：

人體的骨組織中含有成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，共同負(fù)責(zé)完成骨吸收和骨形成兩個(gè)骨重塑過(guò)程，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡。破骨細(xì)胞是主要的骨吸收細(xì)胞，來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，由骨髓中的多個(gè)單核巨噬細(xì)胞融合而成。破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的增加與多種骨質(zhì)流失的臨床疾病密切相關(guān)，包括骨質(zhì)疏松、慢性腎臟病并發(fā)的礦物質(zhì)和骨代謝紊亂；破骨細(xì)胞還主導(dǎo)骨移植物的骨吸收作用和炎癥性骨丟失等。這些疾病及其引發(fā)的骨折將嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。因此，為了在礦物質(zhì)和骨代謝紊亂的發(fā)病機(jī)制與治療方面尋求突破，破骨細(xì)胞成為相關(guān)研究的重點(diǎn)。隨著時(shí)間的推移和科技的進(jìn)步，破骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法也日新月異。

破骨細(xì)胞主要分布于骨質(zhì)表面與骨內(nèi)血管通道周圍的小陷窩內(nèi)。破骨細(xì)胞主要的生理功能是溶解與吸收骨質(zhì)，參與骨組織的重建和維持血鈣的動(dòng)態(tài)平衡。由于破骨細(xì)胞獨(dú)特的功能，對(duì)破骨細(xì)胞的研究在闡明骨代謝性疾病的病理生理機(jī)制以及為疾病診療提供新方法中具有至關(guān)重要的意義。然而，破骨細(xì)胞是高代謝終末分化細(xì)胞，具有不能傳代、存活時(shí)間短等特點(diǎn)，且破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量極少，難以分離獲得。

目前，破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有：機(jī)械分離法、骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法、脾臟造血干細(xì)胞培養(yǎng)法以及血液?jiǎn)魏思?xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)法等；這些方法不可避免都要使用培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，且不同的階段采用不同配方的培養(yǎng)液進(jìn)行，目前常見(jiàn)的原代細(xì)胞培養(yǎng)液多為含有血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)過(guò)程中則選擇添加誘導(dǎo)劑促使破骨細(xì)胞分化。然而，現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中所用的誘導(dǎo)劑單一簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞的效果并不理想，因此，提供一種可高效獲得破骨細(xì)胞的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于體外培養(yǎng)制備破骨細(xì)胞的培養(yǎng)基，以期通過(guò)改良培養(yǎng)基的組成從而提高破骨細(xì)胞的得率，為大量獲得破骨細(xì)胞提供保障。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述培養(yǎng)基的制備方法，以實(shí)現(xiàn)該培養(yǎng)基的快速制備。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種利用所述的培養(yǎng)基制備破骨細(xì)胞的方法，該方法合理利用培養(yǎng)基，在不同的階段采用不同的培養(yǎng)基，通過(guò)前期的提取純化培養(yǎng)以及后續(xù)的誘導(dǎo)培養(yǎng)體外制備破骨細(xì)胞，簡(jiǎn)化了體外制備破骨細(xì)胞的流程。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種破骨細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括：骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基；其中，所述骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基為含有巨噬細(xì)胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％體積分?jǐn)?shù)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有20-70ng/mL RANKL、10-40ng/mL M-CSF、0.1-1μm/mL 1,25(OH)₂D₃、2-5ng/mL甲狀旁腺激素、6-10ng/mL白細(xì)胞介素、2-8ng/ml腫瘤壞死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基含有骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該兩種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)組分均為細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并且用于破骨細(xì)胞不同制備階段細(xì)胞的培養(yǎng)，較為特殊的是，在骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基中加入了特定含量的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和血清，M-CSF是一種具有譜系特異性的細(xì)胞因子。M-CSF為鏈間二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，其對(duì)單核細(xì)胞的增殖、分化及維持其活性有重要促進(jìn)作用，其次其在培養(yǎng)基中濃度選擇合理，為骨髓間質(zhì)單核細(xì)胞的大量增殖提供了先決條件，另外，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，14-16％體積分?jǐn)?shù)的血清對(duì)于形成體積大，胞漿豐滿，細(xì)胞突起延展，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形的培養(yǎng)細(xì)胞具有重要的促進(jìn)作用。

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，本發(fā)明創(chuàng)造性地加入了RANKL、M-CSF、1,25(OH)₂D₃、甲狀旁腺激素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松等誘導(dǎo)因子，而且對(duì)各誘導(dǎo)因素在培養(yǎng)液中的濃度進(jìn)行了限定，各誘導(dǎo)因子在協(xié)同的作用下，活使得經(jīng)過(guò)前期培養(yǎng)獲得的骨髓間質(zhì)細(xì)胞能夠大量地分化為破骨細(xì)胞，進(jìn)而提高了破骨細(xì)胞的得率。

可選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液包括α-MEM培養(yǎng)液，DMEM，RPMI-1640，F(xiàn)12，M199，DMEM/F12中的一種或幾種。

為了提供本發(fā)明的培養(yǎng)基的應(yīng)用效果，基礎(chǔ)培養(yǎng)液可以采用上述所列的多種成熟培養(yǎng)液，其中，綜合考慮培養(yǎng)效果，以α-MEM培養(yǎng)液為優(yōu)選基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在另一優(yōu)選的方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM，RPMI-1640，F(xiàn)12，M199，DMEM/F12等體積的混合物。

可選的，所述血清為胎牛血清、馬血清和羊血清中的一種或幾種。

血清是很復(fù)雜的混合物,其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。

上述所列血清的主要成份有:

①蛋白質(zhì)：是血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白、球蛋白。纖維粘連素細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞附著；血清中巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；胎球蛋白促細(xì)胞附著；轉(zhuǎn)鐵蛋白能結(jié)合鐵離子，減少其毒性和被細(xì)胞利用。

②多肽：血小板促生長(zhǎng)因子能促細(xì)胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細(xì)胞增殖因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，血清中含量雖很少，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有一定作用。

③激素：激素對(duì)細(xì)胞的作用是多方面的，胰島素促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細(xì)胞分裂有關(guān)。類胰島素生長(zhǎng)因子能與細(xì)胞表達(dá)的胰島素受體結(jié)合，從而有胰島素同樣的作用。促生長(zhǎng)激素能夠促細(xì)胞增殖效應(yīng)。血清中含有定量的氫化可的松，它可能兼有促細(xì)胞貼附和增殖作用。

可選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，還含有體積分?jǐn)?shù)占8-9％的胎牛血清。

基于上述血清對(duì)細(xì)胞增殖所具備的促進(jìn)作用，本申請(qǐng)中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中也優(yōu)選加入體積分?jǐn)?shù)占8-9％的胎牛血清，鑒于細(xì)胞密度高時(shí)，血清中的氫化可的松可能有抑制細(xì)胞的作用和誘導(dǎo)其發(fā)生分化，因此，本申請(qǐng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所加入的胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為8-9％。

可選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述白細(xì)胞介素包括白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6。

可選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述白細(xì)胞介素-1與所述白細(xì)胞介素-6的濃度比為1-3。

白細(xì)胞介素的種類繁多，且功能非常復(fù)雜，在本申請(qǐng)中，優(yōu)選白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6，該兩種白細(xì)胞介素(尤其是其濃度比為1-3)時(shí)，可與誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的其他誘導(dǎo)因素產(chǎn)生協(xié)同效果，共同促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。

上述的破骨細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

配制基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中先加入既定體積分?jǐn)?shù)的血清，然后再加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子，使其濃度為10-40μg/L，得到骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基；

在另一基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)₂D₃、甲狀旁腺激素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達(dá)到預(yù)定濃度，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

上述的制備方法中，先制備基礎(chǔ)培養(yǎng)液并且定量，然后在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子以及血清，或者在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)₂D₃、甲狀旁腺激素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的制備，需要指出的是，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基的組分是預(yù)先混在一起的，因此在未使用時(shí)，應(yīng)在低溫條件下保藏，防止其失去活性。

可選的，所述RANKL、M-CSF、1,25(OH)₂D₃、甲狀旁腺激素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松依次序先后加入。

一種根據(jù)所述的破骨細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

1)、將骨髓血細(xì)胞加入到骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，離心，并將所得的沉淀利用α-MEM培養(yǎng)液重懸，得到細(xì)胞懸液；

優(yōu)選的，骨髓細(xì)胞的提取可以采用如下操作進(jìn)行：

在無(wú)菌條件下取動(dòng)物個(gè)體的骨，并且去除骨組織上的肌肉和軟組織，隨后剪開(kāi)骨的兩端后利用骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基將骨髓從一端吹下，反復(fù)消化清洗后，繼續(xù)加入一定量的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間，然后進(jìn)行離心，離心后的沉淀利用α-MEM培養(yǎng)液重懸。

2)、將所述細(xì)胞懸液純化；

得到的細(xì)胞懸液由于其含有雜細(xì)胞較多，因此需要純化去除雜細(xì)胞，純化過(guò)程一般采用培養(yǎng)基篩選的辦法，使得目的細(xì)胞增殖，雜細(xì)胞被除去。

3)、將純化后的細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并每隔1-2天換液一次，得到分化的破骨細(xì)胞。

可選的，在步驟1)中，所述離心的條件為800-1200轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為5-8分鐘。

可選的，在步驟2)中，所述純化具體包括：

將細(xì)胞懸液用α-MEM培養(yǎng)液稀釋到所需濃度，接種于培養(yǎng)板上，在35-37℃的CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)20-25分鐘，再用α-MEM培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，得到純化后細(xì)胞。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)、破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究骨吸收的基礎(chǔ)，如何獲得純度高，數(shù)量多的破骨細(xì)胞仍是目前該項(xiàng)研究的熱點(diǎn)，本發(fā)明提供的通體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的組分進(jìn)行特定的選擇，對(duì)骨髓中細(xì)胞分步進(jìn)行培養(yǎng)純化以及誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)快速大量制備破骨細(xì)胞的效果。

(2)、本發(fā)明提供的培養(yǎng)基組分合理優(yōu)化，利于細(xì)胞的大量增殖和分化，為建立完善的體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)體現(xiàn)提供了先決基礎(chǔ)。

(3)、本發(fā)明提供的這種體外破骨細(xì)胞的培養(yǎng)體現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了方法與培養(yǎng)基的結(jié)合，整個(gè)培養(yǎng)方法簡(jiǎn)化，可控性強(qiáng)，通過(guò)提供培養(yǎng)基的方式實(shí)現(xiàn)即可在短時(shí)間內(nèi)(不到7天)即可獲得大量多核、高活性的破骨細(xì)胞的制備。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明制備廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明的實(shí)施例中，提供了一種破骨細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括：骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基；其中，所述骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基為含有巨噬細(xì)胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％體積分?jǐn)?shù)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有10-70ng/mL RANKL、10-40ng/mL M-CSF、0.1-1μm/mL 1,25(OH)₂D₃、2-5ng/mL甲狀旁腺激素、6-10ng/mL白細(xì)胞介素、2-8ng/mL腫瘤壞死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

更為優(yōu)選的，在上述方案的基礎(chǔ)之上，本發(fā)明的技術(shù)方案還可以包括以下一種或者多種限定，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液包括α-MEM培養(yǎng)液，DMEM，RPMI-1640，F(xiàn)12，M199，DMEM/F12中的一種或幾種。所述血清為胎牛血清、馬血清和羊血清中的一種或幾種?；蛘?，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，還含有體積分?jǐn)?shù)占8-9％的胎牛血清。優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述白細(xì)胞介素包括白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6。更為優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述白細(xì)胞介素-1與所述白細(xì)胞介素-6的濃度比為1-3。

本發(fā)明提供的上述的破骨細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：配制基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中先加入既定體積分?jǐn)?shù)的血清，然后再加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子，使其濃度為10-40μg/L，得到骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基；在另一基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)₂D₃、甲狀旁腺激素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各試劑達(dá)到預(yù)定濃度，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

另外，為了保證所制成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的活性，所述RANKL、M-CSF、1,25(OH)₂D₃、甲狀旁腺激素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2和地塞米松依次序先后加入。

根據(jù)所述的破骨細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法，包括以下步驟：將骨髓血細(xì)胞加入到骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，離心，并將所得的沉淀利用α-MEM培養(yǎng)液重懸，得到細(xì)胞懸液；將所述細(xì)胞懸液純化；將純化后的細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并每隔1-2天換液一次，得到分化的破骨細(xì)胞。

另外，優(yōu)選的，所述離心的條件為800-1200轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為5-8分鐘。所述純化具體包括：將細(xì)胞懸液用α-MEM培養(yǎng)液稀釋到所需濃度，接種于培養(yǎng)板上，在35-37℃的CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)20-25分鐘，再用α-MEM培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，得到純化后細(xì)胞。

接下來(lái)，本發(fā)明對(duì)于破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)基及其制備方法舉出以下具體實(shí)施例，具體請(qǐng)參考實(shí)施例1-實(shí)施例6。

實(shí)施例1