一種誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)及干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化領(lǐng)域，尤其涉及一種誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)干 細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是具有一定自我更新能力，并在適宜的微環(huán)境下具有多向分化潛能的原始 細(xì)胞，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌等多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSC)來源于中胚層的非終末分化細(xì)胞，它既有間質(zhì)細(xì)胞，又有 內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征，是細(xì)胞治療和組織工程種子細(xì)胞的重要來源。間充質(zhì)干細(xì)胞 除來源于骨髓、外周血、脂肪、臍帶外，人牙髓也是間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來源。
[0003] 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Dental Pulp Stem Cell，DPSCs)是來源于神經(jīng)嵴的多能干細(xì) 胞，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs)相比較，兩者在人類4400 個(gè)基因表達(dá)水平上是一致的，包括表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞粘附分子、生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)因子等基因，并且具有相似的免疫表型，在形態(tài)上也很類似，但牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓 中提取的干細(xì)胞相比有明顯的優(yōu)勢(shì)：（1)來源廣泛，易于采集(乳牙自然脫落、智齒的拔除 等)；（2)自體應(yīng)用，安全健康，且不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；（3)分化能力和可塑性更強(qiáng)，可分化 為更多種類的組織細(xì)胞；（4)具有更強(qiáng)的增殖能力和自我更新能力。
[0004] 目前，影響牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞研宄和臨床應(yīng)用的瓶頸主要是牙髓組織提取量少， 一顆牙齒分離的牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞難以達(dá)到治療量。通常牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法主 要是酶消化法和植塊法。在酶消化法中，使用酶長時(shí)間消化，易對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，使 其增殖能力下降甚至死亡，使得原本就少的干細(xì)胞變得更少，并且普通的培養(yǎng)方法擴(kuò)增倍 數(shù)有限，不能短時(shí)大量獲取牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞；植塊法(如專利CN102807967A)需要的培養(yǎng) 時(shí)間過長，且組織利用不完全，造成了細(xì)胞的損失。專利CN103849595A采用生物發(fā)酵罐的 方法提高牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)量，但是使用胎牛血清引入異種蛋白可能造成致敏，而且 生產(chǎn)成本高，因此限制了其應(yīng)用范圍。
[0005] 生理學(xué)上體內(nèi)細(xì)胞氧濃度在1-13%范圍內(nèi)，但大部分細(xì)胞培養(yǎng)在21%氧氣濃度下 完成。外界氧環(huán)境的變化可以改變培養(yǎng)基內(nèi)的氧濃度，因此，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的氧濃 度即可改變培養(yǎng)基中的氧環(huán)境。體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞主要在低氧的環(huán)境中生長，低氧更符合 其生理狀態(tài)，富氧反而對(duì)細(xì)胞具有損傷作用。目前研宄表明，低氧培養(yǎng)將提高間充質(zhì)干細(xì)胞 的增殖能力，迀移能力及黏附能力，并降低細(xì)胞衰亡率。但是低氧下會(huì)產(chǎn)生更多地乳酸，作 為代謝副產(chǎn)物，過多的乳酸會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，限制細(xì)胞進(jìn)一步生長。因此，選擇合適的氧 濃度是提高細(xì)胞增殖速度的關(guān)鍵。
[0006] 谷氨酰胺為細(xì)胞的生長提供能量的同時(shí)，也為嘌呤和嘧啶的合成提供氨基。但是 在細(xì)胞代謝過程中谷氨酰胺會(huì)分解為氨和α -酮戊二酸，其中氨會(huì)抑制細(xì)胞的生長，影響 細(xì)胞的能量代謝，繼而影響細(xì)胞的增殖速度。近年來研宄發(fā)現(xiàn)，α-酮戊二酸可以干預(yù)谷氨 酰胺的代謝，提高其利用率，并且α -酮戊二酸可以為DNA的去甲基化提供能量，讓整個(gè)基 因組保持開放狀態(tài)，保留自己的分化能力。但是高濃度的α-酮戊二酸則會(huì)產(chǎn)生更多的氨， 從而影響干細(xì)胞的增殖。因此，選擇合適的α-酮戊二酸濃度是提高細(xì)胞增殖速度的關(guān)鍵。
[0007] 眾所周知，干細(xì)胞的生長和分化方向取決于局部的微環(huán)境，細(xì)胞生長的微環(huán)境主 要是由細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞因子構(gòu)成，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白主要成分有層粘連蛋白、纖連蛋 白、膠原和基底膜蛋白聚糖等，而細(xì)胞因子包括生長因子、白細(xì)胞介素、生長轉(zhuǎn)化因子等。作 為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的層粘連蛋白（laminin，LN) -直被認(rèn)為是最有效的神經(jīng)生長促進(jìn)因子。 層粘連蛋白是由1條重鏈（α鏈）和2條輕鏈（β鏈和γ鏈）經(jīng)二硫鍵連接而成的異源三 聚體，在空間上形成一個(gè)十字結(jié)構(gòu)。迄今已證實(shí)有5條α鏈、4條β鏈、3條γ鏈，它們組 合至少有16種亞型的層粘連蛋白。其中層粘連蛋白8和層粘連蛋白2是神經(jīng)微環(huán)境中的 重要蛋白質(zhì)。它們既是神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白又是神經(jīng)鞘的組成成分，能夠刺激胚胎中神經(jīng) 軸的生長，并促進(jìn)成年動(dòng)物的神經(jīng)損傷后的再生。有研宄表明，層粘連蛋白體外可促進(jìn)神經(jīng) 元突起的縱向延伸，提供類似于體內(nèi)神經(jīng)的生長環(huán)境，而且生長速度顯著提高。
[0008] 細(xì)胞因子是影響細(xì)胞生長的重要因素，例如：bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)，是 重要的促有絲分裂因子，也是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子，體外低濃度即可發(fā)揮強(qiáng)烈 的作用，能延長神經(jīng)細(xì)胞的存活時(shí)間；EGF (表皮生長因子)，最大的特點(diǎn)是能夠促進(jìn)細(xì)胞增 殖分化，以新生細(xì)胞代替衰老和死亡細(xì)胞；NGF (神經(jīng)生長因子)，是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突 起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分 化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均有重要的調(diào)控作用。BDNF (腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)，是人 體內(nèi)分布最為廣泛的具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白，能增加突觸可塑性、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生以及神 經(jīng)元的發(fā)育和再生。TGF (轉(zhuǎn)化生長因子)，對(duì)細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié) 作用，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白、纖粘連蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解，對(duì) 細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用，有利于細(xì)胞修復(fù)；NT-3(神經(jīng)營養(yǎng)因子3)， 能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長、分化，刺激神經(jīng)突起的形成。
[0009] 羊膜組織中含有多種生物活性物質(zhì)，是一種天然的生物材料。人羊膜組織由來源 于外胚層的羊膜上皮細(xì)胞和中胚層的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞組成。電鏡下觀察，羊膜的基本結(jié) 構(gòu)分為上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細(xì)胞層、海綿層。羊膜干細(xì)胞能分泌多種生長因 子，主要包括生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、神經(jīng)生長因子、干細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、角蛋白生長因子、金屬蛋白酶組織抑制因子等。這正是羊膜移植 后能夠抑制炎癥和血管新生、抗纖維化抑制瘢痕形成、促進(jìn)細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)。
[0010] 羊膜細(xì)胞外基質(zhì)是人羊膜去除細(xì)胞后，保留的基膜及基質(zhì)層，又被稱為脫細(xì)胞羊 膜基質(zhì)。首先它是一個(gè)良好的半透膜，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以自由滲透；其次，作為一種 天然基質(zhì)，能為細(xì)胞生存提供良好的微環(huán)境。尤其，脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)中含有多種能促進(jìn)神經(jīng) 再生的蛋白成分，如膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等，此類物質(zhì)可以作為細(xì)胞的生長支 架，有利于細(xì)胞的粘附、生長。
[0011] 現(xiàn)有的研宄成果顯示，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法主要是添加一些促神 經(jīng)分化的細(xì)胞因子或生化試劑，專利CN104004713A誘導(dǎo)培養(yǎng)液中添加了 β -巰基乙醇 (β-ΜΕ)、二甲亞砜（DMS0)、青鏈霉素；專利CN103215222A誘導(dǎo)液中添加了香丹注射液；專 利CN102559593A誘導(dǎo)培養(yǎng)液中添加了丁酸鈉。以上方法均能誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化 為神經(jīng)細(xì)胞，但是添加了一些毒性生化試劑或抗生素，對(duì)臨床應(yīng)用的安全性造成了一定的 威脅。專利CN101914493A誘導(dǎo)分四種培養(yǎng)基，誘導(dǎo)程序繁瑣，并且使用胎牛血清引入異種 蛋白，限制了其應(yīng)用范圍。
[0012] 最初，動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)均依賴于胎牛血清，這樣細(xì)胞在體外細(xì)胞才能較好的 增殖生長。但由于胎牛血清成分復(fù)雜，使用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞存在潛在的細(xì)胞毒性 作用、外源病毒和致病因子污染問題，使細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化和終產(chǎn)品純化難度加大，異種血 清的殘留也易導(dǎo)致臨床上的過敏反應(yīng)。因此，動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和應(yīng)用勢(shì)在必 行。所謂無血清培養(yǎng)基，是指不含有動(dòng)物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細(xì)胞在體外 較長時(shí)間生長、繁殖的一種培養(yǎng)基。細(xì)胞工程中無血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，在很大程度上可以 避免含血清培養(yǎng)所帶來的不利。優(yōu)化培養(yǎng)基的成分可使不同細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表 達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法， 通過優(yōu)化牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方案，構(gòu)建三維立體結(jié)構(gòu)，模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境，將其 誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞，有效提高了牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)的增殖速度，以及向神經(jīng)方 向誘導(dǎo)分化的效率。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì) 胞的方法，包括以下步驟。
[0015] 步驟1、羊膜干細(xì)胞的提取及羊膜干細(xì)胞培養(yǎng)上清的收集。
[0016] 步驟2、制備脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)。
[0017] 步驟3、智齒的采集及運(yùn)輸。
[0018] 步驟4、將多聚賴氨酸及層粘連蛋白包被在培養(yǎng)皿底部。
[0019] 步驟5、采用酶消化法提取牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于已包被的培養(yǎng)皿中，添加優(yōu)化 培養(yǎng)基并置于低氧條件下原代培養(yǎng)。
[0020] 步驟6、原代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞匯合率達(dá)70%時(shí)傳代培養(yǎng)。
[0021] 步驟7、對(duì)傳代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞表型分析。
[0022] 步驟8、將傳代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于鋪有脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)的培養(yǎng)皿中。
[0023] 步驟9、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)上貼附24h后棄掉培養(yǎng)基，在牙髓間 充質(zhì)干細(xì)胞上再覆蓋一層新的脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)。
[0024] 步驟10、待牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)棄掉培養(yǎng)基，改用神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液 繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。
[0025] 步驟11、觀察到有60%的牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞被誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，棄掉神經(jīng)細(xì)胞 誘導(dǎo)液，改用神經(jīng)細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。
[0026] 步驟12、對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光法鑒定。
[0027] 所述步驟4中多聚賴氨酸終濃度為50 μ g/mL，層粘連蛋白終濃度為20 μ g/mL。
[0028] 所述步驟5中酶消化法采用4mg/mL中性蛋白酶和3mg/mL I型膠原酶37°C條件消 化lh〇
[0029] 所述優(yōu)化培養(yǎng)基為含10%羊膜干細(xì)胞培養(yǎng)上清和0. 32mmol/L α -酮戊二酸的無 血清培養(yǎng)基。
[0030] 所述低氧條件為氧氣8%、二氧化碳5%、氮?dú)?7%。
[0031] 所述低氧條件下原代培養(yǎng)的半量換液時(shí)間為7天后，全量換液時(shí)間為10天后。