本實用新型涉及環(huán)狀DNA拷貝數(shù)檢測，具體涉及一種檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

線粒體是真核細胞內(nèi)主管能量代謝的細胞器。不同類型細胞內(nèi)線粒體的數(shù)量從幾百個到幾千個不等。線粒體DNA(mtDNA)是位于線粒體內(nèi)裸露的雙鏈環(huán)狀DNA分子，通常每個線粒體含有2～10個拷貝。人類mtDNA全長16.6Kb，含37個基因，分別編碼13個蛋白、22個線粒體tRNA和2個線粒體rRNA。線粒體功能的實現(xiàn)依賴于mtDNA基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，因而細胞內(nèi)mtDNA數(shù)量變化必然引起線粒體功能的改變。線粒體是氧化磷酸化反應(yīng)的中心，可產(chǎn)生大量自由基，對mtDNA造成損傷；加之mtDNA缺乏核DNA所具有的組蛋白保護及完備的DNA損傷修復(fù)機制，因而比基因組DNA更易受到損傷。損傷的mtDNA通過自噬途徑降解，細胞內(nèi)mtDNA總數(shù)量減少，從而影響線粒體功能。

由于線粒體DNA量的變化導(dǎo)致線粒體故障已涉及癌癥、神經(jīng)變性、糖尿病及老化，并在其他幾個臨床方面也已體現(xiàn)出影響(例如在體細胞或低質(zhì)量的生殖細胞(卵母細胞)內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物誘導(dǎo)線粒體的耗竭)。因此，線粒體DNA的定量是至關(guān)重要的，不僅要了解病理表型和臨床進展，同時也可深入了解的線粒體DNA含量的一般變化。

研究表明，熒光定量PCR(Q-PCR)中每個模板的Ct(Cycle threshold)值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

目前已有的技術(shù)方案有mtDNA的全基因高通量測序，觀察突變位點，此方法測序周期長，而且需要專業(yè)的人員對測序結(jié)果進行分析并且需要大量的數(shù)據(jù)庫進行對比。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上現(xiàn)有技術(shù)問題，本實用新型的目的在于提供一種檢測試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中導(dǎo)致的上述缺陷。具體技術(shù)方案如下：

一種檢測試劑盒，包括方盒，泡沫墊以及試劑瓶，其中，所述方盒內(nèi)置所述泡沫墊，方盒頂部設(shè)有盒蓋，盒蓋下表面設(shè)有定位塊；所述泡沫墊上開設(shè)有四個孔；所述試劑瓶分別為1號試劑瓶、2號試劑瓶、3號試劑瓶、4號試劑瓶，放置于所述四個孔內(nèi)。

進一步地，所述塑料方盒的內(nèi)尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*50～100mm(H)，所述泡沫板尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*25～50mm(H)。

進一步地，所述方盒為塑料方盒。

進一步地，所述試劑瓶均為透明試劑瓶。

進一步地，所述四個試劑瓶均具有瓶蓋。

進一步地，所述瓶蓋的顏色均不相同。

進一步地，所述瓶蓋上均設(shè)有圓形標(biāo)識。

上述線粒體DNA拷貝數(shù)檢測試劑盒的使用方法，包含如下步驟：

(1)制備單細胞液；

(2)裂解定量細胞；

(3)Q-PCR反應(yīng)；

(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(5)線粒體DNA拷貝數(shù)的絕對量化。

進一步地，包含如下步驟：

(1)制備單細胞液：通過酶促消化組織得到單細胞液，首先懸浮在1×PBS緩沖液中，使用細胞計數(shù)器計數(shù)；

(2)裂解定量細胞：轉(zhuǎn)移1000～10000個細胞到200μl薄壁PCR管中，加入等體積的2×蛋白消化液，40℃～60℃孵育6～12小時，接著80℃～95℃熱滅活10～30分鐘；

(3)Q-PCR反應(yīng)：將每種樣品進行梯度稀釋并分別置于各PCR管中，然后加入PCR預(yù)混液、染色溶液，置于Q-PCR儀中進行反應(yīng)；

(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)Q-PCR結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(5)線粒體DNA拷貝數(shù)的絕對量化：Ct值和標(biāo)準(zhǔn)的初始拷貝數(shù)的對數(shù)之間的關(guān)系應(yīng)是線性的，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型試劑盒大小適中，美觀。由于本試劑盒需要冷鏈運輸，內(nèi)置泡沫板一方面可以固定試劑瓶，另一方面有隔熱的效果，經(jīng)濟、實用。實驗方法簡單，易操作，無需很專業(yè)的技術(shù)要求。適合醫(yī)院及科研院所單位大范圍使用。

附圖說明

圖1為線粒體DNA拷貝數(shù)檢測試劑盒示意圖

具體實施方式

下面根據(jù)附圖對本實用新型進行詳細描述，其為本實用新型多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。

圖1為線粒體DNA拷貝數(shù)檢測試劑盒示意圖，1號試劑瓶(稀釋緩沖液)，2號試劑瓶(蛋白消化液)，3號試劑瓶(PCR預(yù)混液)，4號試劑瓶(染色劑溶液)，還包括方盒和泡沫墊5，其中，所述方盒內(nèi)置所述泡沫墊5，方盒頂部設(shè)有盒蓋6，盒蓋下表面設(shè)有定位塊7；所述泡沫墊5上開設(shè)有四個孔；所述試劑瓶分別為1號試劑瓶1、2號試劑瓶2、3號試劑瓶3、4號試劑瓶4，放置于所述四個孔內(nèi)。

包括塑料方盒，所述塑料方盒內(nèi)置大小合體的泡沫板5，所述泡沫板有四個孔洞，所述孔洞內(nèi)放置四個試劑瓶，分別為1號試劑瓶1、2號試劑瓶2、3號試劑瓶3、4號試劑瓶4，所述1號試劑瓶1內(nèi)盛放稀釋緩沖液，所述2號試劑瓶2內(nèi)盛放蛋白消化液，所述3號試劑瓶3內(nèi)盛放PCR預(yù)混液，所述PCR預(yù)混液(PCR Master Mix)包含dNTP、PCR緩沖液、MgCl2、ddH2O、Enhancer、引物對、Taq酶，所述4號試劑瓶4內(nèi)盛放染色劑溶液。

在另一個優(yōu)選實施例中，

一種線粒體DNA拷貝數(shù)檢測試劑盒及其應(yīng)用，包括塑料方盒，所述塑料方盒內(nèi)置大小合體的泡沫板，所述泡沫板有四個孔洞，所述孔洞內(nèi)放置四個試劑瓶，分別為1號試劑瓶、2號試劑瓶、3號試劑瓶、4號試劑瓶，所述1號試劑瓶內(nèi)盛放稀釋緩沖液，所述2號試劑瓶內(nèi)盛放蛋白消化液，所述3號試劑瓶內(nèi)盛放PCR預(yù)混液，所述PCR預(yù)混液(PCR Master Mix)包含dNTP、PCR緩沖液、MgCl2、ddH2O、Enhancer、引物對、Taq酶，所述4號試劑瓶內(nèi)盛放染色劑溶液。

1、所述塑料方盒的內(nèi)尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*50～100mm(H)，所述泡沫板尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*25～50mm(H)，所述稀釋緩沖液為PBS緩沖液、Hanks緩沖液及其他細胞緩沖液，優(yōu)選PBS緩沖液，所述蛋白消化液為蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶，優(yōu)選蛋白酶K，所述染色劑溶液為SYBR Green溶液、Eva Green溶液、LC Green溶液，優(yōu)選10×SYBR Green工作液。使用方法包含如下步驟：

(1)制備單細胞液：通過酶(實驗室常規(guī)酶)促消化組織得到單細胞液，首先懸浮在1×PBS緩沖液中，使用細胞計數(shù)器計數(shù)。

(2)裂解定量細胞：轉(zhuǎn)移1000～10000個細胞到200μl薄壁PCR管中，加入等體積的2×蛋白消化液，40℃～60℃孵育6～12小時，接著80℃～95℃熱滅活10～30分鐘。

(3)Q-PCR反應(yīng)：將每種樣品進行梯度稀釋并分別置于各PCR管中，然后加入PCR預(yù)混液、染色溶液，置于Q-PCR儀中進行反應(yīng)。

(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)Q-PCR結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)線粒體DNA拷貝數(shù)的絕對量化：Ct值和標(biāo)準(zhǔn)的初始拷貝數(shù)的對數(shù)之間的關(guān)系應(yīng)是線性的，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。相關(guān)分析和回歸分析可以使用Microsoft Excel來完成。

引物對包含上引物和下引物，根據(jù)本試劑盒的具體應(yīng)用可進行單獨設(shè)計合成，本試劑盒的應(yīng)用包含乳腺癌、節(jié)直腸癌、衡量卵母細胞及胚胎質(zhì)量，以上列出部分應(yīng)用但本試劑盒的應(yīng)用不限于此。

下述實施案例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施案例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

優(yōu)選實施案例為小鼠胚胎組織細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測：

通過酶促消化小鼠胚胎組織得到細胞液，首先懸浮在1×PBS中，使用細胞計數(shù)器計數(shù)(例如血球)。轉(zhuǎn)移1000的細胞到200μl薄壁PCR管中，加入等體積的2×裂解緩沖液，55℃孵育12小時，接著95℃熱滅活10分鐘。Q-PCR反應(yīng)中應(yīng)將每種樣品連續(xù)稀釋10¹-10³倍，用來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

線粒體的絕對量化將通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方法來進行。1ng線粒體標(biāo)準(zhǔn)品由1.24×10⁹的雙鏈DNA分子組成。1ng/μl標(biāo)準(zhǔn)10⁷-10²倍稀釋液實時PCR擴增范圍在1.0×10²至1.0×10⁷拷貝數(shù)內(nèi)。Ct值和標(biāo)準(zhǔn)的初始拷貝數(shù)的對數(shù)之間的關(guān)系應(yīng)是線性的，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。相關(guān)分析和回歸分析可以使用Microsoft Excel來完成。

一個364孔PCR板上包括非稀釋、連續(xù)稀釋和標(biāo)準(zhǔn)的樣品測量。

1、PCR體系(試劑盒使用前將PCR預(yù)混液和染色劑溶液混合)

*可以推斷在每個反應(yīng)中所用的細胞的數(shù)目。每個樣本個重復(fù)。

2、PCR條件

循環(huán)閾值數(shù)(Ct)由儀器提供的軟件來計算，例如ABI7900HT SDS2.3。每個PCR產(chǎn)物的量通過使用Ct值和標(biāo)準(zhǔn)濃度對數(shù)計算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸模型進行校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝–3.458x+41.491,其中y為Ct值,x為模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù),相關(guān)系數(shù)為0.999。結(jié)果顯示,小鼠胚胎干細胞中mtDNA平均拷貝數(shù)/細胞為1 321±228,線粒體的含量比較豐富。反應(yīng)體系具有較高的檢測敏感性,模板濃度在103～108拷貝/μL反應(yīng)時,反應(yīng)體系具有良好的重復(fù)性和特異性,結(jié)果可靠。

本實用新型的應(yīng)用包含乳腺癌、節(jié)直腸癌、衡量卵母細胞及胚胎質(zhì)量，以上列出部分應(yīng)用但本試劑盒的應(yīng)用不限于此。