本發(fā)明涉及羥基類固醇脫氫酶，具體涉及一種新的7β-羥基類固醇脫氫酶基因y1-b-1。

背景技術(shù)：

羰基的不對稱還原一直是化學(xué)反應(yīng)研究的熱點之一。雖然目前化學(xué)方法已經(jīng)取得了一定的成果，但是化學(xué)方法往往存在催化劑種類和數(shù)目有限、立體選擇性不高、輔助試劑昂貴且不易回收等缺點。而酶促反應(yīng)不僅具有高效性、化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性還具有高度的立體選擇性。羥基類固醇脫氫酶(hydroxysteroiddehydrogenase，hsdh)介導(dǎo)的酶促反應(yīng)具有相對嚴(yán)格的立體選擇性和“不”嚴(yán)格的底物特異性。例如，早在二十世紀(jì)八十年代初科學(xué)家就已經(jīng)開始嘗試?yán)梦⑸锂a(chǎn)生的7α-、7β-hsdh聯(lián)合差向異構(gòu)轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸(chenodeoxycholicacid，cdca)合成熊去氧膽酸(ursodesoxycholicacid，udca)。而游離酶還可以催化結(jié)合態(tài)膽汁酸——?；蛆Z去氧膽酸(taurochenodeoxycholicacid，tcdca)轉(zhuǎn)化為?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholicacid，tudca)。

hsdh的底物不僅僅局限在甾體類化合物，文獻(xiàn)報道hsdh還可以催化烷基取代單環(huán)酮類、二環(huán)酮類等物質(zhì)的羰基不對稱還原。hsdh所具有的優(yōu)秀催化品質(zhì)決定了其在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域具有較大應(yīng)用潛力。近年來，科研人員逐漸認(rèn)識到了7α-、7β-hsdh在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域所具有的巨大應(yīng)用潛力。目前，genbank中登記的功能已經(jīng)確認(rèn)的7α-hsdh共有5個，它們分別來自于bacteroidesfragilis、clostridiumscindens、clostridiumsordellii、clostridiumabsonum和escherichiacoli；來自clostridiumabsonum和collinsellaaerofaciens的7β-hsdh基因也已經(jīng)成功被克隆。

酶的活性和熱穩(wěn)定性是決定能否投入工業(yè)生產(chǎn)的重要參數(shù)，現(xiàn)有的羥基類固醇脫氫酶的活性和穩(wěn)定性還不能同時滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此，需要進(jìn)一步尋找和開發(fā)新的適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的羥基類固醇脫氫酶。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新的7β-羥基類固醇脫氫酶基因，該基因編碼的7β-羥基類固醇脫氫酶與現(xiàn)有的撒丁島梭菌7β-hsdh相比，在37℃條件下具有更好的熱穩(wěn)定性，具有很大的工業(yè)應(yīng)用前景。

本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

一種7β-羥基類固醇脫氫酶，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

編碼所述7β-羥基類固醇脫氫酶的基因。

所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

一種表達(dá)盒，其特征在于，包含任一所述基因。

一種載體，其特征在于，包含任一所述基因或所述表達(dá)盒。

一種重組細(xì)胞，其特征在于，包含任一所述基因或所述表達(dá)盒或所述載體。

制備所述7β-羥基類固醇脫氫酶的方法，其特征在于，在能夠成功誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述重組細(xì)胞并分離得到7β-羥基類固醇脫氫酶。

一種催化劑，其特征在于，其有效成分包含所述7β-羥基類固醇脫氫酶。

所述催化劑還包括與所述7β-羥基類固醇脫氫酶同時使用時能夠提高酶催化效率或增加酶穩(wěn)定性的其它試劑。

一種實現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的羰基不對稱還原的方法，其特征在于，使用所述7β-羥基類固醇脫氫酶或所述催化劑與反應(yīng)底物在15-37℃、ph6.0-11.0條件下進(jìn)行催化反應(yīng)。

本發(fā)明利用宏基因組測序技術(shù)從四川黑熊保護(hù)及孵育基地的一頭健康黑熊的糞便樣品中分離出一種新的7β-羥基類固醇脫氫酶基因，命名為7β-hsdhy1-b-1，其核苷酸序列如seqidno.2所示。該基因編碼一種新的7β-羥基類固醇脫氫酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示，能夠催化熊去氧膽酸(udca)、牛磺熊去氧膽酸(tudca)的7位羥基的差向異構(gòu)，使其生成鵝去氧膽酸(cdca)、?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)的中間體7-酮石膽酸(7k-lca)、?；?-酮石膽酸(t7k-lca)。

本發(fā)明分離的7β-hsdhy1-b-1基因，其表達(dá)產(chǎn)物7β-hsdhy1-b-1酶蛋白，與現(xiàn)有的撒丁島梭菌clostridiumabsonum中的7β-羥基類固醇脫氫酶相比，催化底物udca或tudca的比活力大小相當(dāng)，但具有更好的熱穩(wěn)定性，特別是在37℃下，本發(fā)明分離的7β-羥基類固醇脫氫酶在12小時后還具有40％的活性，而撒丁島梭菌的7β-羥基類固醇脫氫酶已經(jīng)全部失活。

本發(fā)明提供的載體，可以是克隆載體，包含7β-hsdhy1-b-1基因和質(zhì)粒復(fù)制所需的其它元件；也可以是表達(dá)載體，包含7β-hsdhy1-b-1基因以及能夠使蛋白成功表達(dá)的其它元件。

本發(fā)明提供的重組細(xì)胞，可以是包含克隆載體的重組細(xì)胞，例如e.colidh5α；也可以是包含表達(dá)載體的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)細(xì)胞，例如，加入適量的iptg，16℃誘導(dǎo)7β-hsdhy1-b-1的表達(dá)。

本發(fā)明提供一種催化劑，其有效成分包括本發(fā)明的7β-hsdh。所述催化劑也可以與其它適合的催化劑同時使用，從而提高酶催化效率或者在同一反應(yīng)體系中先后進(jìn)行兩種催化反應(yīng)。

本發(fā)明的7β-hsdhy1-b-1，在15-37℃、ph6.0-11.0的反應(yīng)條件下能夠催化tudcac7β-羥基的羰基不對稱還原反應(yīng)。

附圖說明

圖1.本發(fā)明分離的7β-hsdh基因與撒丁島梭菌7β-hsdh基因的序列比對結(jié)果；

其中，1為現(xiàn)有的撒丁島梭菌7β-hsdh基因的核苷酸序列，2為本發(fā)明分離的7β-hsdh基因的核苷酸序列。

圖2.本發(fā)明分離的7β-hsdh基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3.本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1酶蛋白的sds-page電泳圖。

圖4.撒丁島梭菌7β-hsdh酶蛋白的sds-page電泳圖。

圖5.本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1的酶穩(wěn)定性實驗結(jié)果；

其中，橫坐標(biāo)為測定時間，縱坐標(biāo)為相對酶活。

圖6.撒丁島梭菌7β-hsdh的酶穩(wěn)定性實驗結(jié)果；

其中，橫坐標(biāo)為測定時間，縱坐標(biāo)為相對酶活。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，需要聲明的是，下述實施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

生物材料：

e.colidh5α，e.colibl21細(xì)胞為本實驗室保存，可商購獲得。

實驗試劑：

糞便dna基因組提取試劑盒，購買自德國qiagen公司，貨號：51604；

瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購買自omega，貨號：d2500-01；

pcr一步定向克隆試劑盒，購買自左岸蛋白科技有限公司，貨號：nr001；

載體pgex-6p-1，購于上海生工公司；

質(zhì)粒提取試劑盒omegaplasmidminikiti，購買自omega公司，貨號：d6943；

lysisbuffer(裂解緩沖液)，配制而得，10mmph7.3的pbs含有pmsf0.1mm、亮肽素leupeptin0.5mg/ml；

glutathionesepharose4b，購買自gehealthcare，貨號：10223836；

prescissionprotease，購買自genscript公司，貨號：z02799-100；

bca試劑盒，購買自beyotime公司，貨號：p0006；

tcdca，購買自百靈威科技公司，貨號：330776。

dna提取所使用的黑熊糞便，本實驗室有凍存。

以下實施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得或商購獲得，規(guī)格為實驗室純級即可。

實施例1.新7β-hsdh基因的分離

1.基因的發(fā)現(xiàn)

使用滅菌處理的藥匙，采取了四川黑熊保護(hù)及孵育基地的一頭健康黑熊的糞便樣品，并干冰保存運回實驗室。使用qiagen糞便dna基因組提取試劑盒提取了該頭黑熊糞便的總dna，交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏基因組測序。用現(xiàn)有的撒丁島梭菌7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-hsdh)編碼基因序列(genebank號no.aet80684)與宏基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)了一種新的7β-hsdh基因，命名為7β-hsdhy1-b-1，其核苷酸序列如seqidno.2所示。序列比對結(jié)果表明，這種新的7β-hsdh基因與現(xiàn)有的撒丁島梭菌7β-hsdh基因序列的一致性為56.40％(圖1)。

2.基因的分離

(1)引物設(shè)計：對測序獲得的7β-hsdhy1-b-1基因序列設(shè)計引物，得到的引物核苷酸序列如下：

y1-b-1-f：atgaatatgaatttaagagaaaaatatggag

y1-b-1-r：ttatttctcatagaaagaccccatatat

(2)pcr擴(kuò)增：以黑熊糞便的總dna為模板，采用步驟(1)獲得的引物，按照下列pcr體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。

pcr體系：

5xfastpfu緩沖液........................2μl

2.5mmdntps..........................2μl

y1-b-1-f(5μm)..........................2μl

y1-b-1-r(5μm)............................2μl

模板dna...........................20ng

fastpfu聚合酶.......................1μl

補ddh2o至...............................20μl

pcr程序：

a.94℃預(yù)變性3min，5個循環(huán)；

b.94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，27個循環(huán)；

c.72℃延伸10min。

(3)瓊脂糖凝膠電泳：使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，出現(xiàn)大小約為800bp的條帶。

(4)切膠回收：在紫外燈下切取目的條帶，使用omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書中的操作步驟回收目的基因片段。

實施例2.7β-hsdhy1-b-1基因的表達(dá)

1.載體構(gòu)建：

使用于左岸蛋白科技有限公司購買的pcr一步定向克隆試劑盒，按照試劑盒說明書中的操作步驟，將7β-hsdhy1-b-1基因的序列全長連接在載體pgex-6p-1上。

2.轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞

1)感受態(tài)細(xì)胞e.colidh5α放置冰上融化。

2)將步驟1所得的連接體系加入融化的e.colidh5α感受態(tài)中，冰上30min。

3)42℃熱處理90s。

4)冰上靜置2min。

5)加入lb培養(yǎng)基600μl，搖床溫度37℃，搖床搖速150rpm，時間45min。

6)吸取200μl菌液，涂布于氨芐親霉素(amp⁺)抗性lb平板培養(yǎng)基上。

7)37℃過夜培養(yǎng)。

3.陽性克隆鑒定：

(1)挑選白色單菌落，接種于lb/amp⁺的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)8小時，8000rpm離心5min獲取菌體。

(2)使用omegaplasmidminikiti質(zhì)粒提取試劑盒，按照說明書中的操作步驟提取質(zhì)粒。

(3)使用克隆引物y1-b-1-f和y1-b-1-r，按照實施例1步驟(2)中的pcr體系和程序進(jìn)行pcr驗證，確定基因片段成功插入pgex-6p-1載體中。

(4)將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工公司測序，將測序結(jié)果比對正確的重組質(zhì)粒pgex-6p-1/7β-hsdhy1-b-1作為表達(dá)載體。

4.7β-hsdhy1-b-1基因的表達(dá)

(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.colibl21細(xì)胞

a.-80℃中取出e.colibl21感受態(tài)細(xì)胞冰上放置。

b.加入2μl表達(dá)載體pgex-6p-1/7β-hsdhy1-b-1，冰上放置30min。

c.42℃熱處理90s。

d.冰上放置2min。

e.復(fù)蘇，加入600μllb培養(yǎng)基，于37℃，150rpm搖床培養(yǎng)45min。

f.吸取200μl菌液，涂布于amp⁺lb平板培養(yǎng)基上。

g.37℃培養(yǎng)過夜。

(2)蛋白表達(dá)與純化

a.將菌種接種入無菌lb液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素終濃度為50μg/ml，37℃，180rpm搖床培養(yǎng)。

b.待菌液od600≈0.8時，加入終濃度為0.2mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，16℃誘導(dǎo)過夜(12h)。8000rpm，5min收集菌體。

c.按1l培養(yǎng)體系加30mllysisbuffer的比例重懸菌體，超聲破菌至澄清。12000rpm離心20min。取上清。

d.將上清與glutathionesepharose4b結(jié)合，填料使用的比例為每升培養(yǎng)體系使用5ml填料，4℃結(jié)合2h。輕輕垂直顛倒混懸。

e.結(jié)合完畢后，500rpm，5min沉淀填料。填料用4℃預(yù)冷pbs沖洗3-5個柱體積，去除雜蛋白。

f.加入prescissionprotease酶切緩沖液，加入prescissionprotease酶。

g.4℃酶切過夜。酶切完畢后，將上清從層析柱中放出。

h.將所得樣品進(jìn)行sds-page，鑒定其分子量大小及純度，使用bca試劑盒測定純化蛋白的濃度。

結(jié)果如圖3所示，獲得的7β-hsdhy1-b-1酶蛋白純度很高，呈單一條帶。以相同的方法對撒丁島梭菌7β-hsdh進(jìn)行蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，也獲得了單一條帶的撒丁島梭菌7β-hsdh。

實施例3.7β-hsdhy1-b-1基因的功能鑒定

1.酶活測定

步驟：室溫條件下，向比色皿中加入158ul50mmtris-hcl(ph＝8.0)溶液，20ul50mm的nadp⁺溶液，再向其中加入2ul實施例2步驟4獲得的7β-hsdhy1-b-1酶蛋白溶液，最后加入20ul50mm的udca或tudca的dmso溶液，充分吹打混勻?；靹蚝罅⒓粗糜诜止夤舛扔嬛姓{(diào)零。開始計時，每分鐘讀取一次340nm處光吸收的變化值。

與此同時，按照上述相同的方法測定撒丁島梭菌7β-hsdh的酶活。

結(jié)果表明，本發(fā)明分離得到的7β-hsdhy1-b-1基因的產(chǎn)物為7β-羥基類固醇脫氫酶，能夠催化熊去氧膽酸(udca)、?；切苋パ跄懰?tudca)的7位羥基的差向異構(gòu)，使其生成鵝去氧膽酸(cdca)、?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)的中間體7-酮石膽酸(7k-lca)、?；?-酮石膽酸(t7k-lca)。該酶對udca、tudca的比活力如表1所示。

表1.本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1與撒丁島梭菌7β-hsdh的比活力比較

比活力(u/mg)定義：在上述反應(yīng)條件下，每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)。

表1數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1酶蛋白對udca、tudca的比活力與撒丁島梭菌7β-hsdh相當(dāng)。

2.酶穩(wěn)定性實驗：

按照下列步驟，同時測定本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1酶蛋白和撒丁島梭菌7β-hsdh酶蛋白的穩(wěn)定性。

(1)將新制的酶液分為三份，分別置于4℃、25℃和37℃的干浴恒溫器中。

(2)每隔4個小時測定一次酶活，酶活測定方法同前。

(3)測定到48個小時的酶活后，實驗結(jié)束。以酶活最高值為100％，折算相對酶活。

結(jié)果表明，本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1在37℃條件下的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于撒丁島梭菌7β-hsdh，在12小時后本發(fā)明7β-hsdhy1-b-1還具有40％的活性，而撒丁島梭菌的7β-hsdh已經(jīng)全部失活。

sequencelisting

<110>重慶大學(xué)

<120>新的7β-羥基類固醇脫氫酶基因y1-b-1

<130>p1632011-cqd-cq-txh

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>265

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>本發(fā)明7β-羥基類固醇脫氫酶y1-b-1的氨基酸序列

<400>1

metasnmetasnleuargglulystyrglyglutrpglyileileleu

151015

glyalathrgluglyvalglylysalaphecysglulysilealaala

202530

glyglymetasnvalvalmetvalglyargarggluglumetleulys

354045

aspleuglyarggluileserasnlystyrglyvalgluhisleuval

505560

ilelysalaaspphealaaspproserservalasplysilepheglu

65707580

glnthrlysgluleuaspmetglyphemetsertyrvalalacysphe

859095

histhrpheglylysleuglnaspthrprotrpglulyshisglugln

100105110

metileasnvalasnvalilethrphephelyscysphetyrhistyr

115120125

metglyilephealalysglnaspargglyalaileileasnvalser

130135140

serleuthrglyileserserserprotyrasnalaglntyrglyala

145150155160

glylyssertyrileleulysleuthrglualavalalacysgluala

165170175

alalysthrasnvalaspvalgluvalilethrleuglythrthrile

180185190

thrproserleuleulysasnleuproglyglyproalaglygluala

195200205

valmetlysseralaleuthrproglualacysvalaspglualaphe

210215220

gluasnleuglylysthrpheservalilealaglygluhisasnlys

225230235240

lysasnvalhisasntrplysalaasnhisthralaaspglutyrile

245250255

thrtyrmetglyserphetyrglulys

260265

<210>2

<211>798

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>本發(fā)明7β-羥基類固醇脫氫酶基因y1-b-1的核苷酸序列

<400>2

atgaatatgaatttaagagaaaaatatggagaatggggaattatattaggtgctactgaa60

ggtgtaggaaaagccttttgtgaaaaaatcgctgctggtggaatgaatgtagtaatggta120

ggcagaagagaggagatgttaaaggacttaggtagagaaataagtaataaatatggagtt180

gaacatttagtaataaaggcagattttgcagatccatcatctgtggacaagatatttgag240

caaactaaggaattagatatgggattcatgtcttatgttgcttgcttccatacatttggt300

aagttacaagatacgccttgggaaaaacatgagcaaatgataaatgtaaatgttattaca360

ttttttaaatgtttttatcattatatgggtatatttgcaaagcaagatagaggggctatt420

ataaatgtatcatctcttactggaataagtagttcaccttataatgctcaatatggtgca480

ggaaaatcatatatattaaagttaacagaagcagttgcttgtgaagctgctaagacaaat540

gttgatgttgaagtaataactttaggaactactattacaccaagtttattaaaaaatctt600

cctggtggaccagctggagaagcagtaatgaaatcagcattaactccagaggcatgtgtt660

gatgaagcttttgaaaatctaggaaaaactttttcagttatagcaggtgagcacaacaag720

aaaaatgtacacaactggaaagctaatcatacagctgatgagtatataacatatatgggg780

tctttctatgagaaataa798

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcr擴(kuò)增本發(fā)明7β-hsdh基因y1-b-1的正向引物

<400>3

atgaatatgaatttaagagaaaaatatggag31

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcr擴(kuò)增本發(fā)明7β-hsdh基因y1-b-1的反向引物

<400>4

ttatttctcatagaaagaccccatatat28