本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)是引起人類獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)的病原體，自1981年美國(guó)首次診斷出艾滋病以來(lái)，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速傳播，截至2015年11月，我國(guó)累計(jì)報(bào)告艾滋病病毒(hiv)感染者和aids病人580409例。

hiv基因組由兩條相同的正鏈rna組成，每條rna長(zhǎng)約9.2-9.8kb，包括如下9個(gè)基因：(1)gag基因(編碼約500個(gè)氨基酸組成的聚合前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解形成p17，p24、p7、p6等核蛋白，使rna不受外界核酸酶破壞)；(2)pol基因(編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶h，均為病毒增殖所必需)；(3)env基因(編碼約863個(gè)氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，并切割形成gp120和gp41)；(4)tat基因(編碼蛋白可與ltr結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mrna的翻譯)；(5)rev基因(產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對(duì)env和gag中順式作用抑制序去抑制作用，增強(qiáng)gag和env基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白)；(6)nef基因(編碼蛋白p27對(duì)hiv基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用)；(7)vif基因(可以介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的天然抗病毒蛋白apobec3g的降解，影響游離hiv感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播)；(8)vpu基因(為hiv-1所特有，可以介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的天然抗病毒蛋白tetherin的降解，為hiv的有效復(fù)制所必需)；(9)vpr基因(編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，具有致凋亡和細(xì)胞周期改變功能，在病毒體內(nèi)繁殖周期中起一定作用)。

1996年高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合治療(haart)的出現(xiàn)和應(yīng)用成為艾滋病(aids)抗病毒治療史上具有里程碑意義的重大事件。臨床觀察表明，抗病毒治療對(duì)減輕病情、提高病人生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生命具有很好的作用。目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑、整合酶抑制劑和ccr5受體拮抗劑六類。

非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括奈韋拉平(nevirapine,nvp)、依非韋倫(efavirdine,efv)、地拉韋定(delavirdine)依曲偉林(etravirine)、英特萊(intelence)、利匹韋林(ripivirine)等。目前，我國(guó)常用的非核苷類抑制劑主要是nvp和efv。nvp一般作為藥代動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)劑，與其他藥物配伍，提高血藥濃度，減少單一突變對(duì)藥物活性的影響。

非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑nvp適合兒童，成人等，是一線抗病毒治療的主要藥物，但是不能單獨(dú)使用。目前全國(guó)接受抗病毒治療的人數(shù)有471140人，其中接近1/3的治療人群使用nvp。

我國(guó)從2003年開始在全國(guó)范圍內(nèi)逐步實(shí)施免費(fèi)的艾滋病抗病毒治療，現(xiàn)免費(fèi)提供的抗艾滋病藥物有七種，包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑三類。nvp是其中免費(fèi)提供的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。我國(guó)2012年發(fā)布的第三版《國(guó)家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊(cè)》對(duì)于成人和青少年的艾滋病患者推薦的治療方案包括奈拉偉平。

由于合成工藝比較困難，以及藥物的結(jié)構(gòu)等問(wèn)題。中國(guó)對(duì)非核苷類抑制劑的仿制相對(duì)落后，我國(guó)面臨必須填補(bǔ)非核苷類抑制劑生產(chǎn)空白的現(xiàn)狀，為hiv感染者提供更多的抗病毒治療選擇。根據(jù)新藥研發(fā)的有關(guān)規(guī)定，新型抗hiv藥物上市前必須評(píng)價(jià)其耐藥性，即使用非核苷類抑制劑耐藥的hiv毒株檢測(cè)其抗病毒效果，再進(jìn)行臨床觀察。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建的毒株具有良好的耐藥性和傳代穩(wěn)定性，可應(yīng)用于抗hiv藥物的篩選。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株，基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶是蛋白質(zhì)序列為seqidno:4所示的蛋白質(zhì)；基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因是dna序列為seqidno:3所示的dna分子。

一種上所述對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株的制備方法，將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶自n末端第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子、第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子得到dna序列如seqidno:3所示的dna分子；再將該dna分子插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)得到重組質(zhì)粒；最后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞并培養(yǎng)制得。

上述將第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第542位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述將第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第563位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293t細(xì)胞。

上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法是在將哺乳動(dòng)物細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)18-48h。

上述野生型hiv病毒為野生型的hiv-1b亞型病毒。

上述野生型的hiv-1b亞型病毒具體為野生型的hiv-189.6病毒。

上述的對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株在篩選抗hiv病毒的藥物中的應(yīng)用。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：

本發(fā)明提供一種對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用，是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶自n末端第181位氨基酸殘基的密碼子由酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子、第188位氨基酸殘基的密碼子由酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子得到的重組病毒。本發(fā)明構(gòu)建的毒株對(duì)奈拉偉平(nvp)具有良好的耐藥性，該毒株對(duì)奈拉偉平(nvp)的半數(shù)抑制濃度(ic50)＞2048μm，具有傳代穩(wěn)定性，可以體外模擬病人由于使用此逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑所產(chǎn)生的耐藥性，可應(yīng)用于抗艾滋病藥物的篩選，對(duì)于抗hiv藥物的篩選具有重大價(jià)值，進(jìn)而對(duì)艾滋病的治療具有深遠(yuǎn)影響。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶dna人工序列。

圖2為本發(fā)明的耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)人工序列。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

一種對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株，其基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶是蛋白質(zhì)序列為seqidno:4所示的蛋白質(zhì)；基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因是dna序列為seqidno:3所示的dna分子。

一種上所述對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株的制備方法，如圖1和2所示，將野生型的hiv-189.6病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶自n末端第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸(y)的密碼子突變?yōu)榘腚装彼?c)的密碼子、第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸(y)的密碼子突變?yōu)榘腚装彼?c)的密碼子得到dna序列如seqidno:3所示的dna分子；再將該dna分子插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)得到重組質(zhì)粒；最后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入離體的293t細(xì)胞，并將293t細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)18-48h。野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)序列為seqidno:2所示的蛋白質(zhì)，野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶的dna序列為seqidno:1所示的dna分子。

上述將第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第542位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述將第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第563位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述的對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株在篩選抗hiv病毒的藥物中應(yīng)用。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)施例中所用的pbs緩沖液均為ph7.2，0.01m的pbs緩沖液。

mt-4細(xì)胞(人t淋巴細(xì)胞系)：參考文獻(xiàn)：haradas,koyanagiy,yamamoton.infectionofhtlv-iii/lavinhtlv-i-carryingcellsmt-2andmt-4andapplicationinaplaqueassay.science1985；229:563-566。

奈拉偉平(nvp)：由雅培公司所生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，藥物名稱是“奈韋拉平片”，每片的藥物含量為“200mg”。

實(shí)施例1

hiv耐藥株的構(gòu)建

1、用dmem培養(yǎng)基(含100μg/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)重懸293t細(xì)胞，得到4×105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。

2、將細(xì)胞懸液加入6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，然后棄除上清，用pbs緩沖液洗滌兩次。

3、借助lipofectamine2000(按說(shuō)明書操作)，將重組質(zhì)粒丁轉(zhuǎn)染步驟2的細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染4微克重組質(zhì)粒)，37℃培養(yǎng)36小時(shí)，收集培養(yǎng)上清。

4、將步驟3得到的培養(yǎng)上清進(jìn)行p24抗原測(cè)定(p24試劑盒：vironostika＠hiv-1antigenmicroelisasystem,生產(chǎn)商：biomerieux,產(chǎn)地：法國(guó))，結(jié)果為陽(yáng)性，該培養(yǎng)上清即為即為hiv耐藥株病毒液，分裝后-80℃保存。

實(shí)施例2

突變病毒株的病毒感染力鑒定

將實(shí)施例1得到hiv耐藥株病毒液和實(shí)施例1的步驟3得到的hiv野生株病毒液分別進(jìn)行如下鑒定：

1、在96孔板中每孔加入100μl含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液。

2、吸取25μl待測(cè)病毒液于第1列孔中，混勻，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀釋11次，每個(gè)稀釋度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，設(shè)置最后一列不加入病毒液的孔作為對(duì)照孔。

3、每孔中加入100μlmt-4細(xì)胞液(mt-4細(xì)胞液是用含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液懸浮mt-4細(xì)胞得到的，100μlmt-4細(xì)胞液中含有10000個(gè)細(xì)胞)。37℃培養(yǎng)3天，取培養(yǎng)上清。

4、取熒光檢測(cè)96孔板(品牌：greiner；生產(chǎn)商：greinerbio-one；產(chǎn)地：德國(guó)；產(chǎn)品目錄號(hào)：655086)，每孔加入100μl步驟3得到的培養(yǎng)上清和100μltzm-bl細(xì)胞液(tzm-bl細(xì)胞液是用含體積百分比為10％的fbs的dmem培養(yǎng)液懸浮tzm-bl細(xì)胞得到的，100μltzm-bl細(xì)胞液中含有10000個(gè)細(xì)胞)，37℃培養(yǎng)1天，使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒(英文名：luciferaseassaysystem；品牌：promega；生產(chǎn)商：promegacorporation；產(chǎn)地：美國(guó)；產(chǎn)品目錄號(hào)：e1501)檢測(cè)病毒感染情況。

tcid50(tissuecultureinfectivedose,半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)指引起50％細(xì)胞發(fā)生感染(cytopathiceffect,cpe)的病毒量。

hiv耐藥株病毒液的病毒感染力為238932tcid50/ml。

hiv野生株病毒液的病毒感染力為297986tcid50/ml。

hiv耐藥株的病毒感染力較hiv野生株更強(qiáng)。

實(shí)施例3

突變病毒株的耐藥性鑒定

將實(shí)施例1的步驟2得到hiv耐藥株病毒液和實(shí)施例1的步驟3得到的hiv野生株病毒液分別進(jìn)行如下鑒定：

1、在96孔板中每孔加入100μl含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液。

2、使用rpmi1640培養(yǎng)液稀釋nvp，使nvp的濃度為10μm。

3、吸取25μl藥物溶液于第1列孔中，混勻，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀釋11次，每個(gè)稀釋度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，設(shè)置最后一列不加入藥物的孔作為對(duì)照孔。

4、取新的96孔板(用于細(xì)胞培養(yǎng))，每孔中加入100μlmt-4細(xì)胞液(mt-4細(xì)胞液是用含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液懸浮mt-4細(xì)胞得到的，100μlmt-4細(xì)胞液中含有10000個(gè)細(xì)胞)。

5、用pbs緩沖液調(diào)整待測(cè)病毒液的濃度，得到病毒量為4000tcid50/ml的病毒稀釋液。

6、在步驟4的細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入50μl步驟5的病毒稀釋液，然后分別每孔加入50μl步驟3配置的依次稀釋的藥物，37℃培養(yǎng)3天，取培養(yǎng)上清。

7、同實(shí)施例2的步驟4。

8、計(jì)算50％細(xì)胞出現(xiàn)cpe時(shí)的藥物濃度，即ic50值。

hiv耐藥株病毒液的ic50值為0.06127μm。

hiv野生株病毒液的ic50值為0.002899μm。

耐藥倍數(shù)＝hiv耐藥株病毒液的ic50值/hiv野生株病毒液的ic50值＝21.13。

sequencelisting.txt

<110>廣西醫(yī)科大學(xué)

<120>一種對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>1191

<213>野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶dna序列

<400>1

1cttaataagagaacccaagacttctgggaagttcaattaggcataccacatcccgcaggg

61ttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttccc

121ttagatgaagacttcaggaagtacactgcatttaccatacctagtataaacaatgagaca

181ccagggattagatatcaatacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaata

241ttccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagtt

301atctatcaatacatggatgacttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcataga

361gcaaaaatagaggatctgagacaacatctgttgaagtgggggtttaccacaccagacaaa

421aaacatcagaaagaacctccatttctttggatgggttatgaactccatcctgataaatgg

481acagtacagcctatagtgttgccagaaaaagacagctggactgtcaatgatatacagaag

541ttagtgggaaaattgaattgggcaagtcagatttatgcagggattaaagtaaagcaatta

601tgtaaactccttaggggaaccaaagcactaacagaagtagtaccactaacagaagaagca

661gagctagaactggcagaaaacagggagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattat

721gacccaacaaaagacttaatagcagagctacagaagcaggggcagggccaatggacatat

781caaatttatcaggagccatataaaaatctgaaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggt

841gcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaatagccacagaaagc

901atagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactacccattcaaaaggaaacatgggaa

961acatggtggacagattattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgtcaatacc

1021cctcccttagtgaaattatggtatcagttagagaaagaacccatagtatgagcagaaact

1081ttctatgtagatggagcagctaacagggacaccaaatcaggaaaagcaggatatgttact

1141gacagaggaagacaaaaagttgtctccctagctgacacacaaatcagagaa

<210>2

<211>475

<213>野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)序列

<400>2

1pispietvpvklkpgmdgpkvkqwplteekikalveictemekegkiskigpenpyntpv

61faikkkdstkwrklvdfrelnkrtqdfwevqlgiphpaglkkkksvtvldvgdayfsvpl

121dedfrkytaftipsinnetpgiryqynvlpqgwkgspaifqssmtkilepfrkqnpdivi

181yqymddlyvgsdleigqhrakiedlrqhllkwgfttpdkkhqkeppflwmgyelhpdkwt

241vqpivlpekdswtvndiqklvgklnwasqiyagikvkqlckllrgtkaltevvplteeae

301lelaenreilkepvhgvyydptkdliaelqkqgqgqwtyqiyqepyknlktgkyarmrga

361htndvkqlteavqkiatesiviwgktpkfklpiqketwetwwtdywqatwipewefvntp

421plvklwyqlekepivaetfyvdgaanrdtksgkagyvtdrgrqkvvsladtqire

<210>3

<211>1191

<213>耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶dna人工序列

<400>3

1cttaataagagaacccaagacttctgggaagttcaattaggcataccacatcccgcaggg

61ttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttccc

121ttagatgaagacttcaggaagtacactgcatttaccatacctagtataaacaatgagaca

181ccagggattagatatcaatacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaata

241ttccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagtt

301atctgtcaatacatggatgacttgtgtgtaggatctgacttagaaatagggcagcataga

361gcaaaaatagaggatctgagacaacatctgttgaagtgggggtttaccacaccagacaaa

421aaacatcagaaagaacctccatttctttggatgggttatgaactccatcctgataaatgg

481acagtacagcctatagtgttgccagaaaaagacagctggactgtcaatgatatacagaag

541ttagtgggaaaattgaattgggcaagtcagatttatgcagggattaaagtaaagcaatta

601tgtaaactccttaggggaaccaaagcactaacagaagtagtaccactaacagaagaagca

661gagctagaactggcagaaaacagggagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattat

721gacccaacaaaagacttaatagcagagctacagaagcaggggcagggccaatggacatat

781caaatttatcaggagccatataaaaatctgaaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggt

841gcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaatagccacagaaagc

901atagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactacccattcaaaaggaaacatgggaa

961acatggtggacagattattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgtcaatacc

1021cctcccttagtgaaattatggtatcagttagagaaagaacccatagtatgagcagaaact

1081ttctatgtagatggagcagctaacagggacaccaaatcaggaaaagcaggatatgttact

1141gacagaggaagacaaaaagttgtctccctagctgacacacaaatcagagaa

<210>4

<211>475

<213>耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)人工序列

<400>4

1pispietvpvklkpgmdgpkvkqwplteekikalveictemekegkiskigpenpyntpv

61faikkkdstkwrklvdfrelnkrtqdfwevqlgiphpaglkkkksvtvldvgdayfsvpl

121dedfrkytaftipsinnetpgiryqynvlpqgwkgspaifqssmtkilepfrkqnpdivi

181cqymddlcvgsdleigqhrakiedlrqhllkwgfttpdkkhqkeppflwmgyelhpdkwt

241vqpivlpekdswtvndiqklvgklnwasqiyagikvkqlckllrgtkaltevvplteeae

301lelaenreilkepvhgvyydptkdliaelqkqgqgqwtyqiyqepyknlktgkyarmrga

361htndvkqlteavqkiatesiviwgktpkfklpiqketwetwwtdywqatwipewefvntp

421plvklwyqlekepivaetfyvdgaanrdtksgkagyvtdrgrqkvvsladtqire