本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合癥(porcinereproductiveandrespriratorysyndrome，prrs)又稱藍耳病，是一種由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(prrsv)引起的重要的豬烈性傳染病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。prrs滅活疫苗基本無效，prrs弱毒疫苗具有免疫保護快、效力高等優(yōu)勢，是當(dāng)前我國防控prrs的唯一手段。但是，prrs弱毒疫苗株易于變異、遺傳穩(wěn)定性差，從而導(dǎo)致免疫原性易丟失、毒力易于返強。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株，該毒株突變率低、遺傳穩(wěn)定性較高，傳100代次后，仍然保持原有免疫原性和毒力，該毒株對于高致病性藍耳病具有良好保護力。

本發(fā)明的另一目的是提供豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗，該弱毒疫苗對于高致病性藍耳病具有良好保護力，安全性更高。

本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株，是豬繁殖與呼吸綜合癥病毒prrsv-njrb株，其微生物保藏號是：cgmccno.13800。

在本發(fā)明中，所述弱毒株的orf5基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

在本發(fā)明中，所述弱毒株的nsp2基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

本發(fā)明還提供所述高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株病毒液的制備方法，包括如下步驟：采用marc-145細胞增殖權(quán)利要求1所述高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株，裂解細胞，離心取上清液，得到病毒液。

本發(fā)明還提供豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒疫苗，活性成分為所述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株。

本發(fā)明還提供所述豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒在制備豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒疫苗方面的應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有弱毒株及其疫苗的有益效果：

1.本發(fā)明通過誘變劑的加壓，篩選到了高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株，該毒株與prrsvnj株相比，改變了prrsvnj株組織嗜性，顯著降低了對肺臟組織的嗜性；體外保真性能提高5倍以上，遺傳穩(wěn)定性好；安全性更高，免疫豬體內(nèi)連續(xù)傳代5次，主要保護性抗原基因orf5和關(guān)鍵毒力基因nsp2突變頻率下降3倍，解決了現(xiàn)有prrsv活疫苗由于遺傳穩(wěn)定性差導(dǎo)致的免疫原性易丟失、毒力易于返強的世界性難題。本發(fā)明高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株種毒連續(xù)傳代100代后，仍然保持原有免疫原性和毒力，仍然可以用于制備弱毒疫苗，顯著降低了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)效率。

2.采用本發(fā)明弱毒疫苗免疫后，能夠為接種動物提供100％的保護。

附圖說明

圖1是orf5和nsp2基因pcr擴增產(chǎn)物電泳圖，其中m為dnamarker，1，2，3為orf5擴增片段；4，5，6為nsp2擴增片段。

圖2是高保真毒株prrsv-njrb株接種pam細胞cpe觀察圖，a：prrsv-njrb株；b：prrsv-nj株；c：空白對照。

圖3是prrsv-njrb株仔豬體內(nèi)組織嗜性鑒定圖，**表示p＜0.01。

具體實施方式

實施例1prrsvnj株在marc-145細胞上傳代致弱

1.細胞培養(yǎng)

marc-145細胞生長在細胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。marc-145細胞長成單層后用于接種病毒。細胞培養(yǎng)液：含10％(體積百分濃度)滅活(56℃處理30min)的犢牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素，濃度均為100u/ml)的dmem細胞培養(yǎng)液。

2.prrsvnj株的培養(yǎng)

prrsvnj-a株是從南京某急性發(fā)病豬群中分離的美洲型prrsv強毒(公開于鄭其升,李鵬,曹瑞兵,候繼波,陳溥言等，共表達prrsv修飾的gp5與m蛋白的重組改良型痘苗病毒安卡拉株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性，生物工程學(xué)報，2008,24(5):766-773)。在本發(fā)明中將公開于“共表達prrsv修飾的gp5與m蛋白的重組改良型痘苗病毒安卡拉株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性”中的prrsvnj-a株作為種毒。另外，在本發(fā)明中，將prrsvnj-a株縮寫為prrsvnj株。將prrsvnj株種毒在長成單層的marc-145細胞上連續(xù)傳代，當(dāng)細胞病變達到70％～80％時收獲病毒，反復(fù)凍融3次，再進行繼續(xù)傳代，直至第100代。在第60代以后每隔10代，挑選1～2個噬斑病毒，分別標記為nj代次-1、nj代次-2。用仔豬對各代次病毒進行毒力測定，具體方法如下：將各代次病毒接種5頭仔豬，每頭接種1ml(病毒含量見表1)，觀察體溫及發(fā)病、死亡的仔豬數(shù)量(結(jié)果見表1)。結(jié)果顯示：prrsvnj株f80以后毒力顯著下降，均為弱毒株。

表1prrsvnj株不同代次對仔豬的致病性測定結(jié)果

實施例2高保真prrsv弱毒株培育及體外鑒定

1.prrsv種毒化學(xué)誘變連續(xù)傳代

誘變連續(xù)傳代：采用細胞培養(yǎng)液(成分同實施例1中)培養(yǎng)marc-145細胞至70％融合，然后加入終濃度為200μm的誘變劑ribavirin(病毒唑，購自sigma公司)預(yù)處理2h，去掉培養(yǎng)液，按照moi為1加入prrsvnj株f80代(prrsvnj株種毒采用marc-145細胞傳代80代后獲得的病毒，該病毒為弱毒株)，感染1h，pbs緩沖液洗兩遍；然后，加含有200μm誘變劑的細胞培養(yǎng)液(成分同實施例1中)繼續(xù)培養(yǎng)，最后收獲病毒。病毒按照上述方法連續(xù)傳代20代。

同時設(shè)立對照組，對照組處理中不加入誘變劑，其他同誘變連續(xù)傳代方法。

2.高保真prrsv種毒噬斑純化

將本實施例標題1中經(jīng)誘變連續(xù)傳20代后的病毒進行克隆純化，具體方法如下：將marc-145細胞在六孔板中培養(yǎng)至單層；用細胞培養(yǎng)液(成分同實施例1中)對待純化病毒作適當(dāng)稀釋，接種前棄去細胞培養(yǎng)液，用5ml的pbs緩沖液或細胞培養(yǎng)液沖洗單層細胞，每孔加0.2ml病毒稀釋液，對照組中用細胞培養(yǎng)液代替，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附1h，每15min搖動一次，以便使病毒均勻分布；pbs緩沖液洗滌未吸附的病毒；取2倍濃縮的細胞培養(yǎng)液加入等體積的2％瓊脂溶液(預(yù)熱)中，每孔加入1ml，置平臺待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3d；以彎頭吸管在瓊脂層下吸取若干蝕斑收獲病毒，然后分別接種到預(yù)先制備好的單層細胞的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，再進行2輪噬斑純化，挑選能夠在marc-145細胞生長、但是不能在pam(豬肺泡巨噬細胞)上生長的克隆病毒，最終獲得豬繁殖與呼吸綜合癥病毒prrsv-njrb株。將此處通過噬斑純化獲得的病毒作為種毒。prrsv-njrb株種毒的orf5基因的核苷酸序列如seqidno:1所示，nsp2基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

3.高保真prrsv毒株鑒定

將prrsv-njrb株種毒采用marc-145細胞傳代至第50代，獲得prrsv-njrb株f50代，從中挑取50個克隆病毒；另外將prrsvnj株f100代(prrsvnj株種毒傳代100代獲得的病毒，縮寫為未誘變病毒)采用marc-145細胞同樣傳代至第50代，并從未誘變病毒f50代中挑取50個克隆病毒。

(1)trizol法提取病毒rna

分別提取上述100個克隆病毒的rna。具體方法如下：將收獲的噬斑病毒400μl加入600μl的trizol試劑(takara)，充分裂解；加氯仿0.2ml，輕搖15s；室溫靜置5min，4℃、12000g離心15min，取上清無色水相(約500μl)至1.5mlrnase-freeep管中，加500μl異丙醇，上下顛倒ep管混勻，室溫靜置10min；4℃、12000g離心10min，棄去上清，采用1ml75％乙醇水溶液(depc水配制)洗滌，4℃、12000g離心10min；去上清，室溫干燥10min，加rnase-freedh2o(takara)20μl溶解，ep管內(nèi)溶液即為rna樣品。

(2)cdna的合成

應(yīng)用primescript^tmcdna合成試劑盒(takara)將上述各病毒的rna進行反轉(zhuǎn)錄得到cdna，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)高變基因片段pcr擴增

主要保護性抗原基因orf5和關(guān)鍵毒力基因nsp2是公認的prrsv全基因組中的高變區(qū)，我們分別設(shè)計擴增orf5和nsp2片段的引物，pcr擴增目的基因后送公司測序。

orf5片段上游引物：5’-atgaggtgggcaaccgttttag-3’；

orf5片段下游引物：5’-gtaatggaaaacgccaaaagcacct-3’。

nsp2片段上游引物：5’-ggtttggcagacataagtggt-3’；

nsp2片段下游引物：5’-ccttgagaaagcacataagctcc-3’。

pcr反應(yīng)體系為：上、下游引物(10pmol/l)各1μl，dntps(2.5mmol/l)2.0μl，5×primestargxlbuffer5μl，cdna模板2.0μl，primestargxl長鏈高保真酶(1.25u/μl)0.5μl，滅菌雙蒸水補足體積至25μl。pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性反應(yīng)30s，53℃退火反應(yīng)45s，72℃延伸反應(yīng)45s，進行35次循環(huán)，下一次循環(huán)退火溫度比前一次循環(huán)退火溫度增加0.2℃(退火溫度的起始值是53℃)；最后72℃延伸10min。對照中用純水替代cdna。反轉(zhuǎn)錄及pcr反應(yīng)中所用試劑均來源takara公司。

采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr擴增產(chǎn)物。從圖1，可以看出擴增產(chǎn)物orf5片段的大小約為725bp，nsp2片段的大小約為2962bp。將pcr產(chǎn)物送公司進行測序分析。結(jié)果見表2，prrsv-njrb株f50代(縮寫為rb50)orf5基因的突變頻率顯著低于未誘變病毒，突變頻率(即突變數(shù)/10³nt)由1.86下降至0.37，即下降5倍；氨基酸突變頻率(即突變數(shù)/10³aa)從4.88降低至0.99。從表3可見，prrsv-njrb株f50代(縮寫為rb50)nsp2基因的突變頻率亦顯著低于未誘變病毒，突變頻率從2.06下降至0.2，下降了10.3倍；氨基酸突變頻率從3.22降低至0.4，即即下降了8.05倍。以上結(jié)果表明，與未誘變病毒相比，prrsv-njrb株基因突變率顯著下降、遺傳穩(wěn)定性顯著提高，體外保真性能極顯著提高。由于orf5是prrsv主要保護性抗原基因，nsp2是prrsv的關(guān)鍵毒力基因，因此prrsv-njrb株的免疫原性不易丟失、毒力不易反強。因此，prrsv-njrb株是高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株。

表2orf5基因及氨基酸序列在誘變病毒及未誘變病毒中突變頻率比較結(jié)果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.*p<0.05,**p<0.01.

表3nsp2基因及氨基酸序列在誘變病毒及未誘變病毒中突變頻率比較結(jié)果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01。

將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒prrsv-njrb株種毒，進行保藏，保藏信息如下：

參椐的生物材料(株)：prrsv-njrb；

分類命名：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒porcinereproductiveandrespriratorysyndromevirus；

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)；

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；

保藏日期：2017年5月24日；

保藏編號：cgmccno.13800。

實施例3高保真prrsv弱毒株組織嗜性鑒定

將prrsv-njrb株種毒分別接種pam(豬肺泡巨噬細胞)和marc-145細胞(moi＝1)，連續(xù)傳代5次，觀察每代次病毒cpe(細胞病變效應(yīng))變化，另收獲不同代次病毒進行滴度測定。同時將prrsvnj株f80代采用相同方法傳代5次，作為對照組。結(jié)果顯示：prrsv-njrb株第一代毒njrbp1(是指種毒傳1代后，得到的病毒)接種pam細胞未見cpe，而對照組出現(xiàn)典型cpe(圖2)，prrsv-njrb株以后各代次也均未見cpe出現(xiàn)(結(jié)果未顯示)。病毒滴度測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明：prrsv-njrb株與prrsvnj株相比，改變了prrsvnj株組織嗜性，顯著降低了對肺臟組織的嗜性。

表4prrsv-njrb株接種pam與marc-145細胞后病毒滴度比較結(jié)果

注：表4中njrbp1表示prrsv-njrb株種毒傳1代后，得到的病毒，其他的依次類推；njp1表示prrsvnj株種毒傳1代后，得到的病毒，其他依次類推。(表中l(wèi)og10表示病毒滴度取以10為底的對數(shù))。

實施例4prrsv-njrb株仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代遺傳穩(wěn)定性評價

1.試驗用豬

篩選prrsv血清抗原、抗體雙陰性仔豬。

血清抗原檢測方法如下：采集30日齡仔豬血液樣品，分離血清。血清提取總rna后采用primescript^tmcdna合成試劑盒(takara)反轉(zhuǎn)錄成cdna，應(yīng)用prrsvorf5特異性引物(orf5上、下游引物)擴增，檢測prrsv抗原。

orf5上游引物：5’-atgaggtgggcaaccgttttag-3’；

orf5下游引物：5’-gtaatggaaaacgccaaaagcacct-3’。

prrsv血清抗體應(yīng)用idexx試劑盒(美國愛德士公司)檢測，操作步驟按照說明書。

2.prrsv-njrb株在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代以評價遺傳穩(wěn)定性

將prrsv-njrb株種毒在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代5次，通過基因測序檢測評價其遺傳穩(wěn)定性。將prrsv-njrb株種毒接種30日齡、prrsv血清抗原、抗體雙陰性仔豬，每頭仔豬接種2ml(10^6.0tcid50/ml)病毒液，接種后20天，從仔豬體內(nèi)分離病毒，然后再傳至30日齡、prrsv血清抗原、抗體雙陰性仔豬，按照此方法在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代5次。最后一次傳代時，每日觀察臨床變化，于接種后0d、7d、14d、21d、28d采集血液分離血清采用rt-pcr法(參照實施例2)檢測病毒血癥。接種后28天剖殺，取肺、支氣管淋巴結(jié)、扁桃體進行組織病毒分離培養(yǎng)。將肺、支氣管淋巴結(jié)、扁桃體組織病料碾磨搗碎后用無菌pbs緩沖液制成1：10的組織懸液，加青、鏈霉素，置4℃冰箱作用4h后，8000rpm離心20min；取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾除菌；取濾液接種于marc-145細胞單層，37℃吸附1h后換含2％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察cpe情況，當(dāng)cpe達到75％以上時收獲細胞毒液。該病毒液凍融三次后，接種marc-145細胞，挑取50個蝕斑克隆(對應(yīng)于表5、6中的p5)，采用rt-pcr擴增orf5和nsp2基因，將擴增片段送公司測序，方法參照實施例2中標題3。采用上述相同方法將prrsvnj株種毒在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代5次后，挑取50個蝕斑克隆(對應(yīng)于表5、6中的對照病毒)，采用rt-pcr擴增orf5和nsp2基因，將擴增片段送公司測序，作為對照組。

結(jié)果見表5、表6，prrsv-njrb株種毒在仔豬體內(nèi)連傳5代后發(fā)現(xiàn)，orf5基因(表5)突變頻率顯著低于對照病毒，突變頻率由2.19下降至0.73，下降3倍，氨基酸突變頻率從5.17降低至2.79。nsp2基因(表6)突變頻率亦顯著低于對照病毒，突變頻率從2.48下降至0.39(即下降了6.4倍)，氨基酸突變從3.54下降至0.53(下降了6.7倍)。以上結(jié)果表明：prrsv-njrb株在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代時，遺傳穩(wěn)定性高，是高保真弱毒株。

表5prrsv-njrb株在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代5次后orf5突變頻率比較結(jié)果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.*表示p<0.05,**表示p<0.01.

表6prrsv-njrb株在仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代5次后nsp2突變頻率比較結(jié)果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.*表示p<0.05,**表示p<0.01.

實施例5prrsv-njrb株免疫原性鑒定

將prrsv-njrb株種毒接種marc-145單層細胞，當(dāng)細胞病變達到70％～80％時收獲細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，離心取上清液作為prrsv-njrb株f1代病毒液；將f1代病毒接種marc-145細胞培養(yǎng)，同樣待細胞病變達到70％～80％時收獲細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，離心取上清液作為prrsv-njrb株f2代病毒液；以此類推，收獲prrsv-njrb株f100代病毒液。測定prrsv-njrb株f100代病毒液滴度。按照相同方法，將prrsvnj株種毒采用marc-145單層細胞傳代至第80代，得到prrsvnj株f80代病毒液。

將prrsv-njrb株種毒及其f100代病毒液、prrsvnj株f80代病毒液分別采用dmem培養(yǎng)基稀釋至病毒含量為1.0×10^5.0tcid50/ml，作為以下接種試驗中的疫苗。

將4～6周齡prrsv病毒血清抗原、抗體陰性仔豬20頭，隨機分為4組，第一組：高保真弱毒疫苗組(免疫prrsv-njrb株種毒)；第二組：高保真弱毒疫苗組(免疫prrsv-njrb株f100代)；第三組：對照病毒疫苗組(免疫prrsvnj株f80代)；第四組：空白對照組。免疫當(dāng)天，第一組每頭仔豬肌肉注射2mlprrsv-njrb株種毒(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第二組每頭仔豬肌肉注射2mlprrsv-njrb株f100代病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第三組每頭仔豬肌肉注射2mlprrsvnj株f80代病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第四組每頭仔豬肌肉注射2mldmem培養(yǎng)基。于免疫后28天肌肉注射攻毒用強毒prrsvnj株病毒液(10^6.0tcid50/ml)2ml，每日觀察體溫，記錄臨床癥狀及發(fā)病數(shù)量；分別于攻毒后0、7、14、21、28天采集血液檢測病毒血癥(rt-pcr，參照實施例2)，連續(xù)觀察28天。攻毒后28天剖檢，觀察大體解剖。

發(fā)病豬判定標準：1)至少3日體溫在41℃以上；或精神食欲下降，眼結(jié)膜炎，有咳嗽、喘等呼吸道癥狀；2)大體剖檢中發(fā)現(xiàn)肺部出現(xiàn)片狀實變；3)病毒血癥，攻毒后用rt-pcr檢測仔豬血清，prrsv病毒血癥至少持續(xù)28日。符合以上兩條，即可判為發(fā)病。

結(jié)果顯示：免疫后，各組仔豬均正常，無發(fā)燒、厭食等臨床癥狀。攻毒后，第一、第二組所有仔豬體溫均正常，第三組有1頭仔豬體溫達到41°以上1天，第一、第二、第三組試驗結(jié)束后未見臨床發(fā)病癥狀，病理剖檢結(jié)果顯示為100％保護(5/5)?？瞻讓φ战M于攻毒后3天，所有仔豬的體溫均達到41℃以上，41℃以上最多累計達到10天；并且仔豬臨床表現(xiàn)有厭食、咳嗽、呼吸困難等癥狀，攻毒后10天開始死亡，至試驗結(jié)束時5頭仔豬全部死亡，病理剖檢符合臨床發(fā)病標準。上述結(jié)果證明：prrsv-njrb株種毒連續(xù)傳代100代后，仍然保持原有免疫原性和毒力，仍然可以用于制備弱毒疫苗，將顯著降低了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)效率。

實施例6prrsv-njrb株仔豬體內(nèi)組織嗜性鑒定

prrsv-njrb株病毒液制備方法同實施例5。

將4～6周齡prrsv病毒血清抗原、抗體陰性仔豬15頭，隨機分為3組，第一組：高保真弱毒株試驗組；第二組：對照毒試驗組；第三組：空白對照組。接種當(dāng)天，第一組每頭仔豬肌肉注射2mlprrsv-njrb株f100病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第二組每頭仔豬肌肉注射2mlprrsvnj株f80病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第三組每頭仔豬肌肉注射2mldmem培養(yǎng)基。于接種后14天剖檢，采集肺臟、扁桃體、支氣管淋巴結(jié)、肌肉組織，分離prrsv，realtimepcr定量分析病毒含量(t.opriessnig,n.e.mckeown,k.l.harmon,etal.porcinecircovirustype2infectiondecreasestheefficacyofamodifiedliveporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvaccine.clinicalandvaccineimmunology,.2006,13(8),923–929.)。

結(jié)果顯示(圖3)：prrsv-njrb株接種仔豬后，病毒在扁桃體、支氣管淋巴結(jié)、肌肉組織中增殖均良好，與對照病毒(prrsvnj株f80病毒液)相比無明顯差異；而在肺組織中對照病毒肺組織中滴度為10^4.3±0.12tcid50/g，而prrsv-njrb株基本不能增殖，組織中病毒滴度為10^0.8±0.07tcid50/g，下降超過1000倍。該結(jié)果與體外檢測prrsv-njrb株組織嗜性一致。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>高保真豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒株及其應(yīng)用

<130>20170626

<160>2

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<213>豬繁殖與呼吸綜合癥病毒

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