本發(fā)明涉及金屬配合物，具體涉及一種皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是生物體內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用的一類酶，它能夠特異性去除蛋白酪氨酸殘基上的磷酸基團，從而廣泛影響細胞生長、分化、遷移、凋亡和免疫應(yīng)答等過程。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是第一個被發(fā)現(xiàn)和純化的PTP酶，它通過對胰島素受體及其底物的酪氨酸殘基去磷酸化，從而對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進行負調(diào)控。研究表明敲除PTP1B基因的小鼠對胰島素的敏感性和葡萄糖的耐受性都明顯增強并且正常生長。目前PTP1B被公認為是研發(fā)治療Ⅱ型糖尿病藥物的作用靶點。因此，尋找與PTP1B進行特異性結(jié)合和作用的小分子，研究小分子和PTP1B相互作用，則成為研發(fā)以PTP1B為靶點的新藥的基礎(chǔ)。

釩配合物具有類胰島素的作用，并且已經(jīng)在糖尿病的治療中表現(xiàn)出了一定的效果。研究表明釩配合物的類胰島素作用與其對PTP1B的抑制有關(guān)。目前除BMOV外，一些氧釩配合物也具有類胰島素性質(zhì)，但是配位形式為VO2(NNO)的配合物類胰島素性質(zhì)報道較少，并且對于雙氧釩配合物對細胞內(nèi)PTP1B活性的抑制的研究很少，所以我們制備并研究了基于PTP1B靶點的具有類胰島素性質(zhì)的皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物，為糖尿病的治療提供了一種新的藥物開發(fā)途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物及其制備方法，以及作為一

種PTP1B選擇性抑制劑和在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物，分子式為：VO₂(HPPCH)，其中H₂PPCH為N'-皮考啉基皮考啉腙酸(N'-picolinoylpicolino-hydrazonic acid),該配合物結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明提供的一種皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將VOSO₄溶解于蒸餾水中，將上述溶液滴加到N'-(吡啶-2-亞甲基)吡啶甲酰肼的甲醇溶液中，VOSO₄與N'-(吡啶-2-亞甲基)吡啶甲酰肼的摩爾比為1-2:1，優(yōu)選2:1；

(2)室溫攪拌8-10小時，過濾，得到紅棕色濾液，室溫緩慢揮發(fā)，3天后有紅棕色塊狀晶體析出。

本發(fā)明制備的皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物的晶體屬于單斜晶系，空間群為P2₁/c，晶胞參數(shù)為：α＝90.00°，β＝109.44(3)°,γ＝90.00°。

X射線粉末衍射證實該配合物晶體樣品均一穩(wěn)定。電噴霧質(zhì)譜表明該配合物在溶液中能夠穩(wěn)定存在，其組分與固體一致。半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)測定證明該配合物能夠高效且選擇性地抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的活性，蛋白免疫印跡實驗表明該配合物能夠強烈地增強人肝癌細胞(HepG2)內(nèi)PTP1B底物的磷酸化水平，從而證明該配合物能夠有效抑制人肝癌細胞(HepG2)內(nèi)PTP1B的活性。細胞毒性實驗表明該配合物的細胞毒性低于VOSO₄。因此，本發(fā)明的配合物不僅可用作高效低毒的蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制劑，而且可以在制備抗糖尿病藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

本發(fā)明的配合物生產(chǎn)成本較低，合成方法簡單，過程易控制，配合物穩(wěn)定，晶體易得，產(chǎn)率高，能夠強烈抑制人肝癌細胞(HepG2)內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸酶1B的活性，具有比VOSO₄更優(yōu)越的抑制細胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶1B的活性的性能，且細胞毒性小于VOSO₄，為糖尿病治療提供了一種新的藥物開發(fā)途徑。

附圖說明

圖1本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)的晶體結(jié)構(gòu)圖。

圖2本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)在298K的X射線粉末衍射圖(實驗及模擬圖)。

圖3本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)的電噴霧質(zhì)譜圖。

圖4本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)抑制PTPs活性的IC₅₀值測定曲線。

圖5本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)、VOSO₄、配體對人肝癌細胞(HepG2)內(nèi)PTP1B底物的影響。

圖6本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)對人肝癌細胞(HepG2)細胞活力的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)的制備及晶體培養(yǎng)方法。

稱取0.049g(0.3mmol)VOSO₄溶解于5mL蒸餾水中，將上述溶液滴加到0.034g(0.15mmol)N'-(吡啶-2-亞甲基)吡啶甲酰肼的10mL甲醇溶液中,室溫攪拌8小時，過濾，得到紅棕色濾液，室溫緩慢揮發(fā)，3天后有紅棕色塊狀晶體析出,抽濾，分別用水、甲醇、乙醚洗滌三次，真空干燥，產(chǎn)率為60％。元素分析：理論值：C44.46，H 2.80，N17.28；實驗值:C 44.37，H 2.94,N 17.16。

實施例2.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)的晶體結(jié)構(gòu)測定和結(jié)果。

晶體結(jié)構(gòu)測定采用北京同步輻射源，使用MARCCD-165探測器收集衍射數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)經(jīng)HKL2000還原后，用SHELXL-97直接發(fā)解得晶體結(jié)構(gòu),C原子采用理論加氫,N原子通過差值傅里葉圖加氫，詳細的晶體測定數(shù)據(jù)見表1。結(jié)構(gòu)見圖1。

表1配合物的晶體學數(shù)據(jù)

實施例3.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)的粉末衍射。

X-射線粉末衍射結(jié)果表明，晶體樣品物相均一，實驗衍射圖譜與依據(jù)晶體結(jié)構(gòu)模擬的粉末衍射圖譜一致，見圖2。

實施例3.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)的電噴霧質(zhì)譜。

為了研究配合物在溶液中的存在形式，將適量的配合物固體粉末溶于甲醇中，振蕩使其溶解達到飽和，并離心得到澄清透明溶液，上樣至電噴霧質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源，以正離子方式檢測樣品并記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖3是配合物的電噴霧質(zhì)譜圖，在電噴霧質(zhì)譜圖中能觀察到配合物相應(yīng)的分子離子峰。表2是配合物的正離子電噴霧質(zhì)譜歸屬。結(jié)果表明，該結(jié)果與元素分析所得結(jié)果一致，表明配合物在溶液中以我們設(shè)計的結(jié)構(gòu)形式穩(wěn)定存在。

表2配合物的正離子電噴霧質(zhì)譜歸屬

實施例4.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)對PTP1B活性抑制及其選擇性測定。

IC₅₀測定原理：

IC₅₀即半數(shù)抑制濃度，是引起酶活性下降至原酶活性一半時所需抑制劑的濃度，IC₅₀值是用來評判抑制劑抑制能力大小的標準。其數(shù)值越低，表明抑制劑的抑制能力越強。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)能使反應(yīng)底物對硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)分解成黃色的對硝基苯酚(pNP)，該產(chǎn)物在405nm處有很強的吸收。PTPs與配合物作用后，通過檢測405nm處吸光度值的變化來間接檢測酶活性的變化情況。

IC₅₀的測定方法：

進行IC₅₀值測定實驗時，首先將抑制劑配制成10^-2M的DMSO母液,然后稀釋到一系列梯度的適宜濃度,用現(xiàn)配的緩沖溶液溶解PTPs使其濃度適宜，備用。抑制劑抑制PTPs的活性實驗是在96孔板中進行,前三排加入83μL含酶的MOPS緩沖溶液(50mM NaCl，20mM MOPS,pH＝7.2)，最后一排加入不含酶的MOPS緩沖溶液作為對照。再以列為單位，依次加入10μL不同濃度梯度的抑制劑,置于37℃恒溫水浴鍋反應(yīng)30分鐘后，向上述溶液加入2μL pNPP(0.1M)來啟動反應(yīng)，15分鐘后,用5μL(2M)NaOH終止反應(yīng)，通過酶標儀測定底物的分解產(chǎn)物pNP在405nm處各孔的紫外吸收值。以配合物濃度的對數(shù)作為橫坐標，抑制率作為縱坐標，用Origin程序作圖，擬合得到配合物對酶抑制能力的曲線，從而求得IC₅₀值。實驗重復(fù)三次以上。

實驗結(jié)果：本發(fā)明配合物對PTP1B，TCPTP,SHP-1，SHP-2的半抑制濃度(IC₅₀)分別為0.13μM，0.98μM，2.02μM和16.26μM。配合物對PTP1B的抑制能力分別是TCPTP,SHP-1，SHP-2的7,15和125倍。由此可見，該配合物能夠有效地抑制PTP1B活性，并且對PTP1B有較好的選擇性，見圖4。

實施例5.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)對人肝癌細胞(HepG2)內(nèi)PTP1B活性抑制的測定。

蛋白免疫印跡法測定原理：

蛋白免疫印跡法的基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。配合物作用細胞后，通過檢測細胞內(nèi)PTP1B底物的表達量變化來間接檢測細胞內(nèi)PTP1B活性的變化情況。

蛋白免疫印跡法步驟：

(1)樣品處理。將人肝癌細胞(HepG2)在含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)增長期，向培養(yǎng)皿內(nèi)加藥。實驗組分別加入終濃度為0.1、1、5、10μM的配合物VO₂(HPPCH)，10μM VOSO₄、10μM配體(N'-(吡啶-2-亞甲基)吡啶甲酰肼)，混合溶劑(DMSO(10％)+0.85％NaCl(90％))，對照組為空白細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h，7000rpm離心收集細胞，用裂解液在冰上裂解細胞50分鐘后，13000rpm離心10-15分鐘，緩慢吸取上清，BCA法測定蛋白濃度，分裝蛋白質(zhì)(每管80μg)，煮沸使蛋白質(zhì)變性，準備上樣。

(2)電泳分離。首先制備電泳凝膠(10％分離膠和5％濃縮膠)，將(1)中處理好的樣品及蛋白marker分別上樣于相應(yīng)泳道，進行電泳分離。

(3)蛋白的膜轉(zhuǎn)移。a電泳結(jié)束后將膠條切至合適大小，用電轉(zhuǎn)緩沖液平衡10分鐘；b預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜，浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10分鐘；c轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜裝置從下至上一次是陽極板-海綿-5層濾紙-PVDF膜-膠條-5層濾紙-海綿-陰極板。接通電源，恒壓110V,電轉(zhuǎn)2小時。

(4)免疫雜交與顯色-蛋白檢測。a封閉。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF膜用封閉液(0.5g/10mL脫脂奶粉)室溫封閉30分鐘；b將PVDF膜平整地放入雜交袋中，取2μL一抗加入1.0mL封閉液，混勻，加入雜交袋中PVDF膜印有蛋白質(zhì)的一側(cè)，平放，4℃過夜。本實驗中所用的一抗分別為p-Src(Y529),p-EGFR(Y1029),p-IRS-1(Y896)和(IR/IGF1R)[pYpYpY^{1158/1162/1163}]，GADPH為內(nèi)參；c TBST洗脫液洗脫PVDF膜3次，取二抗3μL加入1.5mL封閉液中，接二抗，室溫孵育1小時，用TBST洗脫液洗脫PVDF膜3次，準備曝光。本實驗中用的二抗為Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP；d將PVDF膜放置在暗盒內(nèi)，滴加發(fā)光液，反應(yīng)1-2分鐘，在暗室內(nèi)將X光片覆蓋在膜上，蓋好暗盒，曝光約5分鐘，顯影，定影。

實驗結(jié)果：隨著配合物濃度的增大，細胞內(nèi)PTP1B底物(p-Src(Y529),p-EGFR(Y1029),p-IRS-1(Y896)和(IR/IGF1R)[pYpYpY^{1158/1162/1163}])的磷酸化水平逐漸增強，并且本發(fā)明配合物的性能優(yōu)于陽性對照組VOSO₄,表明本發(fā)明配合物能夠強烈抑制細胞內(nèi)PTP1B的活性，見圖5。

實施例6.本發(fā)明配合物VO₂(HPPCH)對人肝癌細胞(HepG2)細胞毒性的測定。

MTT法測定原理：MTT全稱3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，商品名為噻唑藍，是一種黃顏色的染料，用于檢測細胞存活和增殖。外援性的MTT可透過細胞膜進入細胞，與活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成不溶于水的藍紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細胞培養(yǎng)皿底部。而死細胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會生成甲瓚。生成的甲瓚結(jié)晶能溶于二甲基亞砜，顯紫色，用酶標儀檢測490nm波長處溶液的吸收度值可間接反應(yīng)活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，甲瓚結(jié)晶形成的量與活細胞數(shù)成正比。

MTT法步驟：將人肝癌細胞(HepG2)在含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用MTT法檢測了本發(fā)明皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物對肝癌細胞(HepG2)的毒性，同時以VOSO₄為陽性對照，檢測本發(fā)明配合物隨時間和濃度變化對細胞活力的影響。實驗取對數(shù)生長期的HepG2細胞經(jīng)消化、離心收集后配制成1mL的細胞懸液，由血球計數(shù)板測得細胞懸液內(nèi)的細胞個數(shù)，取適量體積的該細胞懸液將其稀釋成細胞密度約為1×10^-4個/mL的細胞懸液，均勻接種于96孔板，每孔200μL，將96孔板放置在CO₂培養(yǎng)箱中孵化，至細胞單層鋪滿孔低，加入4個濃度梯度的配合物，每組設(shè)6個復(fù)孔。細胞繼續(xù)在CO₂培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)孵化72小時后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，然后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，繼續(xù)孵育4小時，小心吸去上清液，每孔加入200的DMSO溶液，振蕩10min，待底部藍色結(jié)晶狀固體完全溶解，用酶標儀測得各孔溶液490nm處的吸光度值A(chǔ)。

以藥物濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線。

細胞存活率(％)＝(A_實驗組/A_對照組)×100

實驗結(jié)果：圖6為相同濃度梯度的皮考啉腙酸衍生物雙氧釩(V)配合物和VOSO₄分別與HepG2細胞作用72小時后，它們對細胞活力的比較。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明配合物對人肝癌細胞(HepG2)有一定的毒性，但其毒性明顯要小于VOSO₄,因此，本發(fā)明配合物可用于PTP1B抑制劑和糖尿病治療的潛在藥物。