本發(fā)明涉及食用色素，特別是涉及一種高活性甘蔗花色苷的制備方法，該方法是從甘蔗中萃取和純化花色苷；屬于食品添加劑及保健食品
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：人工合成食用色素，是用煤焦油中分離出來的苯胺染料為原料制成的，故又稱煤焦油色素或苯胺色素，如合成莧菜紅、胭脂紅及檸檬黃等等。這些人工合成的色素因易誘發(fā)中毒、瀉泄甚至癌癥，對(duì)人體有害，故不能多用或盡量不用?；ㄉ?anthocyanin)是由花青素與各種單糖、二糖以糖苷鍵結(jié)合而成的糖基衍生化合物的總稱，是一種重要的水溶性天然色素。研究表明，花色苷具有抗氧化，抗突變，保護(hù)肝臟，預(yù)防心血管疾病，清除自由基，改善人體微循環(huán)等多重功效。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)各種植物花色苷類物質(zhì)進(jìn)行了大量研究，但花色苷類色素的市場(chǎng)遠(yuǎn)未飽和，仍有很大的發(fā)展空間。甘蔗渣是甘蔗經(jīng)破碎和提取蔗汁后的甘蔗莖的殘?jiān)?，是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)物。其成分主要為纖維素，半纖維素，木質(zhì)素，蛋白，淀粉和果膠類物質(zhì)等。目前對(duì)甘蔗渣的利用主要是制漿造紙，制備活性炭，水解發(fā)酵乙醇，生產(chǎn)畜禽飼料和堆肥等，而甘蔗渣中富含豐富的花色苷類物質(zhì)(主要為矢車菊素-3-o-葡萄糖苷)，是一種理想的天然食用色素資源。傳統(tǒng)的花色苷提取方法是溶劑萃取法，微波和超聲輔助提取法，純化方法主要有紙層析，薄層層析，柱層析，高效液相色譜法以及高速逆流色譜法等。上述提取方法得到的花色苷不僅含有大量的雜質(zhì)，而且影響花色苷的生物活性。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開始通過酶法制備花色苷，取得了一些成果，但由于酶具有高度專一性，單一的酶制劑并不能有效的分解植物組織釋放花色苷，并且不同的植物組織構(gòu)成不同，所需的酶的種類和組成也會(huì)有所差異，這些差異必定對(duì)酶的實(shí)用性提出更高要求。傳統(tǒng)純化方法中柱層析法應(yīng)用最為廣泛，但主要采用單一的大孔吸附樹脂，得到的花色苷雜質(zhì)成分高，產(chǎn)品活性較低，其它方法不僅得到的花色苷含量低，而且設(shè)備昂貴，嚴(yán)重影響其在食品，醫(yī)藥等領(lǐng)域的高值化應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前甘蔗花色苷提取過程中提取效率低和抗氧化活性差等問題，本發(fā)明以甘蔗皮或甘蔗渣為原料提取花色苷，提供了一種用甘蔗廢棄物制備高活性花色苷的方法，將制糖生產(chǎn)后的廢棄物變廢為寶，提高了甘蔗的利用率，延長(zhǎng)了甘蔗的生產(chǎn)鏈，大大提高了甘蔗的附加價(jià)值。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種高活性甘蔗花色苷的制備方法，包括以下步驟：1)取榨汁后的甘蔗渣，晾干，破碎，加入蒸餾水，用緩沖液調(diào)節(jié)ph3.0～5.0；將纖維素酶，半纖維素酶，果膠酶混合配制復(fù)合酶；將復(fù)合酶滅菌，混勻，加入到反應(yīng)液中，在40～50℃下攪拌浸提1～5h，將提取液滅酶1～10min，離心，真空濃縮，得到甘蔗花色苷粗提液；所述纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為(1～20):(1～20):(1～5)；所述復(fù)合酶的添加量為5～15mg/kg甘蔗渣；2)將步驟1)得到的甘蔗花色苷粗提液用去離子水稀釋至3～10g/l，用酸調(diào)節(jié)ph至1.0～3.0，然后將稀釋液經(jīng)裝有大孔吸附樹脂第一段色譜柱吸附，花色苷從溶液中交換到樹脂上，用水洗除去鹽、糖和其它雜質(zhì)；用洗脫劑洗脫，得到除雜后的洗脫液，將洗脫液真空濃縮，濃縮液為除雜后的花色苷溶液，將濃縮液稀釋至520nm處吸光值為0.3～1.2；3)將步驟2)中得到的花色苷稀溶液用酸調(diào)整ph到1.0～3.0，經(jīng)裝有葡聚糖凝膠樹脂的第二段色譜柱進(jìn)行吸附，用酸化甲醇洗脫，紫外-可見光分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)洗脫過程，收集520nm處的洗脫液，將洗脫液真空濃縮，濃縮液為花色苷純化液；4)將步驟3)中得到的花色苷純化液冷凍干燥，得到粉末狀的花色苷純化物。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，步驟2)所述第大孔吸附樹脂包括ab-8、d101、nka-9、da201或dm-130型號(hào)樹脂。優(yōu)選地步驟3)所述裝有葡聚糖凝膠的樹脂包括sephadexlh-20、sephadexg-25、sephadexg-50或sephadexg-100型號(hào)樹脂。優(yōu)選地，所述洗脫劑為酸化甲醇溶液，ph為1～3，其中甲醇體積含量為90～100％。優(yōu)選地，步驟2)所述真空濃縮所得蒸出液用于下次大孔吸附樹脂的洗脫。優(yōu)選地，步驟3)所述將洗脫液真空濃縮所得蒸出液用于下次葡聚糖凝膠樹脂的洗脫。優(yōu)選地，步驟3)所述紫外-可見光分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為500～560nm。優(yōu)選地，步驟2)和步驟3)所述的酸為鹽酸、硫酸、醋酸或檸檬酸。優(yōu)選地，步驟2)所述的用水洗除去鹽的水為去離子水、純凈水或超純水。優(yōu)選地，所述纖維素酶由葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和纖維二糖酶組成，果膠酶由果膠甲酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶組成。本發(fā)明用甘蔗廢棄物制備花色苷為高純度和高活性甘蔗花色苷，所得花色苷純化物包括矢車菊素-3-o-葡萄糖苷(cyanidin3‐o‐glucoside)，矢車菊素‐3，5‐o‐二葡萄糖苷(cyanidin3，5‐di‐o‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐阿魏酰‐5‐o‐葡萄糖苷(cyanidin3‐o‐feruloylglucoside‐5‐o‐glucoside)，芍藥色素‐3‐o‐葡萄糖苷(peonidin3‐o‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐丙二酰‐萄糖苷(cyanidin‐3‐o‐(malonyl)‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐丁二酰‐萄糖苷(cyanidin‐3‐o‐(succinyl)‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐咖啡酰葡萄糖苷‐5‐o‐丙二酰‐葡萄糖苷(cyanidin3‐o‐caffeoylglucoside‐5‐o‐malonylglucoside)，矢車菊素‐3‐(6‐乙酰)葡萄糖苷(cyanidin3‐(6”‐acetoyl)glucoside)，錦葵色素‐3‐o‐葡萄糖苷(malvidin3‐o‐glucoside)，矢車菊素‐7甲氧基‐3‐o‐(2‐沒食子酰)‐葡萄糖苷(7‐o‐methyl‐cyanidin‐3‐o‐(2”galloyl)‐galactoside)共10中花色苷的混合物。本發(fā)明所得到的花色苷純化物含量為47.33-60.75mg/100g甘蔗渣。本發(fā)明所述的甘蔗花色苷在制備預(yù)防和減緩抗氧化的功能食品和藥品中具有重要應(yīng)用。本發(fā)明所述纖維素酶由葡聚糖內(nèi)切酶，葡聚糖外切酶和纖維二糖酶組成，果膠酶由果膠甲酯酶，聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶組成。本發(fā)明根據(jù)甘蔗渣成分特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)纖維素酶，半纖維素酶和果膠酶配制成復(fù)合酶，通過三類酶的相應(yīng)配比，能溫和高效地將甘蔗渣組織分解，加速花色苷類物質(zhì)的釋放，同時(shí)保證了花色苷的生物活性。本發(fā)明作用于甘蔗渣細(xì)胞壁的纖維素，半纖維素和果膠，促使細(xì)胞內(nèi)和吸附在纖維素及細(xì)胞壁上的花色苷類物質(zhì)快速釋放，同時(shí)保證了其生物活性。其中，纖維素酶水解甘蔗渣中的纖維素，破壞其鏈狀結(jié)構(gòu)，半纖維素木聚糖結(jié)合在纖維素微纖維的表面，并相互連接構(gòu)成堅(jiān)硬的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，半纖維素酶可以水解半纖維素，降低其和纖維素的連接，從而協(xié)同纖維素酶增加對(duì)纖維素的作用，釋放細(xì)胞間和附著在纖維素上的花色苷，適量的果膠酶可以水解細(xì)胞膜的多糖類，改變細(xì)胞的通透性，釋放細(xì)胞內(nèi)的花色苷物質(zhì)。作為優(yōu)選技術(shù)方案，選用大孔吸附樹脂的型號(hào)為ab-8，洗脫劑為酸化甲醇(ph1.0)，洗脫流速為2～10bv/h。作為優(yōu)選技術(shù)方案，選用葡聚糖凝膠的型號(hào)為sephadexg-20，洗脫流速為30～100ml/h；紫外-可見光分光光度計(jì)的型號(hào)為：backmandu700，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為500～550nm。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：1)以甘蔗渣為原料提取花色苷，將制糖生產(chǎn)后的廢棄物變廢為寶，提高了甘蔗的利用率，延長(zhǎng)了甘蔗的生產(chǎn)鏈，大大提高了甘蔗的附加價(jià)值。2)本發(fā)明中復(fù)合酶可溫和并有效地提取甘蔗渣中的花色苷，產(chǎn)量增加20％以上，同時(shí)保證了花色苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性。3)大孔吸附樹脂-葡聚糖凝膠樹脂聯(lián)用進(jìn)行花色苷的純化，樹脂可連續(xù)進(jìn)樣，不需反復(fù)再生，并且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)洗脫液中的花色苷，此方法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分離迅速，得到的花色苷純化物保持了原始的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。附圖說明圖1為實(shí)施例1所得產(chǎn)物高含量甘蔗皮花色苷的ms總離子流圖。圖2為實(shí)施例1所得產(chǎn)物高含量甘蔗皮花色苷的ms/ms總離子流圖。具體實(shí)施方式為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限如此。實(shí)施例11.從甘蔗糖廠收集剛榨汁后的甘蔗渣，晾干后破碎，取500g甘蔗渣粉，加入5l的蒸餾水，用緩沖液調(diào)節(jié)ph至4.0。配制復(fù)合酶；復(fù)合酶由纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成，其中，纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為5:3:1。將上述復(fù)合酶混勻，滅菌，加入到提取罐中，加入量為8mg/kg甘蔗渣，在35℃下攪拌浸提2h，將提取液滅酶10min，3000r/min離心，真空濃縮，得到甘蔗花色苷粗提液a1。2.大孔樹脂ab-8和葡聚糖凝膠sephadexlh-20經(jīng)預(yù)處理后裝柱，采用玻璃層析柱(7.5mm×240mm)，將得到的濃縮液稀釋至4.2g/l，取1000ml稀釋液上樣，上樣流速控制4bv/h，流出液在520nm處的吸光值達(dá)到稀釋液十分之一時(shí)，吸附達(dá)到飽和。用純水以1.5bv/h流速?zèng)_洗5bv，洗去雜質(zhì)；然后用酸化甲醇(ph1.0)洗脫，收集洗脫液；將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，溫度40℃，轉(zhuǎn)速80r/min，得到除雜后的花色苷濃縮液。用酸化甲醇稀釋濃縮液，使最終稀釋液在520nm的吸光值為0.6。3.用鹽酸將步驟2得到的稀釋液ph調(diào)整為1.0，上樣0.40bv，用酸化甲醇(ph1.0)洗脫，洗脫流速為60ml/h，每10min收集洗脫液，并在520nm處測(cè)量吸光值，合并吸光值大于零的洗脫液，得到花色苷純化物a2，將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，溫度40℃，轉(zhuǎn)速80r/min，使固形物達(dá)到70％。4.將步驟3中濃縮液冷凍干燥，得到暗紅色粉末即為花色苷。實(shí)施例21.從甘蔗糖廠收集剛榨汁后的甘蔗渣，晾干后破碎，取750g甘蔗渣粉，加入7.5l的蒸餾水，用緩沖液調(diào)節(jié)ph至4.0。配制復(fù)合酶；復(fù)合酶由纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成，其中，纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為16:8:3。將上述復(fù)合酶混勻，滅菌，加入到提取罐中，加入量為8mg/kg甘蔗渣，在40℃下攪拌浸提4h，將提取液滅酶10min，3000r/min離心，真空濃縮，得到甘蔗花色苷粗提液b1。2.大孔樹脂d101和葡聚糖凝膠sephadexg-25經(jīng)預(yù)處理后裝柱，采用玻璃層析柱(7.5mm×240mm)，將得到的縮液稀釋至6.4g/l，取800ml稀釋液上樣，上樣流速控制3bv/h，流出液在520nm處的吸光值達(dá)到稀釋液十分之一時(shí)，吸附達(dá)到飽和。用純水以2.0bv/h流速?zèng)_洗6bv，洗去雜質(zhì)；然后用酸化甲醇(ph1.0)洗脫，收集洗脫液；將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，溫度40℃，轉(zhuǎn)速80r/min，得到除雜后的花色苷濃縮液。用酸化甲醇稀釋濃縮液，使最終稀釋液在519nm的吸光值為0.6。3.用鹽酸將步驟2得到的稀釋液ph調(diào)整為1.0，上樣0.52bv，用酸化甲醇(ph1.0)洗脫，洗脫流速為65ml/h，每10min收集洗脫液，并在520nm處測(cè)量吸光值，合并吸光值大于零的洗脫液，得到花色苷純化物b2，將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，溫度35℃，轉(zhuǎn)速80r/min，使固形物達(dá)到70％。4.將步驟3中濃縮液冷凍干燥，得到暗紅色粉末即為花色苷。實(shí)施例31.從甘蔗糖廠收集剛榨汁后的甘蔗渣，晾干后破碎，取839g甘蔗渣粉，加入8.39l的蒸餾水，用緩沖液調(diào)節(jié)ph至4.0。配制復(fù)合酶；復(fù)合酶由纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成，其中，纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為3:2:1。將上述復(fù)合酶混勻，滅菌，加入到提取罐中，加入量為14mg/kg甘蔗渣，在30℃下攪拌浸提5h，將提取液滅酶10min，3000r/min離心，真空濃縮，得到甘蔗花色苷粗提液c1。2.大孔樹脂nka-9和葡聚糖凝膠sephadexg-50經(jīng)預(yù)處理后裝柱，采用玻璃層析柱(7.5mm×240mm)，將得到的濃縮液稀釋至5.2g/l，取900ml稀釋液上樣，上樣流速控制4bv/h，流出液在520nm處的吸光值達(dá)到稀釋液十分之一時(shí)，吸附達(dá)到飽和。用純水以1.5bv/h流速?zèng)_洗5bv，洗去雜質(zhì)；然后用酸化甲醇(ph1.0)洗脫，收集洗脫液；將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，溫度40℃，轉(zhuǎn)速80r/min，得到除雜后的花色苷濃縮液。用酸化甲醇稀釋濃縮液，使最終稀釋液在520nm的吸光值為0.6。3.用鹽酸將步驟2得到的稀釋液ph調(diào)整為1.0，上樣0.65bv，用酸化甲醇(ph1.0)洗脫，洗脫流速為80ml/h，每10min收集洗脫液，并在523nm處測(cè)量吸光值，合并吸光值大于零的洗脫液，得到花色苷純化物c2，將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，溫度35℃，轉(zhuǎn)速80r/min，使固形物達(dá)到70％。4.將步驟3中濃縮液冷凍干燥，得到暗紅色粉末即為花色苷。上述實(shí)施例所得高含量甘蔗花色苷的理化性質(zhì)的測(cè)定：1).花色苷含量的測(cè)定采用ph示差法測(cè)定甘蔗皮花色苷總含量，并以矢車菊-3-o-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果表示為mg矢車菊-3-葡萄糖苷/100g樣品。ph示差法的具體操作：取甘蔗皮花色苷純化物定容到一定體積，3000r/min離心10min，分別取4ml上清液于兩個(gè)20ml離心管中，再分別加入6mlph1.0的kcl-hcl緩沖液和ph值為4.5的ch3coona-hcl緩沖液，混勻，平衡60min。用蒸餾水做空白對(duì)照，取1ml，使用紫外-可見分光光度計(jì)在λmax(甘蔗皮花色苷的最大吸收波長(zhǎng)，經(jīng)掃描確定)和700nm處分別測(cè)定吸光度a，按下列公式計(jì)算：花色苷含量(mg/100g)＝a/εl×mr×df×v/wt其中，吸光度a＝(amax—a700)ph1.0—(amax—a700)ph4.5式中：a—吸光度；ε—矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，29600；l—光程，1cm；mr—矢車菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子量，449.2；df—稀釋倍數(shù)；v：最終體積,ml；wt:原料質(zhì)量，g；amax：最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值；a700：700nm處的吸光值；ph1.0：在ph值為1.0的溶液中測(cè)量吸光度；ph4.5：在ph值為1.0的溶液中測(cè)量吸光度λmax的確定：取離心后的甘蔗皮花色苷提取液適量，以溶劑為空白，用du-730紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為200-800nm的范圍內(nèi)掃描其吸收光譜，得到甘蔗皮花色苷在可見光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)。ph1.0kcl-hcl緩沖液的配制：取125ml0.2mol/l的kcl溶液與375ml0.2mol/l的hcl溶液均勻混合，即得。ph4.5ch3coona-hcl緩沖液的配制：取400ml1mol/l的ch3coona溶液、240ml1mol/l的hcl溶液和360mlh2o均勻混合，即得。表1不同實(shí)施例中甘蔗花色苷含量花色苷純化物花色苷含量(mg/100g)a260.75±2.78b247.33±1.06c251.95±1.29本發(fā)明實(shí)施例所得到的花色苷純化物含量最低為47.33mg/100g甘蔗渣，最高為60.75mg/100g甘蔗渣，傳統(tǒng)水醇浸提得到的甘蔗各部分中花色苷總量為36.6mg/100g甘蔗干重(li,x.,etal.,determinationandcomparisonofflavonoidsandanthocyaninsinchinesesugarcanetips,stems,rootsandleaves.jsepsci,2010.33(9):p.1216-23)。相比傳統(tǒng)方法本發(fā)明中酶解法得到花色苷的含量增加了22.67～39.75％，效果顯著?，F(xiàn)有技術(shù)(何雄等，甘蔗皮花色苷的提取工藝及穩(wěn)定性初探.食品工業(yè)科技，2011(12)：第371-373，376頁(yè))提及將甘蔗表皮刮下，通過水醇輔以超聲浸提，得到甘蔗花色苷的含量達(dá)到288.06mg/100g，此方法是以甘蔗皮中花色苷的含量來表示，而本發(fā)明中以甘蔗渣中花色苷的含量來計(jì)算得出，兩者的含量比較基礎(chǔ)不同，故結(jié)果有較大差異，而且該方法沒有考慮到實(shí)際應(yīng)用中分離甘蔗皮需要投入大量人力和物力，不但極大增加生產(chǎn)成本，而且難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，由此得到的花色苷含量不具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。復(fù)合酶法通過各種酶之間的協(xié)同作用，破壞甘蔗渣的組織結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)外花色苷盡可能多的釋放出來，酶的專一性確保了花色苷的天然狀態(tài)，大孔吸附樹脂和葡聚糖凝膠樹脂聯(lián)用除去了大量多酚黃酮等雜質(zhì)，極大地減弱了雜質(zhì)對(duì)花色苷物質(zhì)地降解作用。2).uplc-ms和ms/ms測(cè)定甘蔗花色苷成分使用超高液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)實(shí)施例所得花色苷純化物進(jìn)行分析。將所得產(chǎn)物a2溶于甲醇，分別配置成10μg/ml的溶液。過0.45μm的濾膜后，用uplc-ms/ms分析。色譜條件：進(jìn)樣體積5μl；流動(dòng)相a為色譜乙腈，流動(dòng)相b為0.1％tfa的超純水；梯度條件：0min，95％a；2.3min，80％a；3.4min，75％a；6.8min，60％；7.9min，95％a；9min，95％a。質(zhì)譜條件：離子源：esi，正離子模式下50m/z到1500m/z，毛細(xì)管電壓3500v，干燥氣體：n2，流速：4.0l/min，霧化器壓力:0.3bar，干燥器溫度:180℃。實(shí)施例1的測(cè)試結(jié)果如表2所示?，F(xiàn)有的提取純化方法得到的甘蔗花色苷種類只有2～5種。說明本發(fā)明中甘蔗皮花色苷的提取純化方法不僅提高了花色苷的產(chǎn)量，而且保證了花色苷的天然和穩(wěn)定性，主要原因?yàn)楸景l(fā)明復(fù)合酶法溫和且具有專一性，提取得到的甘蔗花色苷結(jié)構(gòu)得到了最大程度的保存，大孔吸附樹脂和葡聚糖凝膠樹脂的聯(lián)用可以去除大量的雜質(zhì)，避免了其它雜質(zhì)對(duì)花色苷的降解作用。表2所得甘蔗花色苷一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜分析結(jié)果注：a和b分別為花色苷一級(jí)質(zhì)譜(ms)的離子碎片和二級(jí)質(zhì)譜(ms/ms)的離子碎片。其ms總離子流圖和ms/ms總離子流圖分別如圖1和圖2所示。實(shí)施例1中得到10種花色苷：矢車菊素-3-o-葡萄糖苷(cyanidin3‐o‐glucoside)，矢車菊素‐3，5‐o‐二葡萄糖苷(cyanidin3，5‐di‐o‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐阿魏酰‐5‐o‐葡萄糖苷(cyanidin3‐o‐feruloylglucoside‐5‐o‐glucoside)，芍藥色素‐3‐o‐葡萄糖苷(peonidin3‐o‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐丙二酰‐萄糖苷(cyanidin‐3‐o‐(malonyl)‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐丁二酰‐萄糖苷(cyanidin‐3‐o‐(succinyl)‐glucoside)，矢車菊素‐3‐o‐咖啡酰葡萄糖苷‐5‐o‐丙二酰‐葡萄糖苷(cyanidin3‐o‐caffeoylglucoside‐5‐o‐malonylglucoside)，矢車菊素‐3‐(6‐乙酰)葡萄糖苷(cyanidin3‐(6”‐acetoyl)glucoside)，錦葵色素‐3‐o‐葡萄糖苷(malvidin3‐o‐glucoside)，矢車菊素‐7甲氧基‐3‐o‐(2‐沒食子酰)‐葡萄糖苷(7‐o‐methyl‐cyanidin‐3‐o‐(2”galloyl)‐galactoside)。3)甘蔗皮多酚dpph自由基清除力測(cè)定取上述實(shí)施例1中的純化物a2分別稀釋100倍、125倍、167倍、250倍及500倍，得到20、16、12、8.0、4.0mg(以蔗渣粉計(jì))/ml的樣品溶液。每組試驗(yàn)平行3次進(jìn)行，取各梯度樣品液2ml，分別加入0.2mm的dpph乙醇溶液2ml，充分混勻，在暗處?kù)o置30分鐘后離心15分鐘以分離沉淀物，轉(zhuǎn)速為4800r/min。然后，用無水乙醇和去離子水等體積混合調(diào)零，取樣品離心后的上清液測(cè)定其在517nm處的吸光度a樣品。其中，無水乙醇與dpph乙醇溶液等體積混合(2ml)在517nm處測(cè)得的吸光度為a0，而甘蔗渣提取物樣品液與無水乙醇液混勻測(cè)得的517nm處吸光值為a對(duì)照。甘蔗渣花色苷的dpph·自由基清除率/％＝[1-(a樣品-a對(duì)照)/a0]×100，同時(shí)計(jì)算ic50值。復(fù)合酶法提取得到的甘蔗花色苷對(duì)dpph·自由基的清除率達(dá)到了72.58％，和傳統(tǒng)水醇浸提方法相比提高了15.8％，可能是酶解較大程度地暴露了更多的h，·且方法比較溫和不會(huì)破壞這種電子結(jié)構(gòu)，所以其抗dpph·自由基能力更強(qiáng)。4)甘蔗皮多酚abts+清除力測(cè)定首先取適量的14mm的abts+原溶液與等體積的4.9mm的過硫酸鉀混勻，然后在常溫下暗處保藏15小時(shí)制成儲(chǔ)備液。然后在30℃室溫內(nèi)將儲(chǔ)備液用50％的乙醇溶液稀釋至其吸光度達(dá)到0.7±0.02(波長(zhǎng)為734nm)，以備用。每組實(shí)驗(yàn)平行3次進(jìn)行，取上述實(shí)施例1中的純化物a2用去離子水稀釋至25、20、15、10、5mg(以蔗渣粉計(jì))/ml，各取0.1ml。然后加入2.9ml的abts+溶液振蕩混合，室溫下靜置25分鐘。待反應(yīng)完成后測(cè)得的吸光度為ai(734nm)，其中，樣品利用去離子水取代，其他條件相同，在734nm處測(cè)得的吸光度是aj。將各吸光度代入公式可求出樣品的abts+清除百分率/％＝(aj-ai)/aj×100，同時(shí)算出ic50值。復(fù)合酶法得到的甘蔗花色苷對(duì)abts自由基的清除率達(dá)到了59.32％，和傳統(tǒng)水醇浸提方法相比提高了26.3％，可能是本發(fā)明提取出了更多具有帶電基團(tuán)的花色苷類物質(zhì)，從而使其抗abts基團(tuán)相關(guān)的活性明顯增強(qiáng)。5)甘蔗皮多酚orac自由基吸收能力測(cè)定取上述實(shí)施例1中的純化物a2稀釋成1mg(以蔗皮粉計(jì))/ml的溶液，各取20μl于96孔板中，每組以三組實(shí)驗(yàn)為平行，再分別加入7mm的fl熒光素溶液和磷酸鹽緩沖溶液(ph7.4)各20μl，37℃處?kù)o置15分鐘，然后在各微孔中迅速用多道移液器加入140μl的12mm的aaph自由基溶液，同時(shí)將該孔板至于37℃環(huán)境中的酶標(biāo)儀，然后在2小時(shí)內(nèi)連續(xù)測(cè)定每隔2分鐘各微孔的熒光強(qiáng)度，其中485nm為激發(fā)波長(zhǎng)，538nm為發(fā)射波長(zhǎng)，求出樣品的熒光曲線面積auc。另外一組不添加apph的fl熒光劑作為空白對(duì)照，為自然衰減面積auc空白，則樣品的熒光凈面積為auc-auc空白。同時(shí)，以trolox物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后由樣品的熒光凈面積和trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以求出甘蔗皮提取物的orac值(結(jié)果以μmtrolox/g蔗皮粉計(jì))復(fù)合酶法提取的甘蔗花色苷的orac值達(dá)到了909.50μmoltrolox/g，相比傳統(tǒng)水醇浸提方法提高了60％。可能是酶解方法溫和，花色苷中的h·得到最大程度的保存，所以其對(duì)該方法中產(chǎn)生的過氧化自由基roo·有很強(qiáng)的清除能力。從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明得到高含量的甘蔗花色苷，延長(zhǎng)了甘蔗的生產(chǎn)鏈，極大提高了甘蔗的附加價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)12