本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞領(lǐng)域，更具體地涉及一種制備結(jié)直腸癌抗原特異性t細(xì)胞的方法，以及由所述方法獲得的結(jié)直腸癌抗原特異性t細(xì)胞。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是全球第三大最常見癌癥，每年有100萬左右的新增病例和超過50萬人死于該病。結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)為主，并結(jié)合輔助放療、化療，雖然輔助放化療能在一定程度上延長患者的生存期，但也伴隨嚴(yán)重的副反應(yīng)，且即使經(jīng)過積極的聯(lián)合治療，該病依然存在很高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。目前迫切需要開發(fā)出能有效延長患者生存期，減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險的治療策略。

轉(zhuǎn)化生長因子βii型受體(tgfβrii)和o位n-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移酶(ogt)基因的框移突變產(chǎn)生一種具有人白細(xì)胞抗原a2(hla-a2)限制性的新生抗原，存在于20-40％hla-a2限制性結(jié)腸癌患者并且不存在于正常人和其他腫瘤中，提呈后的抗原肽為slykfspfpl和rlsscvpva。

越來越多的證據(jù)表明免疫系統(tǒng)可以預(yù)防腫瘤生長和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。包括細(xì)胞因子、腫瘤疫苗、免疫效應(yīng)細(xì)胞，以及基因改造t細(xì)胞受體、單克隆抗體等成為國內(nèi)外免疫治療研發(fā)的熱點。目前已開展多項結(jié)腸癌免疫治療臨床試驗研究，包括促進(jìn)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子、免疫檢查點阻斷、抗原疫苗和過繼性細(xì)胞治療等。盡管目前基因改造細(xì)胞成為免疫治療中翹楚，但由于制備工藝復(fù)雜，并存在脫靶效應(yīng)，使得其在治療實體瘤的臨床階段推進(jìn)受到阻礙。

以往針對細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷性細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞治療包括結(jié)腸癌在內(nèi)的實體瘤的研究認(rèn)為這些治療方法存在一定的療效，但由于缺乏抗原特異性文獻(xiàn)報道臨床治療效果參差不齊。

腫瘤細(xì)胞表面的抗原通過抗原提呈細(xì)胞(apc)加工成抗原肽與主要組織相容復(fù)合物(mhc)分子形成復(fù)合物提呈并參與活化給t細(xì)胞，形成腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)。腫瘤為了逃避識別，下調(diào)甚至不表達(dá)mhc分子，部分腫瘤患者免疫細(xì)胞數(shù)量下降功能低下都會造成腫瘤抗原無法提呈，導(dǎo)致t細(xì)胞無法活化。所以使用抗原呈遞細(xì)胞輔助形成殺傷性t細(xì)胞是常用的方法，但是這些方法不穩(wěn)定且不夠方便。

綜上所述，尚需要更加有效簡單的免疫療法和抗原特異性t細(xì)胞更加簡單和高效的制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)面臨的問題，本發(fā)明人開發(fā)了一種制備抗原特異性t細(xì)胞，特別是結(jié)直腸癌抗原特異性t細(xì)胞的方法，其解決或部分解決了以上問題。

本發(fā)明的一個方面涉及抗原特異性t細(xì)胞的制備方法，其包括使t細(xì)胞與腫瘤特異性抗原共孵育。

進(jìn)一步地，所述方法中的腫瘤特異性抗原可以為結(jié)直腸癌特異性抗原。

在一些實施方案中，所述結(jié)直腸癌特異性抗原為肽rlsscvpva。

在一些實施方案中，本發(fā)明方法中的t細(xì)胞在混懸液中，進(jìn)一步地，所述混懸液可以為外周血單核細(xì)胞混懸液或者外周血。

在一些實施方案中，本發(fā)明方法中的t細(xì)胞為cd8+t細(xì)胞。

本發(fā)明的一個方面涉及由本發(fā)明方法獲得的抗原特異性t細(xì)胞，特別是結(jié)直腸癌抗原特異性t細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法獲得的結(jié)直腸癌抗原特異性t細(xì)胞在制備用于治療結(jié)直腸癌的制劑中的用途。

本發(fā)明中使用的肽slykfspfpl(下文可簡稱為“抗原肽1”、“1號肽”或“p1”)和肽rlsscvpva(下文可簡稱為“抗原肽2”、“2號肽”或“p2”)可以是化學(xué)合成的或者經(jīng)生物工程技術(shù)產(chǎn)生的，其具有較高的，例如大于99％的純度，具有良好的均質(zhì)性。直接使用肽slykfspfpla，或者肽slykfspfpl和肽rlsscvpva的混合物處理pmbc獲得抗原特異性t細(xì)胞的方法，步驟大為簡化，可重復(fù)性好，具有良好的可操作性和實用價值。

附圖說明

圖1示出制備的肽的純度；圖1a抗原肽rlsscvpva合成質(zhì)譜分析的離子峰，在12.245’出現(xiàn)；圖1b抗原肽rlsscvpva合成質(zhì)譜分析的主要碎片峰僅有一個，該碎片分子量為931.76，豐度為100％，接近rlsscvpva的理論分子量。圖1c抗原肽slykfspfpl合成質(zhì)譜分析的兩個離子峰，分別出現(xiàn)在16.731’和21.317’。圖1dogt抗原肽slykfspfpl合成質(zhì)譜分析的主要碎片峰，有兩個，碎片的分子量(豐度)分別為1198.70(99％)和1220.81(1％)，第一個碎片的分子量接近slykfspfpl的理論分子量。

圖2示出了在不同效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例(簡稱“效靶比”)情況下，使用1號肽(p1)、2號肽(p2)、1號肽和2號肽的等比例混合物(p1+2)以及未添加抗原肽(np)的情況下，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(下文簡稱“ctl”)對dld1殺傷活力的影響。

圖3示出了效靶比為5/1(a)和10/1(b)時dc負(fù)載抗原誘導(dǎo)的ctl與抗原肽直接刺激活化ctl殺傷dld-1效能比較。

圖4示出了對效靶比為5/1(a)和10/1(b)兩組的ctl活化后ifn-γ分泌量的測定；每組對比中較前顏色的左側(cè)為負(fù)載抗原肽的dc刺激pbmc得到的ctl(dc+t)，右側(cè)為相應(yīng)抗原肽直接刺激pbmc得到的ctl(pbmc)。

具體實施方式

一、實驗材料

1、結(jié)腸癌細(xì)胞系dld1來自解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實驗室。

2、外周血樣來源

2.1患者組：

收集2014年11月至2015年8月就診于解放軍總醫(yī)院腫瘤中心的確診的結(jié)腸癌病人，診斷經(jīng)過經(jīng)組織或細(xì)胞病理學(xué)確認(rèn)，通過納入,排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，共計42例，其中有hlaa2限制性的患者34例，為最終納入的患者。組織病理學(xué)標(biāo)本由手術(shù)病理或腸鏡檢查獲得并經(jīng)病理科檢測確定。所有實驗經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人知曉并簽署知情同意書?；颊叩募{入和排除標(biāo)準(zhǔn)如下：

患者組納入標(biāo)準(zhǔn)：

①經(jīng)病理學(xué)確診的結(jié)腸癌患者，病理類型僅包括腺癌(高/中/低分化)；

②入院前未經(jīng)過細(xì)胞治療；

③表達(dá)hlaa2限制性分子

患者組排除標(biāo)準(zhǔn)：

①其他部位原發(fā)腫瘤的結(jié)腸部轉(zhuǎn)移或侵犯；

②距離上一次放療/化療結(jié)束1月內(nèi)的患者，既往接受過細(xì)胞治療患者；

③不表達(dá)hlaa2限制性分子

④伴有自身免疫性疾病和血液系統(tǒng)疾病患者；

⑤病理，隨訪資料不完善的患者；

⑥伴有其他傳染疾病患者。

結(jié)腸癌腺癌的診斷和病理類型確定根據(jù)2013年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(nccn)發(fā)布的結(jié)腸癌診療指南，患者臨床分期參考國際抗癌聯(lián)盟(uicc)和美國癌癥聯(lián)合委員會(ajcc)制定的tnm分級法。根據(jù)納入患者的入院記錄和相關(guān)檢查，記錄包括性別，年齡，病理類型，臨床分期，既往治療方案，并發(fā)癥，合并其他疾病，結(jié)腸癌相關(guān)遺傳疾病或家族史等信息。

2.2對照組：同期在解放軍總醫(yī)院體檢中心參加體檢的10例健康對照者和4例志愿者的外周靜脈血作為對照組。

入選標(biāo)準(zhǔn)為：

①與病人組年齡和性別構(gòu)成相近

②表達(dá)hlaa2限制性分子

排除標(biāo)準(zhǔn)為：

①1個月內(nèi)有急性或慢性炎癥

②由結(jié)腸癌或結(jié)腸疾病家族史

③不表達(dá)hlaa2限制性分子

④自身免疫性疾病，血液系統(tǒng)疾及其他傳染疾病患者

二、主要實驗試劑如下，所有其他實驗試劑為常規(guī)試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地購買得到

注：mts試劑盒是應(yīng)用新型的水溶性化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑(金翁)，內(nèi)鹽；mts]快速高靈敏度檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的比色檢測產(chǎn)品。

三、主要實驗儀器

四、肽rlsscvpva和slykfspfpl的合成、純化以及鑒定

4.1肽的合成

肽rlsscvpva和slykfspfpl交由北京中科亞光生物科技有限公司進(jìn)行商業(yè)合成。

4.2合成的肽

北京中科亞光生物科技有限公司提供了在xevog2-sqtof質(zhì)譜儀上獲得的檢測結(jié)果，具體參見附圖1。獲得了純度為100％的tgf-βrii抗原肽rlsscvpva和99.05％的ogt抗原肽slykfspfpl。

五、外周血采集

在實驗組對象入院時空腹情況下抽取外周血20毫升至抗凝管(肝素抗凝)中，采血管帽采血前后用碘伏消毒，保證無菌。采集之后兩小時內(nèi)處理血樣，以4℃，2500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘的條件離心。收集上層血漿吸取1ml保存至凍存管中，分裝之后置于-80℃冰箱，待檢測。以同樣的方法和步驟收集14例健康對照者，分裝1ml血漿保存至-80℃冰箱，剩余血漿吸入15ml無菌離心管，封口膠密封，置于56℃水浴30分鐘。水浴結(jié)束后血漿置23℃，2500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘的條件離心。離心后密封置于4℃保存留用。

六、外周血單核細(xì)胞(pbmc)的獲取與體外培養(yǎng)方法

(1)準(zhǔn)備：實驗開始前一天，將抗人cd3和抗人cd28以1:100加入到無菌1xpbs中混勻，以3ml稀釋液加入t25培養(yǎng)瓶中，液體均勻覆蓋瓶底，用封口膠密封錫箔紙包裹后放入4℃過夜。

(2)pbmc分離：

稀釋：將離心后去除血漿的血細(xì)胞用1xpbs稀釋，血細(xì)胞：pbs體積比＝1:2；分層：取兩支50ml離心管，分別加入15ml淋巴細(xì)胞分離液(下層)，傾斜緩慢加入約35ml稀釋血細(xì)胞(上層)；

離心：室溫條件，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘。

(3)洗滌：吸取分層液中間的白膜層加入到新的50ml離心管。吸取時注意，旋轉(zhuǎn)吸取，勿將下層紅細(xì)胞吸取。用2或3倍體積的1xpbs吹打混勻，離心2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。洗滌過程進(jìn)行兩次。如果紅細(xì)胞層表面有白色絮狀物或離心后發(fā)現(xiàn)分層不清可將分層不清的液體用pbs洗滌后再次用淋巴細(xì)胞分離液分離。由此獲得pbmc，隨后可進(jìn)行體外培養(yǎng)。

(4)計數(shù)接種：洗滌第二次后用培養(yǎng)基重懸，用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10⁶-1×10⁷/ml，將包被液吸出回收，把細(xì)胞懸液接種到包被好的培養(yǎng)瓶中。

(5)細(xì)胞因子：白細(xì)胞介素1(il-1α),重組白細(xì)胞介素-3(ril-3),重組干擾素(rifn-γ)按下表1中的濃度加入培養(yǎng)基中，并調(diào)整培養(yǎng)基總量為15ml，一并加入培養(yǎng)瓶中。

(6)第2天：觀察細(xì)胞情況，按500u/ml濃度加入重組白細(xì)胞介素-2(ril-2)，并將培養(yǎng)基總體積加至10ml。此后每隔1-2天擴(kuò)大容積一次并根據(jù)細(xì)胞克隆團(tuán)生長情況加入ril-2。根據(jù)細(xì)胞生長情況，加入自體血清平均濃度為5％(2.5％-10％)。

表1.細(xì)胞因子濃度及其添加時間

(7)第4天：體系加至20ml，并維持5％自體血清和300u/mlril-2濃度。

(8)第7天：觀察細(xì)胞生長情況，將細(xì)胞輕柔吹打，擴(kuò)至t75培養(yǎng)瓶，總體系達(dá)40ml，維持5％自體血清和300u/mlril-2濃度。此后根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)充液體量。如果細(xì)胞量足夠，在培養(yǎng)到第11天或12天時取出1×10⁷細(xì)胞。緩慢地混合均勻，制成細(xì)胞混合液。細(xì)胞在4℃，1800轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收上清繼續(xù)作為培養(yǎng)基，細(xì)胞用cellbankerii按5×10⁵至5×10⁶細(xì)胞/ml凍存液緩慢混勻凍存至超低溫冰箱或液氮備用。

(9)自第11天起，將ril-2濃度調(diào)整為100u/ml，參考既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)較低濃度的il-2可以獲得較高比例的cd8⁺t細(xì)胞。

(10)收集細(xì)胞：第14天：收集細(xì)胞到無菌50ml離心管中，按1800轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去上清，細(xì)胞計數(shù)。

(11)將收集的細(xì)胞用biolegend公司流式抗體pe抗人cd3，fitc抗人cd4，pe-cy7抗人cd8，fitc抗人cd56，pe抗人cd19對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。細(xì)胞用1xpbs混勻，取3×10⁶細(xì)胞均分至3個流式管，每管體積500ul；按下表順序加入抗體，抗體加入流式管底部，震蕩后室溫避光20分鐘；再次震蕩，隨后進(jìn)行流式檢測。

流式檢測的結(jié)果顯示，從0至14天發(fā)生了如下變化，培養(yǎng)過程中cd19⁺b細(xì)胞消失，cd8⁺t細(xì)胞在兩組中都明顯上升，患者組為培養(yǎng)前35.7％，培養(yǎng)后74％；健康對照組為培養(yǎng)前26.4％，培養(yǎng)后78.2％，兩組在培養(yǎng)后cd8⁺t比例無明顯差異(p>0.05)。cd3⁺cd56⁺表型在健康組表達(dá)為59.2％，在患者組為44.7％，兩組間有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。

實施例一：制備抗原肽特異性的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞

1、按照前述方法獲得34例結(jié)腸腺癌患者和14例健康對照的pbmc；并進(jìn)行體外培養(yǎng)，在第7天將培養(yǎng)的細(xì)胞輕柔吹打，計數(shù)調(diào)整數(shù)量為5×10⁶細(xì)胞/孔加入到96孔板，每個樣本設(shè)三個復(fù)孔。

2、將1號肽和2號肽分別按50ug/ml一次性加入，刺激細(xì)胞至14天，收集細(xì)胞。

3、ctl殺傷效能

3.1腫瘤細(xì)胞鋪板：在細(xì)胞培養(yǎng)的13天對使用rpmi-1640/dmem等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的dld-1，用pbs洗滌兩遍，用胰酶消化，含血清培養(yǎng)基終止消化后以900轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，含10％胎牛血清的rpmi-1640/dmem等體積混合培養(yǎng)基重懸計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×10³/100ul，鋪96孔板，每孔100ul，每種細(xì)胞15個孔(分四個實驗組和一個空白對照組，每組3個復(fù)孔)，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6-12小時。

3.2ctl殺傷：將多肽組和對照組ctl分別按1×10³/100ul、5×10³/100ul濃度加入腫瘤細(xì)胞的四個組每孔100ul，效靶比分別為1/1，5/1。分別以3天后，7天后進(jìn)行mts測定，評估各處理組ctl對腫瘤細(xì)胞的殺傷情況。

3.3mts：第3天和第7天將96孔板所有孔中的培養(yǎng)基吸出，按組別分裝至1.5mlep管標(biāo)記，凍存入-30℃冰箱備測細(xì)胞因子分泌情況。根據(jù)promega說明書，按rpmi-1640/dmem等體積混合培養(yǎng)基:mts＝100ul:20ul/孔，將所有孔中加入mts稀釋液，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中孵育2-3小時，取出后冰上避光，用酶標(biāo)儀測492nm波長時的吸光度(od)值，空白對照組僅有培養(yǎng)基無細(xì)胞(blank，所有組別樹脂減去blank的平均值是腫瘤細(xì)胞相對吸光度值，即腫瘤細(xì)胞相對活力)，陽性對照組僅有腫瘤細(xì)胞。

3.4ifn-γ分泌量測定：

1)試劑盒與待測樣品升溫30分鐘至18-25℃；

2)工作液和標(biāo)準(zhǔn)品的配制依照說明書進(jìn)行需配制以下液體：(a.濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋，稀釋比例為1:25；b.標(biāo)準(zhǔn)品400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml及12.5pg/ml；c.生物素化抗體工作液；d.酶結(jié)合物工作液)；

3)加樣：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別添加標(biāo)準(zhǔn)品或100μl/孔樣品進(jìn)行測量，加樣應(yīng)施于酶標(biāo)板底部，不觸及孔壁，不產(chǎn)生氣泡并輕柔吹打均勻。酶標(biāo)板膜包覆，37℃孵育90分鐘；

4)棄液體，在濾紙上反復(fù)扣干，不洗滌。加入生物素標(biāo)記抗體工作液100μl/孔(在使用前15分在制備薄膜覆蓋)，在酶標(biāo)板上加上覆膜，37℃培養(yǎng)1小時；

5)棄去孔內(nèi)液體，干燥，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，約350μl/孔，干燥、吸水紙點擊孔液體拍干；

6)加酶結(jié)合物工作液(臨用前15分鐘配制)100μl/孔，加上覆膜，37℃孵育30分鐘；

7)棄去孔內(nèi)液體，干燥，洗5次，方法同步驟5)；

8)每個孔加底物溶液(tmb)90μl，酶標(biāo)板加覆膜，37℃孵育15分鐘；

9)加終止液50μl/孔，反應(yīng)終止，藍(lán)色到黃色的顏色變化。終止液加入順序應(yīng)與底物相同的添加順序。

10)立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的od值；

11)計算結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)的ifn-γ濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的縱坐標(biāo)的od值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查樣品濃度。

實驗結(jié)果參見圖2，殺傷的第3天，效靶比為1/1時，四個處理條件的患者和對照ctl對dld-1殺傷未見顯著差異，患者組內(nèi)和健康對照組內(nèi)四個處理間亦無統(tǒng)計差異：p1，p2，p1+2，np處理條件患者組殺傷的平均od值±標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.834±0.377，1.924±0.663，1.629±0.267，1.95±0.769；健康對照組殺傷平均od值±標(biāo)準(zhǔn)差為1.625±0.584，1.522±0.238，1.546±0.301，1.702±0.559(p>0.05)，紅色虛線示無ctl存在，僅有dld-1的陽性對照，od值為2.328，見圖2a。5/1效靶比時(圖2b)，p2，p1+2處理條件下患者組和健康組都出現(xiàn)了殺傷效果的明顯差異；其中5/1靶比下的p2處理條件患者組殺傷的od值分別為1.198±1.134；健康對照組殺傷od值為0.784±0.663。在5/1效靶比下的p1+2處理的患者組od值為0.759±1.526；健康對照的od值為：0.456±0.773。在np處理條件下僅10/1效靶比顯示患者組的ctl殺傷能力優(yōu)于健康對照(p<0.05)，od值為患者組：0.465±0.443健康組：0.539±0.092。說明肽slykfspfpla，或者肽slykfspfpl和肽rlsscvpva的等比例混合物的添加可以有效的提高ctl的比例，繼而有效的抑制dld1的活力。

實施例二：樹突狀細(xì)胞(dc)負(fù)載的抗原肽和抗原肽單獨對ctl產(chǎn)生的影響的比較。

樹突狀細(xì)胞是提呈能力最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，使dc負(fù)載抗原肽得到dc疫苗，一般而言，dc疫苗對于單獨抗原肽產(chǎn)生ctl的效率將更高。然而本發(fā)明人通過以下實驗的結(jié)果，出人意料發(fā)現(xiàn)單獨施加抗原肽獲得了比負(fù)載抗原肽的dc疫苗更好的效果。

1、獲得負(fù)載抗原肽的dc

(1)將外周血樣與1xpbs按1:1體積稀釋后緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中，室溫條件下，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；吸取分層液中間的白膜層加入到新的50ml離心管。用2或3倍體積的1xpbs吹打混勻，離心2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。洗滌過程進(jìn)行兩次，得到pbmc。；

(2)將pbmc置于6孔板(6×10⁶-8×10⁶細(xì)胞/孔)(5×10⁷細(xì)胞/6孔板)，37℃培養(yǎng)1-3小時，輕輕吸取非貼壁細(xì)胞。

(3)貼壁細(xì)胞在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，添加800u/ml的gm-csf和500u/ml的ril-4，第3天半量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子至原濃度，第5天所得的非貼壁細(xì)胞即誘導(dǎo)分化而來的未成熟dc。

(4)為了獲得成熟dc，第5天向未成熟dc中加入100ng/ml的lps刺激48小時。

(5)第6天加入1號肽和2號肽，分別按10ug/ml，20ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml一次性加入，刺激細(xì)胞到第8天，獲得負(fù)載抗原肽的dc。

(6)第8天，收集細(xì)胞進(jìn)行流式分析檢測細(xì)胞表型，5管單染配同型對照：fitc抗人cd80、pe抗人cd86、pe抗人cd83、fitc抗人cd11c、pe抗人hla-dr。

(7)第8天，負(fù)載抗原體的dc分三組(p1，p2，p1+2)刺激自體pbmc，第四組為不負(fù)載抗原的dc與pbmc共培養(yǎng),培養(yǎng)基更換為lonzax-vivo15，加入5％的自體血清和300u/mlil-2。同時根據(jù)實施例1對相應(yīng)的志愿者pbmc進(jìn)行抗原肽(p1，p2，p1+2)和pbs(陰性對照)的直接刺激。培養(yǎng)到第14天收集所有細(xì)胞。

2、ctl殺傷效能

(1)腫瘤細(xì)胞鋪板：在步驟1中的細(xì)胞培養(yǎng)的第13天對使用rpmi-1640/dmem等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的dld-1，用pbs洗滌兩遍，用胰酶消化，含血清培養(yǎng)基終止消化后以900轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，含10％胎牛血清的rpmi-1640/dmem等體積混合培養(yǎng)基重懸計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×10³/100ul，鋪96孔板，每孔100ul，每種細(xì)胞15個孔(分四個實驗組和一個空白對照組，每組3個復(fù)孔)，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中貼壁6-12小時。

(2)ctl殺傷：在第14天，將p1，p2，p1+2，np四組健康人的ctl和dc負(fù)載抗原刺激的健康人t細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞來源的個體一一對應(yīng)，分別按1×10³/100ul、5×10³/100ul、1×10⁴/100ul、2×10⁴/100ul濃度加入腫瘤細(xì)胞的四個組每孔100ul，效靶比分別為1/1，5/1，10/1，20/1。分別在3天后，7天后進(jìn)行mts測定，評估各處理組ctl對腫瘤細(xì)胞的殺傷情況。

(3)mts殺傷實驗與ifn-γ分泌情況：第3天和第7天將96孔板所有孔中的培養(yǎng)基吸出，按組別分裝進(jìn)1.5mlep管并標(biāo)記，凍存入-30℃冰箱備測細(xì)胞因子分泌情況。根據(jù)promega說明書，按rpmi-1640/dmem等體積混合培養(yǎng)基:mts＝100ul:20ul/孔，將所有孔中加入mts稀釋液，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中孵育2-3小時，取出后冰上避光，用酶標(biāo)儀測492nm波長時的吸光度(od)值，空白對照組僅有培養(yǎng)基無細(xì)胞(blank(空白)，所有組別樹脂減去blank的平均值是腫瘤細(xì)胞相對吸光度值，即腫瘤細(xì)胞相對活力)，陽性對照組僅有腫瘤細(xì)胞。ifn-γ分泌量使用elisa方法測定。

實驗結(jié)果參見圖3，效靶比為5/1(a)和10/1(b)時dc負(fù)載抗原誘導(dǎo)的ctl與抗原直接刺激活化ctl殺傷dld-1效能比較。p1dc+t、p2dc+t、p1+2dc+t、p0dc+t分別代表dld-1與分別由負(fù)載抗原肽1、抗原肽2、抗原肽1+2和未負(fù)載抗原肽的dc刺激pbmc得到的ctl共孵育。pbmc+p1、pbmc+p2、pbmc+p12、t細(xì)胞分別表示dld-1與分別由抗原肽1、2、1+2直接刺激的pbmc得到的ctl和無抗原肽刺激pbmc得到的ctl。

dc負(fù)載抗原誘導(dǎo)的ctl與抗原直接刺激活化ctl對dld-1殺傷效果殺傷活性公式為:

blankod值為0.0403，dld-1的od值是3.523，在效靶比為5/1時，負(fù)載抗原肽1的dc與抗原肽1直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為26.7％和65.8％(p＝0.054)，負(fù)載抗原肽2的dc與抗原肽2直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為20.7％和81.3％(p＝0.039)，負(fù)載抗原肽1+2的dc與抗原肽1+2直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為39.9％和69.2％(p＝0.048)。在效靶比為10/1時，負(fù)載抗原肽1的dc與抗原肽1直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為36.3％和88.8％(p＝0.0384)，負(fù)載抗原肽2的dc與抗原肽2直接刺激的pbmc得到ctl對dld-1的殺傷率分別為37.5％和89.7％(p＝0.0224)，負(fù)載抗原肽1+2的dc與抗原肽1+2直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為45.6％和86.6％(p＝0.043)。

對效靶比為5/1，10/1時兩組的ctl活化做ifn-γ分泌量的測定，如圖4，兩處理條件下都顯示在接受p2或p1和p2的混合物(p1+2)刺激時健康人的pbmc活化的ctl更有優(yōu)勢。

根據(jù)實施例2的實驗結(jié)果可以看出，使用抗原肽直接刺激pbmc特別是接受兩個抗原肽刺激的情況下，在細(xì)胞因子存在的同時，獲得的ctl對dld-1的殺傷能力比使用dc負(fù)載抗原后刺激活化同一志愿者pbmc來源的ctl的殺傷能力強(qiáng)。使用抗原肽直接刺激pbmc模擬了體內(nèi)外周血成分接受抗原肽刺激的情形，在活化dc之外，抗原肽同樣活化了其他免疫應(yīng)答的環(huán)節(jié)，不同于全腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞碎片激活t細(xì)胞，腫瘤新生抗原肽優(yōu)化了識別過程，使得僅擁有特異性抗原tcr的t細(xì)胞擴(kuò)增活化，能夠更加精準(zhǔn)靶向腫瘤細(xì)胞，因此使用直接使用抗原刺激外周血也可以實現(xiàn)相同的效果。

序列表

<110>上海市東方醫(yī)院

<120>一種制備結(jié)直腸癌抗原特異性t細(xì)胞的方法

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1號肽，即轉(zhuǎn)化生長因子βii型受體框移突變產(chǎn)生的新抗原肽

<400>1

serleutyrlyspheserpropheproleu

1510

<210>2

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>2號肽，即o位n-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移酶框移突變產(chǎn)生的新抗原肽

<400>2

argleusersercysvalprovalala

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