本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序的通用型檢測(cè)方法，是基于二代測(cè)序技術(shù)的通用型物種特異性DNA分析技術(shù)，包括通用型引物對(duì)、數(shù)據(jù)庫(kù)、分析方法、試劑盒與實(shí)際應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：動(dòng)物源性制品的摻假是關(guān)系到人類食品安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)重要問題。事實(shí)上，飼料和食品安全問題不僅涉及人類的健康，而且涉及相關(guān)企業(yè)的生存、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、社會(huì)的穩(wěn)定、甚至是民眾對(duì)政府的信心等問題。一方面由于不同物種來(lái)源的動(dòng)物組織、皮革、血液等本身具有相似的物理形態(tài)以及工業(yè)化處理加工技術(shù)的影響，普通消費(fèi)者自己很難準(zhǔn)確判定物種來(lái)源特別是眾多混合動(dòng)物源性制品各組成部分的真實(shí)性。未知來(lái)源的動(dòng)物源性成分存在巨大的經(jīng)濟(jì)和安全漏洞，這是關(guān)系到人類食品安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)重要問題。事實(shí)上，動(dòng)物源性制品安全問題不僅涉及人類的健康，而且涉及相關(guān)企業(yè)的生存、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、社會(huì)的穩(wěn)定、甚至是民眾對(duì)政府的信心等多方面問題。另一方面國(guó)內(nèi)外目前使用的所有檢測(cè)技術(shù)均不具備對(duì)未知來(lái)源的動(dòng)物源性成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的能力。因此建立全新的通用型檢測(cè)方法來(lái)對(duì)食品和飼料中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒定的研究顯得十分必要和重要。目前在食品安全檢測(cè)技術(shù)方面，基于DNA序列的檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerasechainreaction，PCR)和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(Real-timefluorescencepolymerasechainreaction，qPCR)相比于其他方法具有較高的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，是目前最重要的檢測(cè)技術(shù)，在食品飼料中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、動(dòng)物源性成分檢測(cè)、病原微生物檢測(cè)、過(guò)敏源檢測(cè)、真假鑒別等方面均具有非常成功和廣泛的應(yīng)用。但這些基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法均具有一個(gè)嚴(yán)重的技術(shù)瓶頸，只能針對(duì)某一物種設(shè)計(jì)具有針對(duì)性的引物，然后針對(duì)其進(jìn)行有目的的檢測(cè)，如果待測(cè)樣品是混合樣品并具有完全未知的物種，則這些方法均無(wú)法完成檢測(cè)。這一技術(shù)瓶頸一直困擾著相關(guān)領(lǐng)域檢測(cè)工作人員。因此，有必要建立一種特異性好、且在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)混合樣品中各已知或未知?jiǎng)游镌葱猿煞诌M(jìn)行準(zhǔn)確定性檢測(cè)的檢測(cè)方法。DNA條形碼技術(shù)是使用一段兩端相對(duì)保守、中間具有足夠區(qū)分度的，易于擴(kuò)增的較短的DNA片段，并利用其具有種間特異性和種內(nèi)保守性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速鑒定。第二代測(cè)序技術(shù)(Next-generationsequencing)利用接頭技術(shù)進(jìn)行高通量并行PCR以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模平行測(cè)序，同時(shí)結(jié)合微流體技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析，而且DNA被測(cè)次數(shù)還可以間接反映某種DNA的相對(duì)豐度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有生物監(jiān)測(cè)技術(shù)無(wú)法全面甄別不確定動(dòng)物源性成分的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序的通用型檢測(cè)方法，是基于高通量測(cè)序技術(shù)和DNA條形碼分析技術(shù)的通用型動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法，包括通用型引物對(duì)、數(shù)據(jù)庫(kù)、分析方法、試劑盒與實(shí)際應(yīng)用策略。該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合生物制品中不可預(yù)測(cè)或未知物種進(jìn)行準(zhǔn)確篩選和鑒定，實(shí)現(xiàn)真正意義上的全覆蓋、無(wú)縫生物監(jiān)測(cè)，從源頭杜絕動(dòng)物源性制品摻雜使假等行為，也為檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序的通用型檢測(cè)方法，該通用型檢測(cè)方法包括以下步驟：步驟一、以待測(cè)樣品的DNA為模板，利用通用型引物對(duì)進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增片段約為400bp；步驟二、擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)；步驟三、利用二代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序；步驟四、數(shù)據(jù)分析比對(duì)確認(rèn)物種，其中，所述通用型引物對(duì)的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。根據(jù)本發(fā)明，步驟一的PCR擴(kuò)增的條件如下：PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50μL，包括2XTaqMastermix25μL，正向引物、反向引物各10μM，DNA模板5μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃變性5min；進(jìn)入循環(huán)，96℃變性20s，55℃退火30s和72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；延伸2min。根據(jù)本發(fā)明，所述通用型檢測(cè)方法還包括參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。進(jìn)一步的，所述步驟三是利用IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)一步的，所述步驟三是采用IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種生物制品中動(dòng)物源性成分的通用型引物對(duì)，所述通用型引物對(duì)的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種上述所述的生物制品中動(dòng)物源性成分的通用型引物對(duì)用于高通量二代測(cè)序。本發(fā)明的有益效果是：1、提供了一種針對(duì)復(fù)雜動(dòng)物源性成分進(jìn)行快速鑒定的技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)造性結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)和物種特異性線粒體DNAbarcode技術(shù)，針對(duì)食品、化妝品和飼料中混合未知?jiǎng)游镌葱猿煞诌M(jìn)行快速鑒定。2、與所有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，不再需要使用特異性的引物有針對(duì)性的對(duì)某單一物種進(jìn)行一對(duì)一檢測(cè)，而是通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)將待測(cè)樣本中的各種動(dòng)物源性成分進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分鑒定，節(jié)省大量人力物力。3、這一技術(shù)可以解決生物制品中大量不可預(yù)見動(dòng)物源性成分難以同時(shí)鑒定的技術(shù)難題，從源頭杜絕動(dòng)物源性制品制假摻假等行為，從根本上堵住安全漏洞。4、該通用型檢測(cè)技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的科技應(yīng)用價(jià)值：如食品安全領(lǐng)域，可以應(yīng)用于肉類食品質(zhì)量監(jiān)督，為執(zhí)法部門提供技術(shù)依據(jù)；在疾病控制領(lǐng)域，可以嚴(yán)防動(dòng)物性疫病疫區(qū)的動(dòng)物源性制品攜帶病毒傳入我國(guó)，為我國(guó)畜牧業(yè)安全保駕護(hù)航；在國(guó)際貿(mào)易領(lǐng)域，可以為進(jìn)出口企業(yè)消除貿(mào)易技術(shù)壁壘、為出入境檢驗(yàn)檢疫部門提供技術(shù)保障，為國(guó)際貿(mào)易糾紛仲裁提供技術(shù)支持；還可以為其它相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域如物種分類學(xué)、比較遺傳學(xué)、動(dòng)物生態(tài)學(xué)提供一個(gè)新穎的研究方向和可靠的研究手段。5、該方法自動(dòng)化程度高，人為操作影響弱，操作簡(jiǎn)便，對(duì)人員要求低，適用范圍廣。附圖說(shuō)明圖1為生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為實(shí)施例2的待測(cè)樣品等比例混合的物種分布和豐度的示意圖。圖3為實(shí)施例3的待測(cè)樣品等比例混合的物種分布和豐度的另一示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例的待測(cè)樣品的線粒體基因組購(gòu)自于ZyagenLaborateorie(SanDiego,CA,USA)，具體如表1所示。表113種待測(cè)樣品的來(lái)源和序列情況以下實(shí)施例的參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)的序列來(lái)源于在線NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，如表2所示。其中表2僅列出參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)的部分動(dòng)物線粒體DNA的序列來(lái)源。表2參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)施例1通用型動(dòng)物源性成分特異性擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)本申請(qǐng)人通過(guò)設(shè)計(jì)多組引物，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的通用型動(dòng)物源性成分特異性擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序的通用型檢測(cè)的效果最好。(1)本發(fā)明的通用型動(dòng)物源性成分特異性擴(kuò)增引物的序列如下：NGS-382-FTAAGACGAGAAGACCCTRTGGA(SEQIDNO：1)NGS-382bp-RCGGTCTGAACTCAGATCACGTA(SEQIDNO：2)(2)PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見表3和表4表3PCR反應(yīng)體系成分體積(μl)2XTaqMastermix25正向引物(10μM)1方向引物(10μM)1DNA模板(20ng/μl)1ddH2O22總體積50表4PCR反應(yīng)條件實(shí)施例2生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序，具體操作如圖1所示。(1)將實(shí)施例1的13種動(dòng)物樣品的特異性DNA等比例混合(如表5所示，每種動(dòng)物樣品以7.69％的標(biāo)準(zhǔn)比例混合)；(2)利用實(shí)施例1的通用型引物對(duì)和PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建PCR產(chǎn)物文庫(kù)；(3)利用IlluminaMiseq2*300PE模式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。IlluminaMiseq的2*300PE模式擁有高通量、高質(zhì)量等特點(diǎn)，通過(guò)連接Pair-end兩端reads，可以獲得長(zhǎng)約500bp的高質(zhì)量測(cè)序序列，總分涵蓋了382bp的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度；(4)對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析首先，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量的測(cè)序序列(包括去除reads中的接頭序列、修剪測(cè)序質(zhì)量值小于Q20的reads末端、切除兩端引物序列、去除嵌合體序列)，再利用BLAST將過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)與表2建立的參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將滿足閾值的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以顯示待測(cè)樣品中的物種分布和豐度。結(jié)果見表5和圖2。其中，表5的實(shí)際比例為高通量二代測(cè)序的結(jié)果。表5等比例混合的動(dòng)物樣品中的物種分布和豐度試驗(yàn)編號(hào)動(dòng)物樣品計(jì)數(shù)實(shí)際比例標(biāo)準(zhǔn)比例A6山羊1661617.58％7.69％A13火雞1452215.36％7.69％A12綿羊1243413.15％7.69％A11鵪鶉87669.27％7.69％A9鵝79758.44％7.69％A1鴨53745.68％7.69％A2雞43274.58％7.69％A3牛42574.50％7.69％A8貓42084.45％7.69％A10驢41514.39％7.69％A5豬41384.38％7.69％A7馬40914.33％7.69％A4駱駝36763.89％7.69％從表5和圖2可以看出，13種添加的動(dòng)物樣品均可以在一次測(cè)序比對(duì)中被準(zhǔn)確的認(rèn)定。結(jié)論：采用實(shí)施例1的通用型引物對(duì)和實(shí)施例2的高通二代測(cè)序方法可以同時(shí)對(duì)多個(gè)物種進(jìn)行定性檢測(cè)。實(shí)施例3驗(yàn)證高通量二代測(cè)序的通用型方法的適用性為了驗(yàn)證通量二代測(cè)序的通用型方法的的適用性(即是否適用于其他二代測(cè)序平臺(tái))，申請(qǐng)人以同樣的樣品和分析比對(duì)方法在賽默飛公司的IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行的驗(yàn)證。具體如下：(1)待測(cè)樣品制備方法與實(shí)施例2的方法一樣采用與實(shí)施例2相同的樣品，等比例混合(如表6所示，每種動(dòng)物樣品以7.69％的標(biāo)準(zhǔn)比例混合)；(2)測(cè)序文庫(kù)的制備按照IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)的通用方法制備。(3)測(cè)序方法按照IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)要求進(jìn)行。(4)對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析首先，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量的測(cè)序序列(包括去除reads中的接頭序列、修剪測(cè)序質(zhì)量值小于Q20的reads末端、切除兩端引物序列、去除嵌合體序列)，再利用BLAST將過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)與表2建立的參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將滿足閾值的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以顯示待測(cè)樣品中的物種分布和豐度。結(jié)果見表6和圖3。其中，表6的實(shí)際比例為高通量二代測(cè)序的結(jié)果。表6不同比例混合的動(dòng)物樣品中的物種分布和豐度試驗(yàn)編號(hào)動(dòng)物樣品計(jì)數(shù)實(shí)際比例標(biāo)準(zhǔn)比例A6山羊943212.55％7.69％A3牛912512.14％7.69％A12綿羊1638221.80％7.69％A13火雞2240.30％7.69％A2雞6770.90％7.69％A5豬916412.19％7.69％A9鵝28843.84％7.69％A1鴨13871.85％7.69％A8貓65638.73％7.69％A10驢47206.28％7.69％A4駱駝34914.64％7.69％A7馬65868.76％7.69％A11鵪鶉45256.02％7.69％從表6和圖3可以看出，即使更換完全不同的二代測(cè)序平臺(tái)，不同比例混合的動(dòng)物樣品還是可以在一次測(cè)序比對(duì)中被準(zhǔn)確的認(rèn)定。說(shuō)明該方法具有較好的跨二代測(cè)序平臺(tái)適用性。結(jié)論：采用IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序方法也可以同時(shí)對(duì)多個(gè)物種進(jìn)行定性檢測(cè)。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)的通用型引物對(duì)，為快速鑒定生物制品中動(dòng)物源性成分提供了一種很好的定性檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法創(chuàng)造性的結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)和物種特異性線粒體DNAbarcode技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)較長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)和較大的測(cè)序通量，再結(jié)合特異性片段中間400bp左右的高區(qū)分度區(qū)間可以精確鑒定物種。另外，該檢測(cè)方法對(duì)具有高度一致性卻不能匹配參考線粒體數(shù)據(jù)庫(kù)的reads與在線NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中45596條動(dòng)物線粒體序列建立的線粒體參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行再次比對(duì)，比對(duì)結(jié)果分析確認(rèn)物種后可以補(bǔ)充至本地庫(kù)中。這一良性循環(huán)的方式既可以完成對(duì)不可預(yù)知物種的準(zhǔn)確識(shí)別還可以進(jìn)一步擴(kuò)充本地物種特異性序列庫(kù)的內(nèi)容，為之后的比對(duì)提供更多參考數(shù)據(jù)。本檢測(cè)系統(tǒng)具有自我完善更新能力，隨著使用次數(shù)的增加，在對(duì)完全陌生的物種進(jìn)行鑒定后，新數(shù)據(jù)補(bǔ)充至對(duì)比庫(kù)，不斷完善比對(duì)庫(kù)，當(dāng)再次遇見該物種時(shí)就可以快速識(shí)別。此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的通用型引物對(duì)適合多種二代測(cè)序平臺(tái)，適用范圍廣。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。SEQUENCELISTING<110>上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>生物制品中動(dòng)物源性成分的高通量二代測(cè)序的通用型檢測(cè)方法<130>171005<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1taagacgagaagaccctrtgga22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cggtctgaactcagatcacgta22當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3