本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域中SNP分型檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)檢測(cè)rs6046310來(lái)特異性檢測(cè)肥胖癥的試劑盒。
背景技術(shù)：
肥胖是一種慢性代謝性疾病，其特征是體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存量增加。它是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題，能夠顯著增加2型糖尿病、高血壓、心血管病以及腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。它已成為全球殘疾和死亡的主要原因之一。在美國(guó)超過(guò)2/3的成年人是超重的，超過(guò)1/3的成年人是肥胖的。與肥胖相關(guān)的年度經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)了2000億美元。
肥胖是當(dāng)前威脅人類健康的一大殺手，英國(guó)國(guó)家醫(yī)療服務(wù)系統(tǒng)(NHS)行政長(zhǎng)官指出：成功減掉5％到7％的體重可以降低60％的患上糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。為讓本國(guó)國(guó)民肥胖癥狀減輕，NHS負(fù)責(zé)人將運(yùn)用各種手段途徑，像全球定位系統(tǒng)一般搜羅全英所有肥胖癥患者，重點(diǎn)搜索40歲以下的超重人群，并要求他們加入“抗糖尿病”計(jì)劃。同時(shí)，作為歐洲第二肥胖大國(guó)，英國(guó)將在新的一年發(fā)動(dòng)全國(guó)性的抗擊肥胖運(yùn)動(dòng)，以避免這場(chǎng)致命的災(zāi)難。
據(jù)英國(guó)《每日郵報(bào)》報(bào)道，經(jīng)合組織(OECD)基于相關(guān)數(shù)據(jù)分析得出，歐洲30個(gè)國(guó)家人口肥胖問(wèn)題不斷惡化，平均16.7％的成年人患有肥胖病。其中挪威、瑞士、意大利等國(guó)家肥胖人口低于平均水平，但是匈牙利高達(dá)28.5％，排名第一。英國(guó)緊隨其后。
與往年數(shù)據(jù)相比，這一研究結(jié)果超乎人們的想像，英國(guó)上升23％，歐洲整體肥胖人口也呈上升趨勢(shì)。官方數(shù)據(jù)證明，如果此項(xiàng)指標(biāo)能夠下降到1993年的15％，20年內(nèi)將可能不會(huì)出現(xiàn)五百萬(wàn)例與肥胖相關(guān)的疾病患者。不良飲食習(xí)慣是導(dǎo)致肥胖的主要因素。與其他國(guó)家相比，歐洲人更加偏愛(ài)于紅肉以及其他高脂肪、高熱量的快餐。特別是在感恩節(jié)、圣誕節(jié)期間，火雞、布丁、蛋糕等讓人們無(wú)法抵制它們的誘惑。
過(guò)去有關(guān)候選基因的大量研究已經(jīng)表明，大多數(shù)基因與人類脂肪組織中肥胖的發(fā)生相關(guān)。與人體身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)相關(guān)的40％以上的基因變異可以產(chǎn)生性狀差異。隨著分子遺傳學(xué)的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)肥胖是多基因遺傳病，許多國(guó)家都在開展肥胖候選基因研究。至今為止至少已通過(guò)分子遺傳學(xué)手段檢出了250個(gè)人類基因或染色體區(qū)域并被報(bào)道與肥胖癥相關(guān)。此外，遺傳學(xué)和分子流行病學(xué)的證據(jù)均表明遺傳因子涉及決定在特定飲食或用藥情況下增加或損失脂肪的易感性，以及在肥胖者中發(fā)生其它相關(guān)疾病的高危險(xiǎn)性。目前候選基因已經(jīng)很多，但是絕大部分都在檢測(cè)準(zhǔn)確性上有待于進(jìn)一步的提高。
盡管身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)通常用來(lái)衡量肥胖，它并不是一個(gè)理想的指標(biāo)。這是因?yàn)樯眢w質(zhì)量由多種組分組成，包括脂肪、肌肉、骨以及其它軟組織。其中，只有脂肪才是肥胖癥關(guān)心的指標(biāo)。脂肪很少用來(lái)衡量肥胖的原因在于其在活體內(nèi)難以精確測(cè)量。目前，公認(rèn)的體內(nèi)測(cè)量方法是測(cè)量骨密度用的的雙能X射線儀(DXA)。
而至于檢測(cè)方法，目前常規(guī)用于肥胖癥基因變異的主要檢測(cè)方法是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)，其原理是當(dāng)變異影響到某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)時(shí)，簡(jiǎn)單地通過(guò)酶切處理患者的PCR產(chǎn)物繼而電泳檢測(cè)是否有變異的方法。但是這種方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，準(zhǔn)確度不高等缺點(diǎn)。也有利用PCR結(jié)合DNA測(cè)序方法進(jìn)行基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，但是這種方法在大規(guī)模人群篩查或檢測(cè)多個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)的應(yīng)用受到一定限制。因此有必要建立一種高通量、高效能、低成本的肥胖易感基因SNP分型方法，以實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)或規(guī)?；巳汉Y查。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種通過(guò)檢測(cè)rs6046310來(lái)特異性檢測(cè)肥胖癥的試劑盒。
本發(fā)明的目的之一是提供一種肥胖易感基因SNP分子標(biāo)記的篩選方法，所述方法為通過(guò)分析弗雷明漢心臟病研究(FHS)、Omaha骨質(zhì)疏松研究(OOS)和堪薩斯城骨質(zhì)疏松研究樣本(KCOS)這三種樣本的基因組序列以及通過(guò)DXA測(cè)量的脂肪含量，發(fā)現(xiàn)了分子標(biāo)記位點(diǎn)rs6046310，位置在19757284，所述突變?yōu)锳/G與人肥胖直接相關(guān)。
本發(fā)明根據(jù)NCBI上公開的rs6046310分子標(biāo)記上下游序列提供一種人染色體上rs6046310分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物對(duì)，所述引物對(duì)的上游引物：Gagacaagcctggccaacat；下游引物：Agacagggtctcactctgtc；擴(kuò)增片段大?。?01bp。同時(shí)提供了一對(duì)檢測(cè)引物對(duì)，基因型一熒光探針序列：5’-FAM-gctgaggtggaagaattgctt-TAMRA-3’；基因型二熒光探針序列：5’-VIC-gctgaggtgg g agaattgctt-TAMRA-3’。
人染色體上的rs6046310 SNP檢測(cè)芯片可用于單獨(dú)或并行檢測(cè)染色體區(qū)段A/G的突變。所述檢測(cè)芯片采用本領(lǐng)域常規(guī)的構(gòu)建方法制備獲得。
本發(fā)明提供一種檢測(cè)肥胖癥遺傳易感性的試劑盒。該試劑盒包括：
檢測(cè)rs6046310 SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)SEQ ID NO：2和3所示；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明從人染色體上鑒定獲得rs6046310 SNP標(biāo)記可以用于鑒定人肥胖癥狀，所述鑒定具有準(zhǔn)確性好，特異性高的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，SNP位點(diǎn)檢測(cè)可通過(guò)一步PCR即可完成，含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1SNP分子標(biāo)記的獲得
1、樣本的選擇
通過(guò)從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院申請(qǐng)下載以及與骨質(zhì)疏松癥研究專家鄧紅文教授課題組合作，分別獲得了如下三個(gè)具有脂肪含量測(cè)量的樣本：
(1)弗雷明漢心臟病研究(FHS)：FHS是一個(gè)縱向前瞻性家系隊(duì)列研究，共有3代16000余人參與。第一代是居住在美國(guó)Massachusetts弗雷明漢小鎮(zhèn)的5209名居民。第二代是第一代的成年孩子及其配偶，共5124人。第三代是第一代的孫輩，共4000余人。第一代參與者在第22到24次隨訪中接受了雙能X射線(DXA)骨密度儀的檢測(cè)。此儀器不僅能夠測(cè)量骨密度，而且能夠精確測(cè)量身體組分包括脂肪和肌肉的含量。第二代在第6-7次隨訪時(shí)接受了DXA檢測(cè)。第三代在第2次隨訪時(shí)接受了DXA檢測(cè)。
(2)Omaha骨質(zhì)疏松研究樣本(OOS)：OOS樣本包括了1000名隨機(jī)參與者的橫斷面研究。脂肪含量通過(guò)DXA掃描來(lái)測(cè)定。
(3)堪薩斯城骨質(zhì)疏松研究樣本(KCOS)：KCOS樣本包括了2286名隨機(jī)參與者的橫斷面研究。脂肪含量通過(guò)DXA掃描來(lái)測(cè)定。
2、表型測(cè)量和建模
在所有樣本中，使用步進(jìn)回歸法篩查性別、年齡、年齡平方、身高、身高平方、以及從基因組數(shù)據(jù)計(jì)算出的前5個(gè)主成分(用于衡量種群分層效應(yīng))等協(xié)變量的顯著性。為了校正肌肉含量的影響，肌肉含量也用于協(xié)變量校正。原始脂肪含量經(jīng)過(guò)協(xié)變量校正后的殘差使用正態(tài)分布的分位數(shù)來(lái)正態(tài)化。正態(tài)化后的殘差用于下游關(guān)聯(lián)分析。
3、基因分型及質(zhì)控
所有樣本使用高通量基因分型芯片分型。質(zhì)控在樣本層面以及SNP層面實(shí)現(xiàn)。在樣本層面，使用plink軟件分析X染色體推斷性別，并和問(wèn)卷調(diào)查表中的性別做比較。性別不符的個(gè)體從數(shù)據(jù)中刪除。在SNP層面，不符合哈-溫平衡的SNP從數(shù)據(jù)中刪除。由于FHS是家系樣本，其中不符合孟德爾規(guī)律的SNP也被刪除。
4、基因型補(bǔ)缺
使用千人基因組的測(cè)序數(shù)據(jù)(2013年5月版本)對(duì)所有樣本進(jìn)行基因型補(bǔ)缺。首先從千人基因組網(wǎng)站下載240個(gè)測(cè)序個(gè)體的單體型數(shù)據(jù)，并對(duì)參考基因組(即千人基因組數(shù)據(jù))和目標(biāo)基因組(即GWAS樣本)的等位基因做一致性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)不符者將從目標(biāo)基因組中刪除。使用軟件FISH開展基因型補(bǔ)缺，這個(gè)算法具有運(yùn)算速度快，占用內(nèi)存小，無(wú)需對(duì)目標(biāo)基因組提前分相(phasing)等優(yōu)點(diǎn)。軟件參數(shù)默認(rèn)設(shè)置。
5、單樣本中的關(guān)聯(lián)分析及meta分析
在FHS家系樣本中，正態(tài)化的表型殘差和分型及補(bǔ)缺出的基因型間的遺傳關(guān)聯(lián)通過(guò)一個(gè)混合效應(yīng)模型來(lái)檢驗(yàn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，把家系內(nèi)的相關(guān)性建模成隨機(jī)效應(yīng)，而把基因型效應(yīng)建模成固定效應(yīng)。關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)使用方差-組分模型實(shí)現(xiàn)。在OOS和KCOS無(wú)關(guān)樣本中，遺傳關(guān)聯(lián)使用線性回歸模型檢驗(yàn)，軟件為MACH2QTL。
三個(gè)樣本的關(guān)聯(lián)結(jié)果合并在一起開展meta分析。所用模型為樣本量加權(quán)的固定效應(yīng)模型，所用軟件是METAL。
結(jié)論
共有9,179個(gè)個(gè)體納入meta分析中。62％的個(gè)體為女性。在每個(gè)樣本中應(yīng)用主成分分析未檢出異質(zhì)性個(gè)體。千人基因組數(shù)據(jù)共補(bǔ)缺了12,403,269個(gè)SNP位點(diǎn)。刪除低頻(次等位基因頻率MAF<0.05)及低精確度(補(bǔ)缺相關(guān)系數(shù)r2<0.3)位點(diǎn)后共有6,817,908個(gè)位點(diǎn)用于下游關(guān)聯(lián)分析。應(yīng)用PCA校正種群分層后，基因組膨脹系數(shù)是1.08，低于警戒值。p值QQ圖顯示理論p值和實(shí)際p值在[10-2,1]范圍內(nèi)吻合較好，側(cè)面說(shuō)明沒(méi)有明顯的種群分層效應(yīng)。
在基因組顯著性水平上(GWS,5.0x10-8)，共有20個(gè)顯著的SNP位點(diǎn)。它們位于下列三個(gè)基因組區(qū)域:2q24.3(rs10170665,p＝3.22x10-8),17q21(rs4635383,p＝4.40x10-8),以及20p11(18SNPs,最顯著SNP rs62203173 p＝1.38x10-9)。其中10個(gè)在meta分析中有顯著的遺傳異質(zhì)性(I2>50％)。對(duì)這些SNP應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型后，其關(guān)聯(lián)信號(hào)消失。剩余的10個(gè)SNP位于同一個(gè)基因組區(qū)域20p11，它們位于同一個(gè)單體型塊中，但具有不同的連鎖不平衡模式(r2＝0.35-1.00)。其中1個(gè)主要SNP為rs6046310。其結(jié)果如下表1：
表1rs6046310結(jié)果數(shù)據(jù)
從表1的數(shù)據(jù)可以看出，針對(duì)rs6046310的19757284位點(diǎn)，存在A/G的突變，當(dāng)其為A的時(shí)候，表現(xiàn)為具有肥胖特性，當(dāng)其為G時(shí)不表現(xiàn)出肥胖特性。突變基因型A導(dǎo)致了脂肪含量的升高，從而最終導(dǎo)致肥胖癥的發(fā)生。這種升高在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是極端顯著的(p＝8.03x10-9),因此可以通過(guò)檢測(cè)該位點(diǎn)基因型來(lái)檢測(cè)肥胖癥。
上面通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，本發(fā)明并不限于此處所列出的實(shí)施例，其保護(hù)范圍由所附權(quán)利要求書限定，下面的實(shí)施例僅僅是以示例的方式說(shuō)明本發(fā)明，以使本發(fā)明更易于理解。
序列表
〈110〉張壘
〈120〉一種通過(guò)檢測(cè)rs6046310來(lái)特異性檢測(cè)肥胖癥的試劑盒
〈210〉1
〈211〉201
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉rs6046310
gagacaagcc tggccaacat ggtgaaaccc catctctact aaaaatgcaa aagttagctg ggcatggtgg cggctgcctg tagtcccagc tactcgggag gctgaggtgg R agaattgctt gaacccagga ggtggaggct gcagtgagcc gagatcacgc cactgcgctc cagcctgggt gacagagtga gaccctgtct
〈210〉2
〈211〉20
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉上游引物
Gagacaagcctggccaacat；
〈210〉3
〈211〉20
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉下游引物
Agacagggtctcactctgtc；
〈210〉4
〈211〉21
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉基因型一熒光探針序列
5’ -FAM- gctgaggtggaagaattgctt- TAMRA -3’
〈210〉5
〈211〉15
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉基因型二熒光探針序列
5’-VIC- gctgaggtgg g agaattgctt-TAMRA -3’