本發(fā)明屬于有機(jī)化合物合成與醫(yī)藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種噻吩并[3,2-d]嘧啶HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)目前已經(jīng)成為危害人類(lèi)生命健康的重大傳染性疾病，其主要病原體是人免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)。盡管高效抗逆轉(zhuǎn)錄療法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)的實(shí)施顯著延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但是耐藥問(wèn)題和藥物毒副作用以及長(zhǎng)期服用藥物的費(fèi)用等問(wèn)題，迫使研究者研發(fā)高效低毒的新型HIV-1抑制劑。HIV-1非核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)具有高效低毒、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是HAART療法的重要組成部分，但該類(lèi)藥物易產(chǎn)生耐藥性的缺陷使該類(lèi)藥物迅速喪失臨床效價(jià)。

二芳基嘧啶(diarylpyrimidine,DAPY)類(lèi)是一類(lèi)典型的HIV-1NNRTIs，具有較強(qiáng)的抗HIV活性，對(duì)耐藥突變毒株也有很好的抑制作用。但較低的水溶性和較差的透膜性導(dǎo)致其生物利用度低、口服劑量加大，引起毒副作用和交叉耐藥等問(wèn)題。例如，依曲韋林(Etravirine)需要每日多次給藥，且伴隨著嚴(yán)重的皮膚過(guò)敏反應(yīng)。利匹韋林(Rilpivirne)藥代性質(zhì)有所提高，但仍存在抑郁、失眠、急性呼吸窘迫綜合征、頭痛及皮疹等毒副作用，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，研發(fā)高效、廣譜抗耐藥以及具有良好藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的NNRTIs是前抗艾滋病藥物研究的重要領(lǐng)域之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及其制備方法，本發(fā)明還提供上述化合物作為HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的活性篩選結(jié)果及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑

一種噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或前藥，具有通式I所示的結(jié)構(gòu)：

其中，

X為：O，NH或者S；

Y為：CH₂，CO或者SO₂；

R為：CH₃，CN或者CH＝CHCN；

Ar為：取代苯環(huán)、取代萘環(huán)、各種取代的六元雜環(huán)、各種取代的五元雜環(huán)、各種取代的六元并五元雜環(huán)、各種取代的六元并六元雜環(huán)、各種取代的五元并五元雜環(huán)、各種取代的苯并五元雜環(huán)或各種取代的苯并六元雜環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，Ar為苯基或4-吡啶基；或鹵素，NO₂，CN，NH₂，CF₃，NHCH₃，OH，COOH，CH₂OH，CO₂Me，CONH₂，OCH₃，NHCOCH₃，SO₂NH₂，SO₂CH₃取代的苯基；取代基為鄰、間、對(duì)位單取代或多取代。

進(jìn)一步優(yōu)選的，噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是下列化合物之一：

本發(fā)明中所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指在可靠的醫(yī)藥評(píng)價(jià)范圍內(nèi)，化合物的鹽類(lèi)適于與人或較低等動(dòng)物的組織相接觸而無(wú)不適當(dāng)?shù)亩拘?、刺激及過(guò)敏反應(yīng)等，具有相當(dāng)合理的收益與風(fēng)險(xiǎn)比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其預(yù)期的用途。包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽和藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，在這里是可做預(yù)期的用途并與式I化合物的化學(xué)性質(zhì)相容的。適宜的鹽的列表參見(jiàn)S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19頁(yè)。

本發(fā)明中所述的“前藥”是指藥學(xué)上可接受的衍生物，以便這些衍生物所得的生物轉(zhuǎn)換產(chǎn)物是如式I化合物所定義的活性藥物。

2.噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的制備方法

噻吩并嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的制備方法，步驟如下：以2,4-二氯取代的噻吩并嘧啶1為初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中與取代苯酚、苯硫醇或苯胺發(fā)生親核取代生成中間體2；然后中間體2與N-Boc-1,4-環(huán)己二胺發(fā)生布赫瓦爾德-哈特維希(Buchwald-Hartwig)偶聯(lián)反應(yīng)生成中間體3，然后脫BOC保護(hù)得到中間體4；最后關(guān)鍵中間體4在N,N-二甲基甲酰胺溶液中和碳酸鉀或三乙胺做縛酸劑的條件下，與各種取代氯芐、溴芐、酰氯以及磺酰氯反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物5；合成路線如下：

試劑及條件:(i)取代苯酚、苯胺或者苯基硫醇，二甲基甲酰胺，碳酸鉀，室溫；(ii)N-Boc-4-氨基哌啶，二甲基亞砜，碳酸鉀，120℃；(iii)N-Boc-4-氨基哌啶，醋酸鈀，4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽，碳酸銫，90℃，二氧六環(huán)；(iv)二氯甲烷，三氟乙酸，室溫；(v)二甲基甲酰胺或二氯甲烷，碳酸鉀或者三乙胺，室溫。

X、Y、R、Ar同上述通式I所示。

所述的取代苯酚、苯基硫醇或者苯胺為：均三甲基苯酚，2,6-二甲基-4-氰基苯酚，2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯酚，均三甲基苯胺，2,6-二甲基-4-氰基苯胺，2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯胺，均三甲基苯基硫醇，2,6-二甲基-4-氰基苯基硫醇或2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯基硫醇；

所述的取代氯芐、溴芐、酰氯及磺酰氯為：鄰氯氯芐、間氯氯芐、對(duì)氯氯芐、鄰溴溴芐、間溴溴芐、對(duì)溴溴芐、鄰氟氯芐、間氟氯芐、對(duì)氟氯芐、2,4-二氟溴芐、3,4-二氟溴芐、鄰氰基氯芐、間氰基氯芐、對(duì)氰基氯芐、鄰硝基氯芐、間硝基氯芐、對(duì)硝基氯芐、鄰甲氧基氯芐、間甲氧基氯芐、對(duì)甲氧基氯芐、對(duì)甲磺酰基溴芐、對(duì)磺酰胺基溴芐、對(duì)甲酰胺基溴芐、4-(溴甲基)苯甲酸甲酯、鄰氯苯甲酰氯、間氯苯甲酰氯、對(duì)氯苯甲酰氯、鄰溴苯甲酰氯、間溴苯甲酰氯、對(duì)溴苯甲酰氯、鄰氟苯甲酰氯、間氟苯甲酰氯、對(duì)氟苯甲酰氯、2,4-二氟苯甲酰氯、3,4-二氟苯甲酰氯、鄰氰基苯甲酰氯、間氰基苯甲酰氯、對(duì)氰基苯甲酰氯、鄰硝基苯甲酰氯、間硝基苯甲酰氯、對(duì)硝基苯甲酰氯、鄰甲氧基苯甲酰氯、間甲氧基苯甲酰氯、對(duì)甲氧基苯甲酰氯、對(duì)甲磺?；郊柞Ｂ?、對(duì)磺酰胺基苯甲酰氯、對(duì)甲酰胺基苯甲酰氯、4-(溴甲基)苯甲酰氯、鄰氯苯磺酰氯、間氯苯磺酰氯、對(duì)氯苯磺酰氯、鄰溴苯磺酰氯、間溴苯磺酰氯、對(duì)溴苯磺酰氯、鄰氟苯磺酰氯、間氟苯磺酰氯、對(duì)氟苯磺酰氯、2,4-二氟苯磺酰氯、3,4-二氟苯磺酰氯、鄰氰基苯磺酰氯、間氰基苯磺酰氯、對(duì)氰基苯磺酰氯、鄰硝基苯磺酰氯、間硝基苯磺酰氯、對(duì)硝基苯磺酰氯、鄰甲氧基苯磺酰氯、間甲氧基苯磺酰氯、對(duì)甲氧基苯磺酰氯、對(duì)甲磺?；交酋Ｂ取?duì)磺酰胺基苯磺酰氯、對(duì)甲酰胺基苯磺酰氯或者4-(溴甲基)苯磺酰氯。

本發(fā)明所述的室溫為20-30℃。

3.噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的抗HIV-1野生株及突變株活性及應(yīng)用

本發(fā)明對(duì)按照上述方法合成的部分噻吩并嘧啶類(lèi)衍生物進(jìn)行了細(xì)胞水平的抗HIV-1(III_B)，單耐藥突變株K103N、Y181C、Y188L以及雙耐藥突變株RES056(K103N/Y181C)的活性篩選，以奈韋拉平(NVP)、依法韋倫(EFV)、依曲韋林(ETV)和齊多夫定(AZT)為陽(yáng)性對(duì)照。它們的抗HIV-1活性和毒性數(shù)據(jù)分別列于表1和表2中。

由表1和表2可以看出，本發(fā)明的噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物是一系列結(jié)構(gòu)新穎的非核苷類(lèi)HIV-1抑制劑，絕大部分化合物表現(xiàn)出了比較好的抑制野生株和突變株的活性。其中，化合物DK19的活性尤為突出，其對(duì)HIV-1野生株的EC₅₀值達(dá)到7.1nM，是第一代抗艾滋病藥物奈韋拉平(NVP)的18倍以上?；衔顳K19亦表現(xiàn)出了較高的安全性，其對(duì)HIV-1野生株的選擇性指數(shù)為1308。另外，對(duì)單突變株K103N和E138K,化合物DK19亦表現(xiàn)出納摩爾級(jí)別的抗病毒活性，分別為70nM與45nM。因此該類(lèi)噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)化合物具有進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)的價(jià)值，可作為抗HIV-1的先導(dǎo)化合物加以利用。

本發(fā)明的噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可作為非核苷類(lèi)HIV-1抑制劑應(yīng)用。具體地說(shuō)，作為HIV-1抑制劑用于制備抗艾滋病藥物。

一種抗HIV-1藥物組合物，包括本發(fā)明的噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑。

本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)全新的噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及其制備方法，本發(fā)明還提供了化合物抗HIV-1活性篩選結(jié)果及其在抗病毒領(lǐng)域中的首次應(yīng)用。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)衍生物可作為HIV-1抑制劑應(yīng)用并具有很高的應(yīng)用價(jià)值。具體地說(shuō)，作為HIV-1抑制劑用于制備抗艾滋病藥物。

具體實(shí)施方式

通過(guò)下述實(shí)施例有助于理解本發(fā)明，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實(shí)施例中所涉及的合成路線如下：

實(shí)施例1：((2-((4-氨基環(huán)己基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基芐腈(DK1)的制備

稱(chēng)取4-羥基-3,5-二甲基苯腈(0.15g,1mmol)和碳酸鉀(0.17g,1.2mmol)于5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室溫?cái)嚢?5分鐘，然后加入2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(0.21g,1mmol)繼續(xù)室溫?cái)嚢?h(TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢)。此時(shí)有大量的白色固體生成，慢慢地向其中加入25mL冰水，過(guò)濾，真空干燥箱干燥，得到白色固體即為化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈，收率93.8％，熔點(diǎn)258-260℃。

稱(chēng)取化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(0.32g,1.0mmol)，N-Boc-1,4-環(huán)己二胺(0.26g,1.2mmol)，醋酸鈀(0.02g,0.1mmol)，4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽(0.06g,0.1mmol)與碳酸銫(0.65g,2mmol)加入于15mL的二氧六環(huán)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下加熱回流12小時(shí)。待反應(yīng)冷卻到室溫以后，加硅藻土過(guò)濾，濾液蒸干。然后將該粗品溶于5mL二氯甲烷中，然后慢慢地向其中加入三氟乙酸2mL，室溫條件下攪拌4小時(shí)(TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢)。向反應(yīng)液中加入10mL水，用飽和的碳酸氫鈉水溶液調(diào)PH為9，二氯甲烷萃取(3×5mL)，飽和食鹽水水洗，分取有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥。然后進(jìn)行快速柱層析分離得到白色固體即為化合物((2-((4-氨基環(huán)己基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基芐腈。收率56.3％，熔點(diǎn)185-190℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.72(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.36(s,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.13(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),4.78(s,1H,NH),3.06(q,J＝7.3Hz,1H),2.80-2.96(m,3H),2.09(s,6H),1.95-1.97(m,4H),1.07-1.35(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ164.2,161.7,158.9,152.4,132.0,131.3,122.2,117.6,116.8,113.9,108.2,59.3,48.9,44.7,35.5,29.4,28.1,15.3.ESI-MS:m/z 394.4(M+1).C₂₁H₂₃N₅OS(393.16).

實(shí)施例2：化合物DK2-DK12的制備

稱(chēng)取化合物((2-((4-氨基環(huán)己基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基芐腈(DK1)(0.5mmol)于10mL DMF中，室溫條件下攪拌溶解后加入無(wú)水碳酸(0.14g,1.0mmol)與取代的氯芐或溴芐(0.6mmol)，室溫條件下攪拌6-15h(TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢)。減壓蒸出溶劑，然后向殘留底物中加入20mL乙酸乙酯，飽和食鹽水溶液洗滌3次，每次10mL，分取有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮?？焖僦鶎游龇蛛x得到目標(biāo)化合物，進(jìn)而在乙酸乙酯-石油醚體系中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物DK2-DK12。

以不同的取代芐基和((2-((4-氨基環(huán)己基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基芐腈(DK1)用上述方法分別制得化合物DK2-DK12的目標(biāo)產(chǎn)物，結(jié)果如下：

操作同上，所不同的是使用對(duì)溴甲基苯磺酰胺。

產(chǎn)物為白色固體，收率：78.6％，熔點(diǎn)216-218℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.19(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.72(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.52(d,J＝8.1Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.27-7.29(m,3H),6.75(s,1H,pyrimidine-NH),4.36(s,1H,cyclohexane-NH),3.79(s,2H,N-CH₂),3.24-3.39(m,2H),2.11(s,6H),1.74-1.91(m,4H),1.12-1.20(m,4H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ170.8,160.6,142.7,133.2,132.9,128.6,125.9,119.0,109.0,60.2,56.5,55.5,49.9,32.0,31.0,21.2,19.0,16.2,14.5.ESI-MS:m/z 563.2(M+1),585.4(M+Na).C₂₈H₃₀N₆O₃S₂(562.18).

操作同上，所不同的是使用對(duì)溴甲基苯甲酰胺。

產(chǎn)物為白色固體，收率：75.2％，熔點(diǎn)224-227℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.17(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.76(d,J＝8.3Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.72(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.29-7.35(m,4H),7.27(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.77(s,1H,pyrimidine-NH),4.36(s,1H,cyclohexane-NH),3.79(s,2H,N-CH₂),3.27-3.35(m,2H),2.09(s,6H),1.96-2.08(m,4H),1.19-1.35(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.4,160.1,141.9,133.2,132.4,127.7,125.9,118.6,109.0,60.1,56.7,55.5,48.6,32.2,31.0,21.2,19.0,16.2,14.5.ESI-MS:m/z 527.3(M+1),549.2(M+Na).C₂₉H₃₀N₆O₂S(526.22).

操作同上，所不同的是使用3-溴甲基苯甲酰胺。

產(chǎn)物為白色固體，收率：51.1％，熔點(diǎn)215-219℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.17(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.75-7.78(m,2H),7.72(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.51-7.53(m,2H),7.27(s,2H),7.27(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.77(s,1H,pyrimidine-NH),4.39(s,1H,cyclohexane-NH),3.79(s,2H,N-CH₂),3.21-3.31(m,2H),2.11(s,6H),1.85-2.01(m,4H),1.21-1.35(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.1,160.6,142.3,133.7,131.5,128.1,124.6,119.2,109.7,60.0,57.3,55.5,49.0,32.7,31.0,21.6,18.3,16.7,14.5.ESI-MS:m/z 527.2(M+1),549.1(M+Na).C₂₉H₃₀N₆O₂S(526.22).

操作同上，所不同的是使用對(duì)硝基溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：48.2％，熔點(diǎn)185-187℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.18(d,J＝9.2Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.79(d,J＝5.4,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.53(d,J＝8.6Hz,1H,C₂,C₆-Ph’-H),7.43(s,1H,C₃,C₅-Ph”-H),7.21(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.87(s,1H,pyrimidine-NH),4.73(s,1H,cyclohexane-NH),3.92(s,2H,N-CH₂),2.54-2.66(m,2H),2.17(s,6H),1.94-2.05(m,4H),1.12-1.42(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl3):δ165.5,160.3,153.3,147.0,134.9,133.1,132.2,128.6,123.6,123.3,118.7,109.5,60.4,55.8,50.3,31.8,31.4,28.4,27.9,16.4,14.2.ESI-MS:m/z529.5(M+1),551.4(M+Na).C₂₈H₂₈N₆O₃S(528.19).

操作同上，所不同的是使用4-甲砜基溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：61.6％，熔點(diǎn)231-234℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.17(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.74(d,J＝8.1Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.72(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.52(d,J＝8.1Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.27(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.71(s,1H,pyrimidine-NH),4.35(s,1H,cyclohexane-NH),3.74(s,2H,N-CH₂),3.21-3.27(m,2H),3.06(s,3H,SO₂CH₃),2.11(s,6H),1.73-1.98(m,4H),1.17-1.26(m,4H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.2,162.6,159.9,147.7,139.1,133.1,132.2,128.2,127.4,127.2,118.7,63.8,44.5,36.6,31.4,29.6,28.8,19.1,16.4.ESI-MS:m/z 562.5(M+1),584.8(M+Na).C₂₉H₃₁N₅O₃S₂(561.19).

操作同上，所不同的是使用溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：65.2％，熔點(diǎn)188-190℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.49-7.53(m,2H),7.45(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.32-7.42(m,3H),7.23(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.73(s,1H,pyrimidine-NH),4.37(s,1H,cyclohexane-NH),3.74(s,2H,N-CH₂),3.23-3.25(m,2H),2.12(s,6H),1.77-1.92(m,5H),1.25-1.27(m,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.4,162.6,160.0,153.3,134.9,133.1,132.4,130.0,129.2,129.1,123.4,118.7,109.5,60.4,55.5,48.7,30.7,27.9,16.4,14.2.ESI-MS:m/z 484.3(M+1),506.1(M+Na).C₂₈H₂₉N₅OS(483.21).

操作同上，所不同的是使用4-溴溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：62.3％，熔點(diǎn)203-205℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.44-7.46(m,2H),7.43(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.26(d,J＝7.0Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.21(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.75(s,1H,pyrimidine-NH),4.37(s,1H,cyclohexane-NH),3.79(s,2H,N-CH₂),3.21-3.25(m,2H),2.17(s,6H),1.95-2.05(m,4H),1.21-1.42(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.4,162.7,160.2,153.3,134.9,133.1,132.2,131.6,130.3,123.4,118.7,109.5,106.3,55.5,49.9,31.3,31.1,27.8,16.4.ESI-MS:m/z 562.3(M+1),564.3(M+3),584.1(M+Na).C₂₈H₂₈BrN₅OS(561.12).

操作同上，所不同的是使用4-氟溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：59.6％，熔點(diǎn)231-233℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.81(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.48-7.50(m,2H),7.47(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.26-7.28(m,2H),7.23(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.77(s,1H,pyrimidine-NH),4.35(s,1H,cyclohexane-NH),3.75(s,2H,N-CH₂),3.23-3.26(m,2H),2.17(s,6H),1.93-2.07(m,5H),1.25-1.38(m,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.5,161.9,160.7,154.1,134.0,133.7,132.1,131.3,130.3(d,J＝8.3Hz),123.8,118.4,115.2(d,J＝20.7Hz),109.9,106.3,55.8,49.1,31.3,30.8,27.8,16.2.ESI-MS:m/z 502.4(M+1),524.4(M+Na).C₂₈H₂₈FN₅OS(501.20).

操作同上，所不同的是使用4-羥基溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：53.8％，熔點(diǎn)186-188℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.81(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.43(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.31-7.35(m,2H),7.23(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.94-6.97(m,2H),6.73(s,1H,pyrimidine-NH),4.34(s,1H,cyclohexane-NH),3.77(s,2H,N-CH₂),3.21-3.25(m,2H),2.17(s,6H),1.91-2.02(m,3H),1.27-1.45(m,5H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.6,161.3,160.7,154.1,134.0,133.8,132.9,132.3,131.3,130.3,123.8,117.8,109.2,107.0,55.8,49.4,31.7,30.8,27.3,16.1.ESI-MS:m/z 500.2(M+1),522.2(M+Na).C₂₈H₂₉N₅O₂S(499.20).

操作同上，所不同的是使用3-三氟甲基溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：58.8％，熔點(diǎn)235-237℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.51-7.61(m,4H),7.45-7.46(m,1H),7.43(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.21(d,J＝5.3Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.74(s,1H,pyrimidine-NH),4.73(s,1H,cyclohexane-NH),3.88(s,2H,N-CH₂),3.21-3.25(m,2H),2.18(s,6H),1.98-2.09(m,4H),1.15-1.43(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.4,162.7,160.3,153.3,141.0,134.9,133.1,132.2,131.5,130.8,130.5,128.9,124.8,123.9,123.4,118.7,109.5,106.3,58.4,55.8,50.5,31.6,27.9,16.4.ESI-MS:m/z 552.4(M+1),574.5(M+Na).C₂₉H₂₈F₃N₅OS(551.20).

操作同上，所不同的是使用4-氰基溴芐。

產(chǎn)物為白色固體，收率：55.2％，熔點(diǎn)221-224℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.15(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.76(d,J＝8.2Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.72(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.53(d,J＝8.0Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.26(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),6.68(s,1H,pyrimidine-NH),4.32(s,1H,cyclohexane-NH),3.71(s,2H,N-CH₂),3.23-3.26(m,2H),2.11(s,6H),1.87-2.06(m,3H),1.19-1.31(m,5H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.1,162.0,159.5,146.3,138.5,133.7,131.8,128.2,127.9,127.1,117.4,63.0,45.2,36.6,31.1,29.3,27.2,19.8,16.2.ESI-MS:m/z 509.4(M+1),531.5(M+Na).C₂₉H₂₈N₆OS(508.20).

實(shí)施例3：化合物DK13-DK22的制備

稱(chēng)取化合物((2-((4-氨基環(huán)己基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基芐腈(0.5mmol)于10mL DCM中，室溫條件下攪拌溶解后加入三乙胺(0.06g,0.6mmol)與取代的苯甲酰氯或苯磺酰氯(0.6mmol)，室溫條件下攪拌3-5h(TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢)。然后反應(yīng)液加入10mL DCM，飽和食鹽水溶液洗滌3次，每次10mL，分取有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮?？焖僦鶎游龇蛛x得到目標(biāo)化合物，進(jìn)而在乙酸乙酯-石油醚體系中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物DK13-DK22。

以不同的取代芐基和((2-((4-氨基環(huán)己基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基芐腈(DK1)用上述方法分別制得化合物DK13-DK22的目標(biāo)產(chǎn)物，結(jié)果如下：

操作同上，所不同的是使用苯甲酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：67.2％，熔點(diǎn)201-203℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.80(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.75-7.78(m,2H),7.48-7.50(m,1H),7.38-7.46(m,4H),7.22(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),5.99(s,1H,pyrimidine-NH),3.93(s,1H),3.38-3.55(m,4H),2.18(s,6H),2.02-2.10(m,4H),1.24-1.30(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl3):δ166.9,165.3,162.7,160.1,153.3,134.7,133.1,132.2,131.4,128.5,126.8,123.2,118.8,109.4,60.4,49.8,48.2,31.7,31.5,16.4.ESI-MS:m/z 498.3(M+1).C₂₈H₂₇N₅O₂S(497.19).

操作同上，所不同的是使用對(duì)氟苯甲酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：70.3％，熔點(diǎn)220-223℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.21(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.85-7.96(m,2H),7.73(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.27-7.31(m,2H),5.98(s,1H,pyrimidine-NH),3.71(s,1H),2.14(s,6H),1.83-2.00(m,4H),1.32-1.47(m,5H).¹³C NMR(100MHz,DMSO):δ165.4,164.9,162.9,162.4,160.5,153.5,133.2,131.7(d,J＝2.8Hz),130.3(d,J＝8.9Hz),123.7,119.0,115.6(d,J＝21.6Hz),109.1,60.2,49.4,48.5,31.3,16.2.ESI-MS:m/z 516.3(M+1),538.1(M+Na).C₂₈H₂₆FN₅O₂S(515.18).

操作同上，所不同的是使用對(duì)溴苯甲酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：61.7％，熔點(diǎn)219-221℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.81(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.61(d,J＝8.1Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.53(d,J＝8.0Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.43(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.21(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),5.97(d,J＝8.0Hz,1H,pyrimidine-NH),4.81(s,1H),3.91(s,1H),2.18(s,6H),1.93-2.08(m,5H),1.22-1.31(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.9,165.3,162.7,160.1,153.3,135.1,133.5,133.1,132.2,131.7,128.5,126.0,123.2,118.8,109.4,49.7,48.4,31.4,16.4.ESI-MS:m/z 576.4(M+1),598.3(M+Na).C₂₈H₂₆BrN₅O₂S(575.10).

操作同上，所不同的是使用對(duì)氰基苯甲酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：66.7％，熔點(diǎn)141-146℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.81(d,J＝5.3Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.61(d,J＝8.0Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.54-7.58(m,2H),7.42(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.20(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),5.96(s,1H,pyrimidine-NH),4.82(s,1H),3.91-3.92(m,1H),2.18(s,6H),1.90-2.01(m,4H),1.20-1.37(m,5H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.7,165.0,162.7,160.4,154.2,135.7,133.5,133.4,132.2,131.6,128.5,126.7,123.2,118.9,109.4,49.2,48.4,31.4,16.2.ESI-MS:m/z 523.7(M+1),545.4(M+Na).C₂₉H₂₆N₆O₂S(522.18).

操作同上，所不同的是使用間三氟甲基苯甲酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：58.2％，熔點(diǎn)113-116℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.81(d,J＝5.3Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.61-7.63(m,1H),7.50-7.57(m,3H),7.42(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.21(d,J＝5.3Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),5.96(s,1H,pyrimidine-NH),4.80(s,1H),3.88-3.89(m,1H),2.18(s,6H),1.94-2.03(m,4H),1.75-1.83(m,2H),1.22-1.30(m,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.7,162.6,160.4,154.4,135.3,134.5,133.7,133.0,132.1,131.7,128.5,126.3,123.2,119.2,109.4,49.3,48.4,31.4,16.3.ESI-MS:m/z 566.3(M+1),588.5(M+Na).C₂₉H₂₆F₃N₅O₂S(565.18).

操作同上，所不同的是使用對(duì)氟苯磺酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：76.2％，熔點(diǎn)187-190℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.86-7.95(m,2H),7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.41(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.14-7.24(m,3H),4.72(s,1H),3.07-3.09(m,1H),2.15(s,6H),1.81-1.95(m,5H),1.08-1.14(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ166.2,165.3,163.7,162.7,160.0,153.2,137.4,135.1,133.0,132.2,129.5(d,J＝9.2Hz),123.2,118.7,116.2(d,J＝22.6Hz),109.5,60.4,52.2,49.2,32.4,31.3,16.4.ESI-MS:m/z 552.7(M+1).C₂₇H₂₆FN₅O₃S₂(551.15).

操作同上，所不同的是使用對(duì)氰基苯磺酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：70.9％，熔點(diǎn)258-260℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.79(d,J＝5.3Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.76(d,J＝8.6Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.62-7.65(m,2H),7.42(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.18(d,J＝5.1Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),4.71(d,J＝7.3Hz,1H,pyrimidine-NH),3.07-3.09(m,1H),2.17(s,6H),1.92-2.04(m,5H),1.12-1.24(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.2,162.2,154.1,140.4,135.8,133.4,132.4,132.0,128.4,127.6,123.2,119.1,118.7,109.5,106.1,60.4,58.7,52.3,49.6,32.4,31.8,16.2.ESI-MS:m/z 559.3(M+1),581.2(M+Na).C₂₈H₂₆N₆O₃S₂(558.15).

操作同上，所不同的是使用間三氟甲基苯磺酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：65.7％，熔點(diǎn)128-130℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.16(s,1H,C₂-Ph’-H),8.08(d,J＝8.1Hz,1H,C₄-Ph’-H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H,C₆-Ph’-H),7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.69(t,J＝7.9Hz,1H,C₅-Ph’-H),7.42(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.19(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),4.76(d,J＝7.8Hz,1H,pyrimidine-NH),3.15-3.20(m,1H),2.15(s,6H),1.81-1.95(m,5H),1.08-1.14(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.1,164.2,162.7,159.9,153.2,142.7,133.0,132.2,131.6,130.0(d,J＝7.3Hz),129.2(d,J＝3.7Hz),124.5,123.9,123.2,121.8,118.7,109.5,106.5,52.5,49.1,32.4,31.2,16.4.ESI-MS:m/z 602.7(M+1),624.3(M+Na).C₂₈H₂₆F₃N₅O₃S₂(601.14).

操作同上，所不同的是使用對(duì)甲酰胺基苯磺酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：69.1％，熔點(diǎn)252-254℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.15(d,J＝8.6Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.76(d,J＝8.6Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.43(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.16(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),4.78(d,J＝7.6Hz,1H,pyrimidine-NH),3.10-3.13(m,1H),2.15(s,6H),2.06(s,3H),1.86-1.99(m,5H),1.10-1.18(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ168.7,165.3,162.8,160.4,153.1,140.7,135.2,133.4,132.4,132.0,128.4,127.6,123.2,118.9,109.5,106.2,60.4,58.6,52.3,49.2,32.4,31.2,25.6,16.2.ESI-MS:m/z 591.3(M+1),613.6(M+Na).C₂₉H₃₀N₆O₄S₂(590.18).

操作同上，所不同的是使用對(duì)溴苯磺酰氯。

產(chǎn)物為白色固體，收率：73.8％，熔點(diǎn)235-237℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.79(d,J＝5.4Hz,1H,C₆-thienopyrimidine-H),7.76(d,J＝8.6Hz,2H,C₂,C₆-Ph’-H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H,C₃,C₅-Ph’-H),7.42(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.18(d,J＝5.4Hz,1H,C₇-thienopyrimidine-H),4.76(d,J＝7.5Hz,1H,pyrimidine-NH),3.07-3.09(m,1H),2.15(s,6H),1.81-1.95(m,5H),1.08-1.23(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ165.2,162.6,160.0,153.2,140.4,135.1,133.0,132.4,132.2,128.4,127.4,123.2,118.7,109.5,106.5,60.4,58.4,52.3,49.2,32.4,31.2,16.4.ESI-MS:m/z 612.4(M+1),534.6(M+Na).C₂₇H₂₆BrN₅O₃S₂(611.07).

實(shí)施例4：目標(biāo)化合物的體外抗HIV活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)

測(cè)試原理：

化合物體外抗HIV活性篩選采用MTT法。MTT全稱(chēng)為溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑藍(lán)),可用于檢測(cè)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。檢測(cè)原理為：MTT可以與活的細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶結(jié)合還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞并無(wú)此功能。二甲基亞砜可以溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在590nm下的吸光度(A)值可以間接的反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定的細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

由于HIV感染的MT-4細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)(5-7天)會(huì)發(fā)生病變，因此向HIV感染的MT-4細(xì)胞懸濁液中加入適當(dāng)濃度的待檢測(cè)化合物溶液，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(5-7天)的培養(yǎng)后，用MTT分析法測(cè)定MT-4細(xì)胞活力，得到保護(hù)50％細(xì)胞免于細(xì)胞病變的藥物濃度(EC₅₀)即可得出目標(biāo)化合物的抗HIV的活性。同時(shí)得到目標(biāo)化合物使50％未感染HIV的細(xì)胞發(fā)生病變的濃度(CC₅₀),計(jì)算出選擇系數(shù)(selectivity index，SI＝CC₅₀/EC₅₀)。

測(cè)試材料和方法：

(1)HIV-1(III_B)、HIV-2(ROD)毒株、各種HIV-1耐藥株：由比利時(shí)魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rega研究所提供。

(2)MT-4細(xì)胞：由比利時(shí)魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rega研究院提供。

(3)MTT：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

(4)樣品處理：樣品臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，并用雙蒸水作5倍稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度。

(5)陽(yáng)性對(duì)照藥：奈韋拉平(NVP)、依法韋侖(EFV)、依曲韋林(ETV)、齊多夫定(AZT)。

(6)測(cè)試方法：樣品稀釋后加入到HIV感染MT-4細(xì)胞懸濁液中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，用酶標(biāo)儀中記錄在590nm下的吸光度(A)值,計(jì)算出EC₅₀，CC₅₀以及SI。

(7)MTT比色法：加入樣品溶液培養(yǎng)一段時(shí)間后，向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)后，棄染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，用酶標(biāo)儀中測(cè)定590nm下的吸光度(A)值。

實(shí)驗(yàn)方法：

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入50μL含1×10⁴MT-4細(xì)胞培養(yǎng)液，再分別加入20μL感染HIV-1(III_B或者RES056)或HIV-2(ROD)的MT-4細(xì)胞混懸液(每毫升含100倍CCID₅₀)或者空白(毒性測(cè)定)，然后加入不同濃度的待測(cè)化合物溶液或者陽(yáng)性對(duì)照藥物，每個(gè)濃度設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。接著細(xì)胞在5％CO₂氛圍，37℃下培養(yǎng)5天，向每個(gè)孔中加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后加入DMSO，使用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)溶液在540nm處的吸收度，計(jì)算化合物不同濃度下的細(xì)胞增值率P％。同時(shí)設(shè)空白和藥物對(duì)照組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組，由此計(jì)算化合物保護(hù)50％的細(xì)胞免于HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變所需濃度(EC₅₀)。選擇指數(shù)的計(jì)算：SI＝CC₅₀/EC₅₀。

按照上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)合成的部分噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)衍生物進(jìn)行了細(xì)胞水平的抗HIV-1(III_B)，單突變株K103N、Y181C、Y188L以及雙突變株RES056(K103N/Y181C)的活性篩選，活性結(jié)果如表1和表2所示。

表1.部分噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)類(lèi)化合物抗HIV活性、毒性及選擇指數(shù)

^a EC₅₀:抑制50％的病毒誘導(dǎo)的致細(xì)胞突變效應(yīng)的化合物濃度或保護(hù)50％感染病毒的細(xì)胞免于細(xì)胞病變的化合物濃度。

^b CC₅₀：使50％未感染HIV的細(xì)胞發(fā)生病變的濃度。

^c SI:選擇系數(shù)，CC₅₀/EC₅₀的比值。

表2.部分噻吩并[3,2-d]嘧啶類(lèi)類(lèi)化合物抗HIV-1突變株活性