相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本發(fā)明要求于2010年9月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/383,201和于2011年5月25日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/490,039的優(yōu)先權(quán)利益。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于診斷來(lái)自不同解剖位點(diǎn)的癌癥的分子診斷試驗(yàn)，包括常見dna損傷修復(fù)缺陷亞型的使用。本發(fā)明包括用于鑒定該dna損傷修復(fù)缺陷分子亞型的44-基因分類模型的使用。一個(gè)應(yīng)用是對(duì)包括dna損傷誘導(dǎo)劑和dna修復(fù)靶向治療的乳腺癌治療藥物類別的應(yīng)答進(jìn)行分層并選擇患者。另一個(gè)應(yīng)用是將卵巢癌患者分層為對(duì)dna損傷誘導(dǎo)劑應(yīng)答的和對(duì)dna損傷誘導(dǎo)劑非應(yīng)答的。本發(fā)明提供了試驗(yàn)，所述試驗(yàn)可指導(dǎo)常規(guī)治療選擇以及可在新型治療的臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)中指導(dǎo)選擇用于富集策略的患者群。dna修復(fù)缺陷亞型可從新鮮/冷凍(ff)的患者樣品或福爾馬林固定石蠟包埋(ffpe)的患者樣品來(lái)鑒定。

背景

制藥業(yè)一直在追求比目前施用的藥物更有效的、更特異的或具有較少不良副作用的新型藥物治療。由于人類種群中的遺傳變異性導(dǎo)致多種藥物的有效性的實(shí)質(zhì)性改變，藥物治療替代方案正在不斷地開發(fā)中。因此，雖然多種藥物治療替代方案目前可用，但是在患者不應(yīng)答事件中仍一直需要更多治療。

傳統(tǒng)地，醫(yī)生所用的治療范例為開出產(chǎn)生對(duì)于治療疾病可能為最高成功率的第一線藥物治療。若第一治療無(wú)效，則開出替代的藥物治療。該范例顯然并非某些疾病的最佳治療方法。例如，在諸如癌癥的疾病中，第一治療通常是最重要的并提供成功治療的最佳時(shí)機(jī)，因此對(duì)于選擇將針對(duì)特定的患者疾病最有效的初始藥物存在著增高的需求。

預(yù)期今年在美國(guó)將有207,090例新增女性乳腺癌診斷，和39,840例女性乳腺癌相關(guān)死亡(americancancersociety：cancerfactsandfigures2010)。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療通常包括直接dna損傷劑例如蒽環(huán)類和烷化劑以及抗代謝物和抗微管劑。

在西方國(guó)家，卵巢癌是所有婦科癌癥中的首要死亡原因。該高死亡率歸因于大多數(shù)患者診斷于晚期。上皮性卵巢癌(eoc)占卵巢惡性腫瘤的90％，且被分為不同的組織學(xué)分類，包括漿液性亞型、粘液性亞型、子宮內(nèi)膜樣亞型、透明細(xì)胞亞型、過(guò)渡型亞型、混合型亞型和未分化型亞型。越來(lái)越多的證據(jù)表示這些不同的組織學(xué)源自不同的病因?qū)W。對(duì)于卵巢癌，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療是減瘤術(shù)(debulkingsurgery)和標(biāo)準(zhǔn)的基于鉑紫杉烷的細(xì)胞毒性化學(xué)治療。然而，并非所有患者都對(duì)其應(yīng)答，且在對(duì)其應(yīng)答的患者中約70％將會(huì)復(fù)發(fā)?；诮M織學(xué)或分子學(xué)分類對(duì)卵巢癌特異性的靶治療還未進(jìn)入市場(chǎng)。相似地，對(duì)于其他類型的癌癥，也仍無(wú)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性化學(xué)治療劑的準(zhǔn)確途徑。

微陣列和分子基因組學(xué)的出現(xiàn)具有顯著影響疾病的診斷能力和預(yù)后分類的潛力，其可能有助于預(yù)測(cè)個(gè)體患者對(duì)確定的治療方案的應(yīng)答。微陣列提供了對(duì)于大量遺傳信息的分析，從而提供了個(gè)體的基因指紋。滿載熱情地是，該技術(shù)將最終為定制藥物治療方案提供必要工具。

目前，醫(yī)療保健專業(yè)人員用來(lái)協(xié)助其鑒定將從化學(xué)治療劑受益的癌癥患者的機(jī)理還較少。因?yàn)闆]有方法來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)哪種藥物治療將對(duì)特定的癌癥生理學(xué)最為有效，鑒定最佳的第一線藥物是困難的。該缺陷導(dǎo)致了相對(duì)較差的單一劑應(yīng)答率和增高的癌癥發(fā)病率和死亡。并且，患者常經(jīng)歷不必要的無(wú)效的毒性藥物治療。

已使用了分子標(biāo)志物來(lái)選擇適當(dāng)?shù)闹委?，例如在乳腺癌中。不表達(dá)雌激素和孕酮激素受體以及her2生長(zhǎng)因子受體的乳腺腫瘤，稱作“三陰性”，其表現(xiàn)出對(duì)parp-1抑制劑治療應(yīng)答(linn,s.c.,和van'tveer,l.,j.eurjcancer45增刊1,11-26(2009)；o'shaughnessy,j.,等人.nengljmed364,205-214(2011))。最近研究表明乳腺腫瘤的三陰性狀況可能指示對(duì)包括parp-1抑制劑的聯(lián)合治療的應(yīng)答性，但可能不足以指示對(duì)單獨(dú)parp-1抑制劑的應(yīng)答性。(o'shaughnessy等人,2011)。

此外，還有其他研究已嘗試鑒定與分子亞型相關(guān)聯(lián)的基因分類器以指示化學(xué)治療劑的應(yīng)答性(farmer等人.natmed15,68-74(2009)；konstantinopoulos,p.a.,等人,jclinoncol28,3555-3561(2010))。然而，目前為止還不存在一種診斷試驗(yàn)，其應(yīng)用于所有癌癥疾病而準(zhǔn)確地確定表現(xiàn)dna損傷修復(fù)缺陷的分子亞型，還可應(yīng)用于所有疾病而預(yù)測(cè)對(duì)于直接或間接靶向dna損傷修復(fù)的任何藥物的敏感性。

因此需要一種試驗(yàn)，該試驗(yàn)足夠準(zhǔn)確地鑒定dna修復(fù)缺陷腫瘤以將患者分層為可能對(duì)損傷dna的化學(xué)治療劑應(yīng)答的和應(yīng)該接受替代治療的。

還需要的是應(yīng)用于所有不同癌癥類型的足夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性的分子亞型分類器。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及使用在癌癥中表達(dá)的一系列基因產(chǎn)物標(biāo)志物的方法，從而當(dāng)轉(zhuǎn)錄物中的一些或全部過(guò)表達(dá)或低表達(dá)時(shí)，其鑒定具有dna損傷修復(fù)缺陷的癌癥的亞型?？烧J(rèn)為對(duì)該亞型的指定是診斷試驗(yàn)，因?yàn)槠渑c任何特異性藥物無(wú)關(guān)，而是以具有用于篩查和選擇適當(dāng)?shù)陌┌Y治療的用途的方式描述癌癥的生物學(xué)。本發(fā)明還提供了指示對(duì)于dna損傷治療劑的應(yīng)答性或抗性的方法。在不同的方面，該基因或基因產(chǎn)物列表可成為單參數(shù)或多參數(shù)預(yù)測(cè)試驗(yàn)的基礎(chǔ)，所述試驗(yàn)可通過(guò)利用本領(lǐng)域中已知的方法例如微陣列、q-pcr、免疫組織化學(xué)、elisa或能夠定量mrna或蛋白表達(dá)的其他技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

此外，本文中所描述的生物途徑是癌癥自身的特征，與等級(jí)和階段相似，且從而不限于單一癌癥疾病類型。因此，一系列的基因或基因產(chǎn)物可在跨越不同組織中的不同癌癥類型用于預(yù)測(cè)癌癥治療的應(yīng)答性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些基因或基因產(chǎn)物用于評(píng)價(jià)乳腺癌腫瘤和卵巢癌腫瘤。

本文所描述的本發(fā)明不限于任何一種藥物；其可用于鑒定對(duì)于直接或間接影響dna損傷和/或dna損傷修復(fù)的一系列藥物中的任何的應(yīng)答者和非應(yīng)答者，所述藥物例如，新輔助治療基于5-氟尿嘧啶、蒽環(huán)類和環(huán)磷酰胺的新輔助治療方案，例如fec(5-氟尿嘧啶/表柔比星/環(huán)磷酰胺)和fac(5-氟尿嘧啶/阿霉素/環(huán)磷酰胺)。在特定的方面，本發(fā)明對(duì)于評(píng)估乳腺癌中的紫杉醇、氟尿嘧啶、多柔比星(阿霉素)和環(huán)磷酰胺(t/fac)新輔助治療是有用的。在其他方面，本發(fā)明對(duì)于評(píng)估卵巢癌中的鉑或鉑加紫杉醇治療是有用的。

本發(fā)明涉及利用不同分類的應(yīng)答例如總存活期、無(wú)進(jìn)展存活期、放射性應(yīng)答、如recist所定義的應(yīng)答、完全應(yīng)答、部分應(yīng)答、穩(wěn)定病情和血清學(xué)標(biāo)志物例如但不限于，psa、cea、ca125、ca15-3和ca19-9。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于評(píng)估單獨(dú)地利用fec或fac或利用標(biāo)準(zhǔn)治療環(huán)境中的fec或fac治療的乳腺癌中的病理完全應(yīng)答，或評(píng)估卵巢癌中的recist和血清ca125水平。

在另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)乳腺癌和卵巢癌中的dna損傷應(yīng)答缺陷(ddrd)分子亞型的鑒定。該分子亞型可通過(guò)使用一個(gè)長(zhǎng)度為40個(gè)基因和一個(gè)長(zhǎng)度為44個(gè)基因的兩個(gè)不同的基因分類器來(lái)檢測(cè)。ddrd分類器首次在almac乳腺疾病特異性陣列(almacbreastdiseasespecificarray(dsa^tm))上通過(guò)由53個(gè)探針集組成的分類器而確定。為驗(yàn)證該分類器在其預(yù)測(cè)對(duì)包含dna損傷的化學(xué)治療方案的應(yīng)答的能力的情況下的功能相關(guān)性，需要在基因水平上重新確定該分類器。利用來(lái)自在微陣列平臺(tái)而非almacbreastdsa^tm上總結(jié)的獨(dú)立的數(shù)據(jù)組的微陣列數(shù)據(jù)，這將協(xié)助ddrd分類器的評(píng)價(jià)。為協(xié)助在基因水平上確定分類器，需要確定almacbreastdsa^tm探針集所映射的基因。這包括對(duì)公眾可獲得的基因組瀏覽器數(shù)據(jù)庫(kù)例如ensembl和ncbireferencesequence的利用。僅提供了針對(duì)44-基因ddrd分類器模型的結(jié)果，因?yàn)樵撃Ｐ腿〈?0-基因ddrd分類器模型的結(jié)果。這些結(jié)果表明分類器模型是對(duì)含dna損傷治療的化學(xué)治療方案的應(yīng)答的有效且重要的預(yù)測(cè)器。

通過(guò)40-基因分類器模型和44-基因分類器模型兩者對(duì)亞型的鑒定可用來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)包括dna損傷誘導(dǎo)劑和dna修復(fù)靶向治療的標(biāo)準(zhǔn)乳腺癌和卵巢癌治療藥物種類的應(yīng)答，并選擇適于其的患者。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于以上所列的例如qpcr、微陣列和免疫測(cè)定例如免疫組織化學(xué)、elisa、蛋白質(zhì)印跡等常規(guī)診斷應(yīng)用的試劑盒。所述試劑盒包括測(cè)定基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)和定量mrna或蛋白表達(dá)的的適當(dāng)?shù)脑噭┖驼f(shuō)明書。

本發(fā)明還提供了用于鑒定dna損傷應(yīng)答缺陷的(ddrd)人類腫瘤的方法。很可能地是本發(fā)明可用于鑒定對(duì)直接損傷dna、間接損傷dna或抑制正常dna損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或修復(fù)過(guò)程的藥物敏感和應(yīng)答的或抵抗和不應(yīng)答的患者。

本發(fā)明還涉及指導(dǎo)患者的常規(guī)治療。本發(fā)明還涉及選擇適于臨床試驗(yàn)的患者，所述臨床試驗(yàn)中新型藥物為直接或間接影響dna損傷和/或dna損傷修復(fù)的種類。

本發(fā)明和方法使所保存的福爾馬林固定石蠟包埋(ffpe)活檢物質(zhì)以及新鮮/冷凍(ff)組織適用于本發(fā)明中對(duì)所有轉(zhuǎn)錄物的測(cè)定，且因此與最普遍地可獲得的活檢組織物質(zhì)的類型是相容的。表達(dá)水平可利用獲自ffpe組織、新鮮冷凍組織或貯存于諸如的溶液中的新鮮組織的rna來(lái)確定。

附圖簡(jiǎn)述

圖1提供了代表er-陰性(a)和er-陽(yáng)性(b)brca1/2突變體和散發(fā)性野生型對(duì)照乳腺樣品的層級(jí)分析的圖。每幅圖的右側(cè)標(biāo)注了探針集聚類組，左側(cè)標(biāo)注了每個(gè)探針集聚類組的通路分析。每幅圖的圖例指示了樣品的突變狀況，且每個(gè)樣品分配了標(biāo)簽組以用于分類器生成。

圖2提供了在對(duì)于(a)組合樣品集，(b)er-陰性樣品集和(c)er-陽(yáng)性樣品集的5倍交叉驗(yàn)證的10次重復(fù)下比較每個(gè)分類模型的auc性能的箱形圖的圖。(d)交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)的敏感性加特異性曲線圖用來(lái)選擇閾值。最大敏感性加特異性是1.682，同時(shí)相應(yīng)的標(biāo)簽得分為～0.37。

圖3提供了利用44-基因分類器模型，通過(guò)交叉驗(yàn)證所評(píng)估的，關(guān)于預(yù)測(cè)brca狀況的分類性能的roc曲線的圖。應(yīng)用分類器模型后auc為～0.68。已由自助法(bootstrap)以1000次迭代評(píng)估了95％置信界限。

圖4提供了在三個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集fec、fac1和fac2(bonnefoi等人,2007；iwamoto等人,jnatlcancerinst103,264-272(2011)；lee,j.k.,等人clincancerres16,711-718(2010))的組合分析中44-基因分類器模型關(guān)于預(yù)測(cè)對(duì)基于蒽環(huán)類的化學(xué)治療的應(yīng)答的分類性能的roc曲線的圖。應(yīng)用分類器模型后auc為～0.78。已由自助法以1000次迭代評(píng)估了95％置信界限。

圖5提供了在三個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集(hess等人,jclinoncol24,4236-4244(2006)；lee等人,2010；tabchy,a.,等人clincancerres16,5351-5361(2010))的組合分析中44-基因分類器模型在t/fac處理的樣品中的應(yīng)答中的分類性能的roc曲線的圖。各自應(yīng)用分類器模型后auc為～0.61。已由自助法以1000次迭代確定了95％置信界限。

圖6提供了259個(gè)漿液卵巢癌樣品中44-基因分類器模型在來(lái)自內(nèi)部almac診斷卵巢數(shù)據(jù)集的鉑和紫杉醇處理的樣品中的應(yīng)答中的分類性能的roc曲線的圖。應(yīng)用分類器模型后auc為～0.68。已由自助法以1000次迭代評(píng)估了95％置信界限。

圖7提供了在取自健康供者和具有范可尼貧血(fanconianaemia)突變的患者的骨髓樣品中44-基因ddrd分類器得分的直方圖。應(yīng)用分類器模型后auc為0.90。已由自助法以1000次迭代評(píng)估了95％置信界限。

圖8提供了將44-基因分類器模型與brca1突變體細(xì)胞系和野生型細(xì)胞系中的治療應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的圖。(a)蛋白質(zhì)印跡分析確定與hcc1937-ev細(xì)胞相比較hcc1937-br細(xì)胞中的brca1的表達(dá)增高。(b)僅轉(zhuǎn)染對(duì)照載體的hcc1937(hcc1937-ev)細(xì)胞系和具有恢復(fù)的brca1的外源性表達(dá)的hcc1937(hcc1937-br)細(xì)胞系中的平均44-基因模型(ddrd)分類器得分(±sem)。持續(xù)暴露于一系列濃度的parp抑制劑ku0058948(c)和順鉑(d)下的hcc1937親代細(xì)胞和hcc1937-br細(xì)胞的細(xì)胞存活力的直方圖。

發(fā)明詳述

除非另外定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。雖然與本文所描述的相似或等同的任何方法、裝置和物質(zhì)可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，本文描述了優(yōu)選的方法、裝置和物質(zhì)。

本申請(qǐng)中所引用的所有出版物、公布的專利文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)顯示了本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。本文所引用的所有出版物、公布的專利文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用并入，如同特定地和單獨(dú)地標(biāo)明了每個(gè)單獨(dú)的出版物、公布的專利文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用并入。

本文所用的冠詞“一個(gè)(a)”和“一種(an)”指一個(gè)或一個(gè)以上(即，至少一個(gè))語(yǔ)法上的冠詞的賓語(yǔ)。例如，除非明確地指明相反的，“一個(gè)要素”意為一個(gè)要素或一個(gè)以上要素。

目前癌癥研究的主要目標(biāo)是通過(guò)將分子參數(shù)結(jié)合到臨床治療決策中而提高患者手術(shù)期間系統(tǒng)治療的效力。藥物遺傳學(xué)/基因組學(xué)是對(duì)參與個(gè)體對(duì)外來(lái)化合物或藥物的應(yīng)答的遺傳因子/基因組因子的研究。可將對(duì)本發(fā)明的標(biāo)志物的表達(dá)具有刺激作用或抑制作用的試劑或調(diào)節(jié)劑施用于個(gè)體以在患者中(預(yù)防性或治療性)治療癌癥。理想地是還將個(gè)體的藥物基因組學(xué)與所述治療聯(lián)合考慮。治療的代謝的差異通過(guò)改變藥理活性藥物的劑量和血液濃度之間的關(guān)系可能導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性或治療失敗。因此，了解個(gè)體的藥物基因組學(xué)允許選擇對(duì)于預(yù)防性治療或治療性治療有效的試劑(例如，藥物)。所述藥物基因組學(xué)還可用來(lái)確定適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨浮Ｒ虼耍稍趥€(gè)體中確定本發(fā)明的標(biāo)志物的表達(dá)水平，從而選擇適于個(gè)體的治療性治療或預(yù)防性治療的試劑。

本發(fā)明涉及在癌癥組織中表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物標(biāo)志物(本文以下稱作“生物標(biāo)志物”)的獨(dú)特的集合。在不同的方面，生物標(biāo)志物列表可形成單參數(shù)預(yù)測(cè)試驗(yàn)或多參數(shù)預(yù)測(cè)試驗(yàn)的基礎(chǔ)，所述試驗(yàn)可利用本領(lǐng)域中已知的方法例如微陣列、q-pcr、免疫組織化學(xué)、elisa或其他可定量mrna或蛋白表達(dá)的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明還涉及用于細(xì)胞毒性化學(xué)治療后的預(yù)后或選擇癌癥的特定治療的試劑盒和方法。提供該方法從而當(dāng)轉(zhuǎn)錄物的一些或全部過(guò)表達(dá)或低表達(dá)時(shí)，表達(dá)譜指示了對(duì)dna損傷治療劑的應(yīng)答性或抗性。這些試劑盒和方法使用了在患有癌癥的患者的腫瘤中差異表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物標(biāo)志物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或關(guān)聯(lián)模型下，將所保存的組織樣品中的這些生物標(biāo)志物的表達(dá)譜與臨床結(jié)果(應(yīng)答或存活)相關(guān)聯(lián)以產(chǎn)生將表達(dá)譜與對(duì)一種或多種dna損傷治療劑的應(yīng)答性相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)或模型。然后可將預(yù)測(cè)模型用于在其對(duì)dna損傷治療劑的應(yīng)答性未知的患者中預(yù)測(cè)應(yīng)答性。在許多其他的實(shí)施方案中，可基于患者的臨床結(jié)果、預(yù)后或?qū)na損傷治療劑的應(yīng)答性將患者群分為至少兩類，且生物標(biāo)志物與患者的這些種類之間的種類差異大體上相關(guān)聯(lián)。本文所描述的生物途徑是癌癥疾病所共有的，與等級(jí)和階段相似，且因此分類器和方法不限于單一癌癥疾病類型。

預(yù)測(cè)性標(biāo)志物套組/表達(dá)分類器

提供了用于確定對(duì)用于治療癌癥的治療劑例如dna損傷治療劑的應(yīng)答性或抗性的在癌癥組織中作為遺傳分類器表達(dá)的生物標(biāo)志物的獨(dú)特的集合。所述集合可稱為“標(biāo)志物套組”、“表達(dá)分類器”或“分類器”。

表1中鑒定出在本方法中有用的生物標(biāo)志物。這些標(biāo)志物被鑒定為對(duì)確定患者對(duì)于治療劑應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答具有預(yù)測(cè)價(jià)值。其表達(dá)與對(duì)試劑的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，且更具體地為dna損傷治療劑。通過(guò)檢查已鑒定的生物標(biāo)志物的集合在腫瘤中的表達(dá)，可能地是確定哪種治療劑或試劑的組合將最可能地降低癌癥(并且在一些實(shí)施方案中為乳腺癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)速率。通過(guò)檢查已鑒定的轉(zhuǎn)錄物基因或基因產(chǎn)物標(biāo)志物的集合，還可能地是確定哪種治療劑或試劑的組合將最少可能地降低癌癥的生長(zhǎng)速率。通過(guò)檢查生物標(biāo)志物的集合的表達(dá)，從而可能去除無(wú)效的或不適當(dāng)?shù)闹委焺?。重要地是，在某些?shí)施方案中，這些決策可根據(jù)不同的患者為基礎(chǔ)或根據(jù)不同的試劑為基礎(chǔ)來(lái)制定。因此，可確定特定的治療方案是否可能使特定的患者或患者類型受益，和/或特定的方案是否應(yīng)該繼續(xù)。

表1a

表1b

表1中所列的生物標(biāo)志物的全部或部分可用于預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物套組。例如，選自表1中的生物標(biāo)志物的生物標(biāo)志物套組可利用本文中所提供的方法來(lái)生成，且可包括表1中所列出的生物標(biāo)志物之一至所有生物標(biāo)志物，包括一切組合(例如，4個(gè)選擇的生物標(biāo)志物、16個(gè)選擇的生物標(biāo)志物、74個(gè)選擇的生物標(biāo)志物等)。在一些實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物集包括至少5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、40個(gè)、60個(gè)、100個(gè)、150個(gè)、200個(gè)或300個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)志物。在其他的實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)標(biāo)志物集包括不超過(guò)5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、40個(gè)、60個(gè)、100個(gè)、150個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、500個(gè)、600個(gè)或700個(gè)生物標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物集包括表1中所列的多個(gè)生物標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物集包括表1中所列的生物標(biāo)志物的至少約1％、約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％。選擇的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物集可利用本文所描述的方法和本領(lǐng)域中已知的類似的方法由所提供的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物而匯集。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物套組包含表1中的全部203個(gè)生物標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物套組包含表1或2中的40或44個(gè)生物標(biāo)志物。

預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物集可與不同量值的實(shí)際標(biāo)度的相應(yīng)標(biāo)量權(quán)重結(jié)合來(lái)確定，通過(guò)線性或非線性的、代數(shù)的、三角學(xué)的或相關(guān)的方法經(jīng)由代數(shù)算法、統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)算法、貝葉斯算法、回歸算法或相似的算法將其進(jìn)一步結(jié)合為單一標(biāo)量值，連同標(biāo)量值的數(shù)學(xué)推導(dǎo)的決策函數(shù)一起提供了預(yù)測(cè)模型，來(lái)自樣品的表達(dá)譜通過(guò)所述預(yù)測(cè)模型可被解析為對(duì)于特定的藥物或藥物種類應(yīng)答者或非應(yīng)答者、抵抗或非抵抗的分離的種類。包括生物標(biāo)志物成員的所述預(yù)測(cè)模型，來(lái)自具有已知藥物應(yīng)答和/或抵抗的既往患者樣品的一組代表性表達(dá)譜，在交叉驗(yàn)證、自助法或相似的取樣技術(shù)下，通過(guò)學(xué)習(xí)權(quán)重和決策閾值而開發(fā)，對(duì)敏感性、特異性、陰性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、危害比或其任何組合進(jìn)行優(yōu)化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物用于形成其信號(hào)的加權(quán)和，其中單獨(dú)的權(quán)重可以是正的或負(fù)的。將所得的和(“決策函數(shù)”)與預(yù)定的參考點(diǎn)或值相比較。與參考點(diǎn)或值的比較可用于診斷或預(yù)測(cè)臨床病癥或結(jié)果。

如以上所描述的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，表1中所提供的包括于分類器中的標(biāo)志物在對(duì)治療劑的應(yīng)答性或抗性的分類器中將具有不等權(quán)重。因此，雖然可僅用一個(gè)序列來(lái)診斷或預(yù)測(cè)結(jié)果例如對(duì)于治療劑的應(yīng)答性，利用更多序列可增高特異性和敏感性或診斷或預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“權(quán)重”指統(tǒng)計(jì)計(jì)算中項(xiàng)目的相對(duì)重要性。每種生物標(biāo)志物在基因表達(dá)分類器中的權(quán)重可利用本領(lǐng)域中已知的分析方法根據(jù)患者樣品的數(shù)據(jù)集來(lái)確定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物套組涉及表2a中詳列的40個(gè)生物標(biāo)志物，相應(yīng)的排序和權(quán)重詳列于表中，或可選的排序和加權(quán)取決于，例如，疾病情況。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物套組涉及表2b中詳列的44個(gè)生物標(biāo)志物，相應(yīng)的排序和權(quán)重詳列于表中，或可選的排序和加權(quán)取決于，例如，疾病情況。表2a和2b將生物標(biāo)志物按在分類器中降低的權(quán)重而排序，確定為在交叉驗(yàn)證下測(cè)量的綜合決策得分函數(shù)中的平均權(quán)重的排序。表2c呈現(xiàn)了代表表2a和2b中的基因的根據(jù)其序列id編號(hào)的探針集。表2d代表陣列上呈現(xiàn)的關(guān)于標(biāo)簽中的基因的反義探針序列。

表2a

40-基因ddrd分類器模型的具有相關(guān)排序和加權(quán)的gene編號(hào)和entrezgene編號(hào)

表2b

44-基因ddrd分類器模型的具有相關(guān)排序和加權(quán)的gene編號(hào)和entrezgene編號(hào)

表2c

40-基因標(biāo)簽和44-基因標(biāo)簽中所含的基因的探針集編號(hào)和seq編號(hào)

表2d

40-基因標(biāo)簽中的反義探針集的almac編號(hào)和almac基因符號(hào)和seqid編號(hào)

在不同的實(shí)施方案中，表2a和表2b中所列的生物標(biāo)志物的子集可用于本文所描述的方法中。這些子集包括但不限于在表2a或表2b中排序?yàn)?-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-44、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、36-44、11-20、21-30、31-40和31-44的生物標(biāo)志物。在一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物gbp5、cxcl10、ido1和mx1中的至少一種，且至少n種另外的生物標(biāo)志物選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物”可指基因、mrna、cdna、反義轉(zhuǎn)錄物、mirna、多肽、蛋白、蛋白片段或指示基因表達(dá)水平或蛋白產(chǎn)生水平的任何其他核酸序列或多肽序列。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)提到生物標(biāo)志物cxcl10、ido1、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4、apol3、cdr1、fyb、tspan7、rac2、klhdc7b、grb14、ac138128.1、kif26a、cd274、etv7、mfap5、olfm4、pi15、fosb、fam19a5、nlrc5、prickle1、egr1、cldn10、adamts4、sp140l、anxa1、rsad2、esr1、ikzf3、or2i1p、egfr、nat1、lats2、cyp2b6、ptprc、ppp1r1a或al137218.1時(shí)，所述生物標(biāo)志物分別地包括cxcl10、ido1、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4、apol3、cdr1、fyb、tspan7、rac2、klhdc7b、grb14、ac138128.1、kif26a、cd274、etv7、mfap5、olfm4、pi15、fosb、fam19a5、nlrc5、prickle1、egr1、cldn10、adamts4、sp140l、anxa1、rsad2、esr1、ikzf3、or2i1p、egfr、nat1、lats2、cyp2b6、ptprc、ppp1r1a或al137218.1的mrna。在另外的或其他的實(shí)施方案中，當(dāng)提到生物標(biāo)志物mx1、gbp5、ifi44l、birc3、igj、iqgap3、loc100294459、six1、slc9a3r1、stat1、tob1、ubd、c1qc、c2orf14、epsti、galnt6、hist1h4h、hist2h4b、kiaa1244、loc100287927、loc100291682或loc100293679時(shí)，所述生物標(biāo)志物分別地包括mx1、ifi44l、gbp5、birc3、igj、iqgap3、loc100294459、six1、slc9a3r1、stat1、tob1、ubd、c1qc、c2orf14、epsti、galnt6、hist1h4h、hist2h4b、kiaa1244、loc100287927、loc100291682或loc100293679的反義轉(zhuǎn)錄物。

在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物gbp5、cxcl10、ido1和mx1，和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物gbp5和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物cxcl10和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物ido1和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物mx-1和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。

在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物cxcl10、mx1、ido1和ifi44l中的至少兩種和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物cxcl10、mx1、ido1和ifi44l和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物cxcl10和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物mx1和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物ido1和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在另一方面，在個(gè)體中預(yù)測(cè)治療應(yīng)答性或指示癌癥診斷通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行：在來(lái)自個(gè)體的生物樣品上進(jìn)行測(cè)定并檢測(cè)生物標(biāo)志物值，每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物ifi44l和選自表2b中的生物標(biāo)志物的列表的至少n種另外的生物標(biāo)志物其中之一，其中n等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。

在其他的實(shí)施方案中，表2c中所列的探針(sedidno:83-202)或其子集，可用于本文所描述的方法中。這些子集包括但不限于對(duì)應(yīng)于gbp5、cxcl10、ido1、mx1、if144l、cd2、prame、itgal、lrp4和apol3中的一個(gè)或多個(gè)的seqidno的子集。在其他的實(shí)施方案中，探針對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物cxcl10、mx1、ido1、if144l、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4、apol3、cdr1、fyb、tspan7、rac2、klhdc7b、grb14、ac138128.1、kif26a、cd274、cd109、etv7、mfap5、olfm4、pi15、fosb、fam19a5、nlrc5、prickle1、egr1、cldn10、adamts4、sp140l、anxa1、rsad2、esr1、ikzf3、or2l1p、egfr、nat1、lats2、cyp2b6、ptprc、ppp1r1a和al137218.1的全部。應(yīng)理解的是每個(gè)子集可包括針對(duì)相同生物標(biāo)志物的多個(gè)探針。例如，seqidno:135、140、142和195所代表的探針均針對(duì)gbp5。因此，包含針對(duì)或?qū)?yīng)gbp5的探針的子集包括seqidno:135、140、142和195中的一個(gè)或多個(gè)。包含針對(duì)或?qū)?yīng)cxcl10的探針的子集包括seqidno:131和160中的一個(gè)或多個(gè)。

利用分類器模型測(cè)量基因表達(dá)

已使用多種方法試圖鑒定生物標(biāo)志物和診斷疾病。對(duì)于基于蛋白的標(biāo)志物，這些方法包括雙向電泳、質(zhì)譜測(cè)定法和免疫測(cè)定方法。對(duì)于核酸標(biāo)志物，這些方法包括mrna表達(dá)譜、微小rna譜、fish、基因表達(dá)系列分析(sage)、甲基化譜和大型基因表達(dá)陣列。

當(dāng)生物標(biāo)志物在個(gè)體中指示異常進(jìn)程、疾病或其他病癥或作為異常進(jìn)程、疾病或其他病癥的標(biāo)志時(shí)，該生物標(biāo)志物與在個(gè)體中指示正常進(jìn)程、無(wú)疾病或其他病癥或作為正常進(jìn)程、無(wú)疾病或其他病癥的標(biāo)志的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或值相比較，通常被描述為過(guò)表達(dá)的或低表達(dá)的?！吧险{(diào)”、“上調(diào)的”、“過(guò)表達(dá)”、“過(guò)表達(dá)的”和其任何變化形式互換地用來(lái)指大于在健康或正常個(gè)體中通常檢測(cè)到的生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標(biāo)志物的值或水平。該術(shù)語(yǔ)還可指大于在特定疾病的不同階段可檢測(cè)到的生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標(biāo)志物的值或水平。

“下調(diào)”、“下調(diào)的”、“低表達(dá)”、“低表達(dá)的”和其任何變化形式互換地用來(lái)指小于在健康或正常個(gè)體中通常檢測(cè)到的生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標(biāo)志物的值或水平。該術(shù)語(yǔ)還可指小于在特定疾病的不同階段可檢測(cè)到的生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標(biāo)志物的值或水平。

此外，與在個(gè)體中指示正常進(jìn)程或無(wú)疾病或其他病癥或作為正常進(jìn)程或無(wú)疾病或其他病癥的標(biāo)記的生物標(biāo)志物的“正常”表達(dá)水平或值相比較，過(guò)表達(dá)的或低表達(dá)的生物標(biāo)志物還可稱作“差異表達(dá)的”或稱作具有“差異水平”或“差異值”。因此，生物標(biāo)志物的“差異表達(dá)”還可稱作生物標(biāo)志物的“正?！北磉_(dá)水平的變化形式。

術(shù)語(yǔ)“差異生物標(biāo)志物表達(dá)”和“差異表達(dá)”互換地用來(lái)指相對(duì)于其在正常對(duì)象中的表達(dá)，或相對(duì)于其在對(duì)特定治療不同地應(yīng)答的或具有不同的預(yù)后的患者中的表達(dá)，其表達(dá)在患有特定疾病的對(duì)象中被激活為較高或較低水平的生物標(biāo)志物。該術(shù)語(yǔ)還包括其表達(dá)在相同的疾病的不同的階段被激活為較高或較低水平的生物標(biāo)志物。還要理解的是差異表達(dá)生物標(biāo)志物可在核酸水平或蛋白水平上被激活或被抑制，或可經(jīng)受選擇性剪接以產(chǎn)生不同的多肽產(chǎn)物。這種差異可通過(guò)包括mrna水平、微小rna水平、反義轉(zhuǎn)錄物水平或蛋白表面表達(dá)、分泌或多肽的其他劃分的多種改變來(lái)證實(shí)。差異生物標(biāo)志物表達(dá)可包括兩個(gè)或更多個(gè)基因之間或其基因產(chǎn)物之間的表達(dá)的比較；或兩個(gè)或更多個(gè)基因之間或其基因產(chǎn)物之間的表達(dá)的比率的比較；或甚至相同基因的兩個(gè)不同加工的產(chǎn)物的比較，其在正常對(duì)象和患病對(duì)象之間是不同的；或在相同疾病的不同階段是不同的。差異表達(dá)包括例如在正常細(xì)胞和病態(tài)細(xì)胞之間或在經(jīng)歷不同的疾病事件或疾病階段的細(xì)胞之間，在生物標(biāo)志物中瞬時(shí)表達(dá)模式或細(xì)胞表達(dá)模式中的定量和定性的差異。

在某些實(shí)施方案中，所獲得的表達(dá)譜是基因組或核酸表達(dá)譜，其中樣品中的一種或多種核酸的量或水平是確定的。在這些實(shí)施方案中，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定以生成診斷或預(yù)后方法中所用的表達(dá)譜的樣品是核酸樣品。核酸樣品包括含待分析的細(xì)胞或組織的表型決定生物標(biāo)志物的表達(dá)信息的核酸的群體。在一些實(shí)施方案中，核酸可包括rna或dna核酸，例如，mrna、crna、cdna等，條件是樣品保留了獲得其的宿主細(xì)胞或組織的表達(dá)信息。樣品可以本領(lǐng)域中已知的多種不同的方法來(lái)制備，例如，通過(guò)從細(xì)胞分離mrna，如差異基因表達(dá)領(lǐng)域所已知的，其中分離的mrna作為分離的、擴(kuò)增的來(lái)使用，或用來(lái)制備cdna、crna等。因此，確定樣品中的mrna的水平包括從mrna制備cdna或crna，且然后測(cè)量cdna或crna。通常利用標(biāo)準(zhǔn)方案從由需要治療的對(duì)象中收獲的細(xì)胞或組織來(lái)制備樣品，其中可由其產(chǎn)生所述核酸的細(xì)胞類型或組織包括其中待確定的表型的表達(dá)類型存在的任何組織，包括但不限于，病態(tài)的細(xì)胞或組織、體液等。

可利用任何常規(guī)方案從初始核酸樣品中生成表達(dá)譜。雖然生成表達(dá)譜的多種不同的方式是已知的，例如在差異基因表達(dá)/生物標(biāo)志物分析領(lǐng)域中所使用的那些，生成表達(dá)譜的一個(gè)代表性的和方便的類型的方案是基于陣列的基因表達(dá)譜生成方案。該應(yīng)用是雜交測(cè)定，其中使用了關(guān)于在待生成的譜中待測(cè)定/譜分析的每個(gè)基因表現(xiàn)為“探針”核酸的核酸。在這些測(cè)定中，首先從待測(cè)定的初始核酸樣品中制備靶核酸的樣品，其中制備可包括用標(biāo)記物標(biāo)記靶核酸，所述標(biāo)記物例如，信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。制備靶核酸樣品后，在雜交條件下將樣品與陣列相接觸，從而在與附著于陣列表面的探針序列互補(bǔ)的靶核酸之間形成復(fù)合物。然后定性地或定量地檢測(cè)雜交復(fù)合物的存在?？蓪?shí)踐以生成主題方法中所使用的表達(dá)譜的特定的雜交技術(shù)包括以下中所描述的技術(shù)：美國(guó)專利第5,143,854號(hào)、第5,288,644號(hào)、第5,324,633號(hào)、第5,432,049號(hào)、第5,470,710號(hào)、第5,492,806號(hào)、第5,503,980號(hào)、第5,510,270號(hào)、第5,525,464號(hào)、第5,547,839號(hào)、第5,580,732號(hào)、第5,661,028號(hào)、第5,800,992號(hào)；其公開內(nèi)容在此通過(guò)引用并入；以及wo95/21265、wo96/31622、wo97/10365、wo97/27317、ep373203和ep785280。在這些方法中，將包括針對(duì)其表達(dá)待測(cè)定的每個(gè)生物標(biāo)志物的探針的“探針”核酸的陣列與以上所描述的靶核酸相接觸。接觸在雜交條件下進(jìn)行，例如，以上所描述的嚴(yán)格雜交條件，然后除去未結(jié)合的核酸。所得的雜交核酸的類型提供了關(guān)于已被探針雜交的每個(gè)生物標(biāo)志物的表達(dá)的信息，其中表達(dá)信息以基因是否被表達(dá)的方式來(lái)呈現(xiàn)，且通常地以在何種水平被表達(dá)來(lái)呈現(xiàn)，其中表達(dá)數(shù)據(jù)，即，表達(dá)譜可以是定性的和定量的。

構(gòu)建生物標(biāo)志物表達(dá)分類器

在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量癌癥組織中的生物標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)水平以生成基因表達(dá)譜。將來(lái)自患者組織樣品的一組生物標(biāo)志物的基因表達(dá)譜以綜合決策得分的形式進(jìn)行總結(jié)并與從患者數(shù)據(jù)的訓(xùn)練集中數(shù)學(xué)推導(dǎo)的得分閾值相比較。得分閾值根據(jù)不同的特征將患者組分開，所述特征例如但不限于，對(duì)治療的應(yīng)答性/非應(yīng)答性?；颊哂?xùn)練集數(shù)據(jù)優(yōu)選地來(lái)源于已由預(yù)后、復(fù)發(fā)可能性、長(zhǎng)期存活、臨床結(jié)果、治療應(yīng)答、診斷、癌癥分類或個(gè)體化的基因組譜表征的癌癥組織樣品?？蓪?lái)自患者樣品的表達(dá)譜和相應(yīng)的決策得分與位于數(shù)學(xué)推導(dǎo)的得分決策閾值的同側(cè)的訓(xùn)練集中的患者樣品的特征相關(guān)聯(lián)。優(yōu)化線性分類器標(biāo)量輸出的閾值以使如在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中所觀察到的交叉驗(yàn)證下敏感性與特異性的和最大化。

利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對(duì)給定樣品的整體表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以校正起始物質(zhì)的不同的量、提取和擴(kuò)增反應(yīng)的不同的效率等。利用基于標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的線性分類器來(lái)有效地生成診斷或預(yù)后響應(yīng)(例如，對(duì)于治療劑的應(yīng)答性或抗性)意為通過(guò)分離超平面的方式將數(shù)據(jù)空間，即，分類器中全部基因的表達(dá)值的所有可能的組合，分割為分開的兩半。該分割基于一大組訓(xùn)練實(shí)例憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)獲得，所述訓(xùn)練實(shí)例例如來(lái)自對(duì)治療劑表現(xiàn)出應(yīng)答性或抗性的患者。不失一般性地，對(duì)于除一個(gè)生物標(biāo)志物以外的全部生物標(biāo)志物可假定某個(gè)固定組的值，其將自動(dòng)地確定關(guān)于該剩余生物標(biāo)志物的閾值，其中決策將變?yōu)?，例如，?duì)治療劑的應(yīng)答性或抗性。然后高于該動(dòng)態(tài)閾值的表達(dá)值將指示抗性(對(duì)于具有負(fù)權(quán)的生物標(biāo)志物)或應(yīng)答性(對(duì)于具有正權(quán)的生物標(biāo)志物)。該閾值的精確值取決于分類器中的所有其他生物標(biāo)志物的實(shí)際測(cè)量的表達(dá)譜，但某些生物標(biāo)志物的通用指示仍然是固定的，即，高的值或“相對(duì)過(guò)表達(dá)”常有助于應(yīng)答性(具有正權(quán)的基因)或抗性(具有負(fù)權(quán)的基因)。因此，在整體基因表達(dá)分類器的情況下，相對(duì)表達(dá)可指示某生物標(biāo)志物的上調(diào)或下調(diào)是否代表對(duì)治療劑的應(yīng)答性或抗性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)線性分類器評(píng)價(jià)患者組織樣品的生物標(biāo)志物表達(dá)譜。如本文所用的，線性分類器指單獨(dú)的生物標(biāo)志物強(qiáng)度加權(quán)總和為綜合決策得分(“決策函數(shù)”)。然后將該決策得分與預(yù)定的截?cái)嗟梅珠撝迪啾容^，該閾值對(duì)應(yīng)于按敏感性和特異性方式的某設(shè)定點(diǎn)，該設(shè)定點(diǎn)指示是否樣品高于得分閾值(決策函數(shù)為正)或低于得分閾值(決策函數(shù)為負(fù))。

事實(shí)上，這意味著數(shù)據(jù)空間，即，生物標(biāo)志物表達(dá)值的所有可能的組合的集合，被分割為對(duì)應(yīng)于不同的臨床種類或預(yù)測(cè)的互斥的兩半，例如，一個(gè)對(duì)應(yīng)于對(duì)治療劑的應(yīng)答性和另一個(gè)對(duì)應(yīng)于抗性。在整體分類器的情況下，某些生物標(biāo)志物的相對(duì)過(guò)表達(dá)可增高決策得分(正權(quán))或降低決策得分(負(fù)權(quán))，且因此有助于整體決策，例如，對(duì)治療劑的應(yīng)答性或抗性。

術(shù)語(yǔ)“曲線下面積”或“auc”指受試者工作特征(roc)曲線的曲線下面積，二者是領(lǐng)域中熟知的。auc測(cè)量對(duì)于跨全部數(shù)據(jù)范圍比較分類器的準(zhǔn)確度是有用的。具有較高auc的分類器具有在兩個(gè)目標(biāo)組(例如，卵巢癌樣品和正常樣品或?qū)φ諛悠?之間進(jìn)行正確分類未知的更高的能力。roc曲線對(duì)于在兩個(gè)群體(例如，對(duì)治療劑應(yīng)答和非應(yīng)答的個(gè)體)之間進(jìn)行區(qū)別時(shí)描繪特定特征(例如，本文所描述的任何生物標(biāo)志物和/或另外的生物醫(yī)學(xué)信息的任何條目)的性能是有用的。通常，以單個(gè)特征的值為基礎(chǔ)以升序順序跨越整個(gè)群體(例如，病例和對(duì)照)選出特征數(shù)據(jù)。然后，對(duì)于該特征的每個(gè)值，計(jì)算數(shù)據(jù)的真陽(yáng)性和假陽(yáng)性率。真陽(yáng)性率通過(guò)計(jì)數(shù)高于該特征的值的病例的數(shù)目并除以病例總數(shù)而確定。假陽(yáng)性率通過(guò)計(jì)數(shù)高于該特征的值的對(duì)照的數(shù)目并除以對(duì)照總數(shù)而確定。雖然該定義指與對(duì)照相比較在病例中特征是增高的情況，該定義還應(yīng)用于與對(duì)照相比較在病例中特征較低的情況(在該情況中，將計(jì)數(shù)低于該特征的值的樣品)。roc曲線可關(guān)于單獨(dú)特征來(lái)生成，且可關(guān)于其他單獨(dú)輸出來(lái)生成，例如，兩個(gè)或更多個(gè)特征的組合可用數(shù)學(xué)方法結(jié)合(例如，相加、相減、相乘等)以提供單獨(dú)的總和值，且該單獨(dú)的總和值可繪制于roc曲線中。另外，其中的組合源自單獨(dú)的輸出值的多個(gè)特征的任意組合可繪制于roc曲線中。特征的這些組合可包括試驗(yàn)。roc曲線是試驗(yàn)的真陽(yáng)性率(敏感性)針對(duì)試驗(yàn)的假陽(yáng)性率(1-特異性)的圖。

對(duì)于該量，即，對(duì)治療劑的截?cái)嚅撝祽?yīng)答性或抗性，其解釋在發(fā)展期(“訓(xùn)練”)源自一組具有已知結(jié)果的患者。決策得分的相應(yīng)加權(quán)和應(yīng)答性/抗性截?cái)嚅撝凳枪潭ǖ模ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)自訓(xùn)練數(shù)據(jù)的先驗(yàn)。在本方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用偏最小二乘法判別分析(pls-da)來(lái)確定加權(quán)。(l.s.wold,j.chemom.1(1987)185-196；d.v.nguyen,d.m.rocke,bioinformatics18(2002)39-50)。當(dāng)應(yīng)用于癌癥分類器的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于進(jìn)行分類的其他方法也可與本文所描述的方法聯(lián)合。

可使用不同的方法將在這些生物標(biāo)志物基礎(chǔ)上測(cè)量的定量的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為預(yù)后或其他預(yù)測(cè)用途。這些方法包括，但不限于來(lái)自模式識(shí)別的領(lǐng)域的方法(duda等人patternclassification,第二版,johnwiley,newyork2001)，機(jī)器學(xué)習(xí)(等人learningwithkernels,mitpress,cambridge2002,bishop,neuralnetworksforpatternrecognition,clarendonpress,oxford1995)，統(tǒng)計(jì)學(xué)(hastie等人theelementsofstatisticallearning,springer,newyork2001)，生物信息學(xué)(dudoit等人,2002,j.am.statist.assoc.97:77-87,tibshirani等人,2002,proc.natl.acad.sci.usa99:6567-6572)或化學(xué)計(jì)量學(xué)(vandeginste,等人,handbookofchemometricsandqualimetrics,b部分,elsevier,amsterdam1998)。

在訓(xùn)練步驟中，關(guān)于應(yīng)答性/抗性病例兩者測(cè)量了一組患者樣品，并利用來(lái)自該訓(xùn)練數(shù)據(jù)的固有信息優(yōu)化了預(yù)測(cè)方法，以最佳地預(yù)測(cè)訓(xùn)練集或未來(lái)的樣品集。在該訓(xùn)練步驟中，訓(xùn)練了所用的方法或使所用方法參數(shù)化以由特定強(qiáng)度類型到特定預(yù)測(cè)響應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在對(duì)其進(jìn)行預(yù)后方法或算法之前可利用測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行適宜的轉(zhuǎn)化或預(yù)處理步驟。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)錄物形成了預(yù)處理的強(qiáng)度值的加權(quán)總和，并將其與基于訓(xùn)練集優(yōu)化的閾值相比較(duda等人patternclassification,2^nded.,johnwiley,newyork2001)。加權(quán)可通過(guò)多種線性分類方法獲得，包括但不限于偏最小二乘法(pls，(nguyen等人,2002,bioinformatics18(2002)39-50))或支持向量機(jī)(svm，(等人learningwithkernels,mitpress,cambridge2002))。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在應(yīng)用于如以上所描述的加權(quán)總和之前將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為非線性的。該非線性轉(zhuǎn)化可包括增加數(shù)據(jù)的維數(shù)。該非線性轉(zhuǎn)化和加權(quán)總和可以隱式地進(jìn)行，例如通過(guò)使用核函數(shù)(等人learningwithkernels,mitpress,cambridge2002)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將新型數(shù)據(jù)樣品與作為真實(shí)測(cè)量的訓(xùn)練樣品或人工產(chǎn)生的原型的兩種或更多種原型相比較。該比較利用適宜的相似方式來(lái)進(jìn)行，例如，但不限于，歐幾里德距離(duda等人patternclassification,2^nded.,johnwiley,newyork2001)，相關(guān)系數(shù)(van’tveer,等人2002,nature415:530)等。然后將新型樣品分配到具有最接近的原型或在附近具有最高數(shù)目原型的預(yù)后組。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用決策樹(hastie等人,theelementsofstatisticallearning,springer,newyork2001)或隨機(jī)森林(breiman,randomforests,machinelearning45:52001)從關(guān)于轉(zhuǎn)錄物集或其產(chǎn)物的測(cè)量強(qiáng)度數(shù)據(jù)生成預(yù)后響應(yīng)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(bishop,neuralnetworksforpatternrecognition,clarendonpress,oxford1995)從關(guān)于轉(zhuǎn)錄物集或其產(chǎn)物的測(cè)量強(qiáng)度數(shù)據(jù)生成預(yù)后響應(yīng)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用判別分析(duda等人,patternclassification,2^nded.,johnwiley,newyork2001)包括但不限于線性分析、對(duì)角線性分析、二次判別分析和邏輯判別分析從關(guān)于轉(zhuǎn)錄物集或其產(chǎn)物的測(cè)量強(qiáng)度數(shù)據(jù)生成預(yù)后響應(yīng)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用微陣列預(yù)測(cè)分析(pam,(tibshirani等人,2002,proc.natl.acad.sci.usa99:6567-6572))從關(guān)于轉(zhuǎn)錄物集或其產(chǎn)物的測(cè)量強(qiáng)度數(shù)據(jù)生成預(yù)后響應(yīng)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用軟獨(dú)立建模分類法(simca,(wold,1976,patternrecogn.8:127-139))從關(guān)于轉(zhuǎn)錄物集或其產(chǎn)物的測(cè)量強(qiáng)度數(shù)據(jù)生成預(yù)后響應(yīng)。

治療劑

如以上所描述的，本文描述的方法允許將患者分類為對(duì)靶向具有異常dna修復(fù)的腫瘤的治療劑(下文稱作“dna損傷治療劑”)應(yīng)答的或非應(yīng)答的種類。如本文所用的，“dna損傷治療劑”包括已知直接損傷dna的試劑，阻止dna損傷修復(fù)的試劑，抑制dna損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑，抑制dna損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的試劑和抑制間接導(dǎo)致dna損傷的過(guò)程的試劑。目前一些用來(lái)治療癌癥的所述治療包括，但不限于，以下的dna損傷治療劑。

1)dna損傷劑：

a.烷化劑(含鉑的試劑，例如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑；環(huán)磷酰胺；白消安)。

b.拓?fù)洚悩?gòu)酶i抑制劑(依立替康；托泊替康)

c.拓?fù)洚悩?gòu)酶ii抑制劑(依托泊苷；蒽環(huán)類例如阿霉素和表柔比星)

d.電離輻射

2)dna修復(fù)靶向治療

a.非同源末端連接的抑制劑(dna-pk抑制劑、nu7441、nu7026)

b.同源重組的抑制劑

c.核苷酸切除修復(fù)的抑制劑

d.堿基切除修復(fù)的抑制劑(parp抑制劑、ag014699、azd2281、abt-888、mk4827、bsi-201、ino-1001、trc-102、apex1抑制劑、apex2抑制劑、連接酶iii抑制劑。

e.范可尼貧血通路的抑制劑

3)dna損傷信號(hào)通路的抑制劑

a.atm抑制劑(cp466722、ku-55933)

b.chk1抑制劑(xl-844、ucn-01、azd7762、pf00477736)

c.chk2抑制劑(xl-844、azd7762、pf00477736)

4)dna損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的抑制物

a.wee1激酶抑制劑

b.cdc25a、b或c抑制劑

5)對(duì)直接導(dǎo)致dna損傷的過(guò)程的抑制

a.組蛋白脫乙?；敢种苿?/p>

b.熱休克蛋白抑制劑(格爾德霉素、auy922)

疾病和組織來(lái)源

本文所描述的預(yù)測(cè)分類器對(duì)于確定用于治療癌癥的治療劑的應(yīng)答性或抗性是有用的。本文所描述的生物途徑是癌癥自身的特征，與等級(jí)和階段相似，且從而不限于單一癌癥疾病類型。因此，基因或基因產(chǎn)物的集合可跨不同組織中的不同癌癥類型用于預(yù)測(cè)癌癥治療的應(yīng)答性。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因或基因產(chǎn)物的集合對(duì)于評(píng)估乳腺癌腫瘤和卵巢癌腫瘤是有用的。

如本文所用的，癌癥包括但不限于，白血病、腦癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂體腫瘤、腎癌等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所描述的方法指用下列種類的化學(xué)治療劑治療的癌癥：dna損傷劑、dna修復(fù)靶治療、dna損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑、dna損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的抑制劑和間接地導(dǎo)致dna損傷的過(guò)程的抑制，但不限于這些種類。這些化學(xué)治療劑中的每一種被認(rèn)為是如本文所用的術(shù)語(yǔ)“dna損傷治療劑”。

“生物樣品”、“樣品”和“試驗(yàn)樣品”在本文互換地使用以指從個(gè)體獲得或用其他方式取得的任何物質(zhì)、生物流體、組織或細(xì)胞。其包括血液(包括全血、白血球、外周血單核細(xì)胞、血沉棕黃層、血漿和血清)、痰液、淚液、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、呼吸樣、尿液、精液、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽吸物、支氣管抽吸物、滑膜液、關(guān)節(jié)抽吸物、腹水、細(xì)胞、細(xì)胞提取物和腦脊液。其還包括上述全部的實(shí)驗(yàn)分離級(jí)分。例如，血液樣品可分級(jí)為血清或含特定類型的血細(xì)胞的級(jí)分，例如紅細(xì)胞或白細(xì)胞(白血球)。若需要，樣品可以是來(lái)自個(gè)體的樣品的組合，例如組織和流體樣品的組合。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”還包括含均質(zhì)固體物質(zhì)的物質(zhì)，例如來(lái)自糞便樣品、組織樣品或活檢組織的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”還包括來(lái)源于組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)。可利用用于獲得生物樣品的任何適宜的方法；示例性的方法包括，例如，靜脈切開術(shù)、擦拭(例如，口腔擦拭)，和細(xì)針穿刺活檢過(guò)程。還可通過(guò)例如顯微解剖(例如，激光捕獲顯微切割(lcm)或激光顯微切割(lmd))、膀胱沖洗、涂片(例如，pap涂片)或?qū)Ч芄嘞磥?lái)收集樣品。從個(gè)體獲得或來(lái)源于個(gè)體的“生物樣品”包括在從個(gè)體獲得之后已以任何適宜的方式處理的任何這樣的樣品。

在這樣的情況下，靶細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞，例如，結(jié)腸癌細(xì)胞或胃癌細(xì)胞。靶細(xì)胞來(lái)源于任何組織來(lái)源，包括人類和動(dòng)物組織，例如但不限于，新獲得樣品、冷凍的樣品、活檢樣品、體液樣品、血樣、保存的組織例如石蠟包埋固定的組織樣品(即，組織塊)或細(xì)胞培養(yǎng)。

方法和試劑盒

用于基因表達(dá)分析的試劑盒

用于進(jìn)行本文所描述的方法的試劑、工具和/或說(shuō)明書可于試劑盒中提供。例如，試劑盒可包含用于確定關(guān)于癌癥患者的適當(dāng)治療的試劑、工具和說(shuō)明書。所述試劑盒可包括用于從患者收集組織樣品的試劑，例如通過(guò)活檢來(lái)收集，和用于處理該組織的試劑。試劑盒還可包括用于進(jìn)行生物標(biāo)志物表達(dá)分析的一種或多種試劑，例如用于進(jìn)行rt-pcr、qpcr、rna印跡、蛋白質(zhì)組分析或免疫組織化學(xué)以確定患者的樣品中的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的試劑。例如，所述試劑盒中可包括用于進(jìn)行rt-pcr的引物，用于進(jìn)行rna印跡分析的探針，和/或用于進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析例如蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)和elisa分析的抗體。還可包括用于測(cè)定的適當(dāng)?shù)木彌_液。還可包括這些測(cè)定中的任何一種所需的檢測(cè)試劑。以下詳細(xì)描述了適當(dāng)?shù)脑噭┖头椒ā?/p>

本文所表征的試劑盒還可包括描述如何進(jìn)行用于測(cè)量生物標(biāo)志物表達(dá)的測(cè)定的說(shuō)明卡。說(shuō)明卡還可包括如何確定參考組群的說(shuō)明，包括如何確定參考組群中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平和如何集合表達(dá)數(shù)據(jù)以建立用于與試驗(yàn)患者相比較的參考。說(shuō)明卡還可包括用于測(cè)定試驗(yàn)患者中的生物標(biāo)志物表達(dá)和用于將該表達(dá)水平與參考組群中的表達(dá)相比較從而確定用于試驗(yàn)患者的適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)治療的說(shuō)明。以上描述了用于確定適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)治療的方法，且該方法可于說(shuō)明卡中詳細(xì)描述。

試劑盒中包括的信息材料可以是與本文所描述的方法和/或用于本文所描述的方法的試劑的用途相關(guān)的描述的、指導(dǎo)的、銷售的或其他的材料。例如，試劑盒的信息材料可包含聯(lián)系信息，例如，物理地址、電子郵件地址、網(wǎng)站或電話號(hào)碼，其中試劑盒的使用者可獲得有關(guān)進(jìn)行基因表達(dá)分析和解析結(jié)果的大量信息，尤其當(dāng)應(yīng)用于可能對(duì)特定治療劑具有陽(yáng)性應(yīng)答的人類時(shí)。

本文所表征的試劑盒還可包含從生物標(biāo)志物表達(dá)推斷可能對(duì)特定的治療劑具有陽(yáng)性應(yīng)答的患者所必需的軟件。

a)基因表達(dá)譜分析方法

在生物樣品中測(cè)量mrna可用作檢測(cè)生物樣品中的相應(yīng)蛋白水平的替代。因此，本文所描述的任何生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物套組還可通過(guò)檢測(cè)適當(dāng)?shù)膔na來(lái)檢測(cè)?；虮磉_(dá)譜分析的方法包括，但不限于，微陣列、rt-pct、qpcr、rna印跡、sage、質(zhì)譜測(cè)定法。

mrna表達(dá)水平通過(guò)反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr，隨后為qpcr)來(lái)測(cè)量。rt-pcr被用來(lái)從mrna產(chǎn)生cdna。cdna可用于qpcr測(cè)定以隨dna擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行而產(chǎn)生熒光。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，qpcr可產(chǎn)生絕對(duì)測(cè)量，例如每個(gè)細(xì)胞的mrna拷貝數(shù)。與毛細(xì)管電泳結(jié)合的rna印跡、微陣列、侵入測(cè)定和rt-pcr均已用于測(cè)量樣品中的mrna的表達(dá)水平。參見geneexpressionprofiling:methodsandprotocols,richarda.shimkets編,humanapress,2004。

微小rna分子是非編碼但可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小rna。適合測(cè)量mrna表達(dá)水平的任何方法也可用于相應(yīng)的微小rna。最近許多實(shí)驗(yàn)室已研究了微小rna作為疾病的生物標(biāo)志物的用途。許多疾病涉及廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，微小rna可能作為生物標(biāo)志物具有一定作用不是出人意料的。微小rna濃度和疾病之間的關(guān)聯(lián)常常不如蛋白水平和疾病之間的關(guān)聯(lián)那么清楚，然而微小rna生物標(biāo)志物的值可能是顯著的。當(dāng)然，與疾病過(guò)程中差異表達(dá)的任何rna一樣，開發(fā)體外診斷產(chǎn)品面臨的問(wèn)題將包括以下必要條件：微小rna存活于病態(tài)細(xì)胞中且易于提取以進(jìn)行分析，或微小rna被釋放到血液或其他基質(zhì)中，在那里微小rna必須存活得足夠久以被測(cè)量。蛋白生物標(biāo)志物具有相似的必要條件，雖然許多潛在的蛋白生物標(biāo)志物有意地在病理位點(diǎn)分泌并在疾病過(guò)程中以旁分泌的方式行使功能。許多潛在的蛋白生物標(biāo)志物被設(shè)計(jì)為在合成那些蛋白的細(xì)胞外行使功能。

基因表達(dá)還可利用質(zhì)譜測(cè)定法來(lái)評(píng)估。多種配置的質(zhì)譜儀可用于檢測(cè)生物標(biāo)志物值。若干類型的質(zhì)譜儀是可用的或可利用不同的配置來(lái)產(chǎn)生。通常，質(zhì)譜儀具有以下主要組件：進(jìn)樣口、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器、真空系統(tǒng)和儀器控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)系統(tǒng)。進(jìn)樣口、離子源和質(zhì)量分析器的差異通常限定了儀器的類型及其性能。例如，入口可以是毛細(xì)管柱液相色譜來(lái)源，或可以是直接進(jìn)樣探頭或平臺(tái)，例如基質(zhì)輔助激光解析中所用的。常見的離子源為，例如，電噴射，包括納升噴射和微噴射或基質(zhì)輔助激光解析。常見的質(zhì)譜儀包括四極濾質(zhì)器、離子阱質(zhì)量分析器和渡越時(shí)間質(zhì)量分析器。另外的質(zhì)譜測(cè)定法是本領(lǐng)域中熟知的(參見burlingame等人,anal.chem.70:647r-716r(1998)；kinter和sherman,newyork(2000))。

蛋白生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物值可通過(guò)任何以下方法來(lái)檢測(cè)和測(cè)量：電噴射電離質(zhì)譜法(esi-ms)、esi-ms/ms、esi-ms/(ms)n、基質(zhì)輔助激光解析離子化渡越時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定法(maldi-tof-ms)、表面增強(qiáng)激光解析/電離渡越時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定法(seldi-tof-ms)、硅表面的激光解吸/離子化質(zhì)譜(dios)、次級(jí)離子質(zhì)譜法(sims)、四極桿渡越時(shí)間(q-tof)、串聯(lián)渡越時(shí)間(tof/tof)技術(shù)，稱作ultraflexiiitof/tof，大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(apci-ms)、apci-ms/ms、apci-(ms).sup.n、大氣壓光離子質(zhì)譜法(appi-ms)、appi-ms/ms和appi-(ms).sup.n、四極桿質(zhì)譜測(cè)定法、傅立葉變換質(zhì)譜測(cè)定法(ftms)、定量質(zhì)譜測(cè)定法和離子阱質(zhì)譜測(cè)定法。

在對(duì)蛋白生物標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)譜表征和確定生物標(biāo)志物值之前使用樣品制備策略來(lái)標(biāo)記和富集樣品。標(biāo)記方法包括但不限于用于相對(duì)定量和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽(itraq)和細(xì)胞培養(yǎng)中用氨基酸標(biāo)記的穩(wěn)定同位素(silac)。在質(zhì)譜分析之前用來(lái)關(guān)于候選生物標(biāo)志物蛋白選擇性地富集樣品的捕捉試劑包括但不限于適體、抗體、核酸探針、嵌合體、小分子、f(ab')2片段、單鏈抗體片段、fv片段、單鏈fv片段、核酸、凝集素、配體結(jié)合受體、親和體(affybody)、納米抗體、錨蛋白、域抗體、可選的抗體支架(例如，雙特異抗體等)印跡的聚合物、avimer、多肽模擬物、類肽、肽核酸、蘇糖核酸、激素受體、細(xì)胞因子受體和合成的受體和這些的修飾形式和片段。

上述測(cè)定能夠進(jìn)行用于預(yù)測(cè)癌癥治療劑的應(yīng)答性的方法中的生物標(biāo)志物值的檢測(cè)，其中所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物樣品中檢測(cè)至少n個(gè)生物標(biāo)志物值，其中每個(gè)生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于選自由表1或2中提供的生物標(biāo)志物組成的組，如以下所詳細(xì)描述的，其中利用生物標(biāo)志物值的分類指示了個(gè)體是否將對(duì)治療劑是應(yīng)答性的。雖然所描述的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物中的某些僅對(duì)于預(yù)測(cè)對(duì)治療劑的應(yīng)答性是有用的，本文還描述了用于生物標(biāo)志物的多個(gè)子集的分組的方法，所述每個(gè)子集作為一組兩種或更多種生物標(biāo)志物是有用的。因此，本申請(qǐng)的各個(gè)實(shí)施方案提供了包括n種生物標(biāo)志物的組合，其中n為至少3種生物標(biāo)志物。將被理解的是n可以被選擇為以上所描述的范圍，以及相似的但高階范圍中的任何范圍中的任何數(shù)目。根據(jù)本文所描述的任何方法，可檢測(cè)生物標(biāo)志物值并單獨(dú)地對(duì)其分類，或可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)并集體分類，例如以多重測(cè)定形式進(jìn)行分類。

b)微陣列方法

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用了“寡核苷酸陣列”(本文也稱作“微陣列”)。微陣列可用來(lái)分析細(xì)胞中生物標(biāo)志物的表達(dá)，且尤其用來(lái)測(cè)量癌癥組織的生物標(biāo)志物的表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物陣列通過(guò)將代表細(xì)胞中存在的mrna轉(zhuǎn)錄物的可檢測(cè)標(biāo)記的多核苷酸(例如，從總細(xì)胞mrna或標(biāo)記的crna合成的熒光標(biāo)記的cdna)與微陣列雜交而產(chǎn)生。微陣列是具有細(xì)胞或生物體的基因組中的許多基因的產(chǎn)物的結(jié)合(例如，雜交)位點(diǎn)的有序的陣列的表面，所述許多基因優(yōu)選地為大多數(shù)的基因或幾乎全部的基因。微陣列可以本領(lǐng)域中已知的多種方法來(lái)生成。無(wú)論是怎樣產(chǎn)生的，微陣列共有某些特征。陣列是可再現(xiàn)的，這使得產(chǎn)生了給定陣列的多個(gè)拷貝并使其易于相互比較。優(yōu)選地，微陣列是小的，通常小于5cm²，且其由在結(jié)合(例如，核酸雜交)條件下穩(wěn)定的材料制成。微陣列中給定的結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)的獨(dú)特的集合將特異性地結(jié)合細(xì)胞中的單基因的產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方案中，使用在每個(gè)位置處包含已知序列的附著核酸的位置可尋址陣列。

將理解的是，當(dāng)生成與細(xì)胞的rna互補(bǔ)的cdna并在適宜的雜交條件下將其與微陣列雜交時(shí)，與陣列中對(duì)應(yīng)于任何特定基因的位點(diǎn)的雜交水平將反映出在由該基因/生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄的mrna的細(xì)胞中的廣泛性。例如，當(dāng)與總細(xì)胞mrna互補(bǔ)的可檢測(cè)標(biāo)記(例如，利用熒光素)的cdna或crna與微陣列雜交時(shí)，陣列上對(duì)應(yīng)于未在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的基因(即，能夠特異性地結(jié)合基因的產(chǎn)物)的位點(diǎn)將具有很少信號(hào)或無(wú)信號(hào)(例如，熒光信號(hào))，且所編碼的mrna分布廣泛的基因?qū)⒕哂邢鄬?duì)強(qiáng)的信號(hào)。選擇核酸雜交和洗滌條件以便探針與特定的陣列位點(diǎn)“特異性地結(jié)合”或“特異性地雜交”，即，探針與具有互補(bǔ)核酸序列的序列陣列位點(diǎn)雜交、形成雙鏈體或結(jié)合，而不與具有非互補(bǔ)核酸序列的位點(diǎn)雜交。如本文所用的，當(dāng)多核苷酸的較短部分少于或等于25個(gè)堿基時(shí)，利用堿基配對(duì)法則無(wú)錯(cuò)配，或若多核苷酸的較短部分長(zhǎng)于25個(gè)堿基，不存在5％以上的錯(cuò)配時(shí)，則認(rèn)為一個(gè)多核苷酸序列與另一個(gè)互補(bǔ)。優(yōu)選地，多核苷酸完全地互補(bǔ)(無(wú)錯(cuò)配)?？杀砻鞯氖?，利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)通過(guò)進(jìn)行包括陰性對(duì)照的雜交測(cè)定的特定雜交條件導(dǎo)致特異性雜交。

最佳雜交條件將取決于標(biāo)記的探針和固定的多核苷酸或寡核苷酸的長(zhǎng)度(例如，寡聚體對(duì)比大于200個(gè)堿基的多核苷酸)和類型(例如，rna、dna、pna)。用于核酸的特定(即，嚴(yán)格)雜交條件的通用參數(shù)描述于sambrook等人，同上，和于ausubel等人,“currentprotocolsinmolecularbiology”，greenepublishingandwiley-interscience,ny(1987)，其以整體并入以用于所有目的。當(dāng)使用cdna微陣列時(shí)，典型雜交條件是在65c時(shí)，在5xssc加0.2％sds中雜交，持續(xù)4小時(shí)，然后在25℃時(shí)在低嚴(yán)格洗滌緩沖液(1xssc加0.2％sds)中洗滌，然后在25℃時(shí)在高嚴(yán)格洗滌緩沖液(0.1ssc加0.2％sds)中洗滌10分鐘(參見shena等人,proc.natl.acad.sci.usa,vol.93,p.10614(1996))。例如，tijessen,hybridizationwithnucleicacidprobes”，elseviersciencepublishersb.v.(1993)和kricka,"nonisotopicdnaprobetechniques",academicpress,sandiego,calif.(1992)中也提供了有用的雜交條件。

c)免疫測(cè)定方法

免疫測(cè)定方法基于抗體與其相應(yīng)靶標(biāo)或分析物的反應(yīng)，且可根據(jù)特定的測(cè)定形式在樣品中檢測(cè)分析物。為提高基于免疫反應(yīng)性的測(cè)定方法的特異性和敏感性，單克隆抗體由于其特異性表位識(shí)別而經(jīng)常被使用。在許多免疫測(cè)定中也已成功地使用了多克隆抗體，原因是它們與單克隆抗體相比對(duì)于靶標(biāo)的親和力增高。已設(shè)計(jì)了用于寬泛的范圍的生物樣品基質(zhì)的免疫測(cè)定。已設(shè)計(jì)了提供定性、半定量和定量的結(jié)果的免疫測(cè)定形式。

定量結(jié)果可通過(guò)利用待檢測(cè)的特定分析物的已知濃度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用來(lái)生成?；跇?biāo)準(zhǔn)曲線繪制來(lái)自未知樣品的應(yīng)答或信號(hào)的圖，且建立對(duì)應(yīng)于未知樣品中的靶標(biāo)的量或值。

已設(shè)計(jì)了多種免疫測(cè)定形式。elisa或eia可以定量地檢測(cè)分析物/生物標(biāo)志物。該方法基于標(biāo)記與分析物或抗體的連接，且標(biāo)記組分直接地或間接地包括酶?？稍O(shè)計(jì)elisa試驗(yàn)的格式以對(duì)分析物進(jìn)行直接、間接、競(jìng)爭(zhēng)性或三明治檢測(cè)。其他基于標(biāo)記的方法例如，放射性同位素(i¹²⁵)或熒光。另外的技術(shù)包括，例如，凝集法、濁度法、比濁法、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、luminex測(cè)定和其他技術(shù)(參見immunoassay:apracticalguide,brianlaw編,taylor&francis,ltd.出版,2005版)。

示例性的測(cè)定形式包括酶聯(lián)免疫測(cè)定(elisa)、放射免疫測(cè)定、熒光測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)或時(shí)間分辨-fret(tr-fret)免疫測(cè)定。用于檢測(cè)生物標(biāo)志物的程序的實(shí)例包括生物標(biāo)志物免疫沉淀，然后進(jìn)行允許區(qū)分大小和肽水平的定量方法，例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、平面電色譜等。

檢測(cè)和/或定量可檢測(cè)的標(biāo)記或信號(hào)生成物質(zhì)的方法取決于標(biāo)記的性質(zhì)。由適當(dāng)?shù)拿复呋姆磻?yīng)的產(chǎn)物(其中可檢測(cè)的標(biāo)記是酶；參見以上)可以是，但不限于，熒光產(chǎn)物、發(fā)光產(chǎn)物或放射活性產(chǎn)物，或其可吸收可見光或紫外線。適用于檢測(cè)所述可檢測(cè)的標(biāo)記的檢測(cè)物的實(shí)例包括，但不限于，x-射線薄膜、放射性計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器、分光光度計(jì)、比色計(jì)、熒光光度計(jì)、光度計(jì)和光密度計(jì)。

任何用于檢測(cè)的方法可以允許進(jìn)行任何適宜的反應(yīng)的制備、處理和分析的任何形式來(lái)進(jìn)行。這可以是，例如，在多孔測(cè)定板(例如，96孔或384孔)中進(jìn)行或利用任何適宜的陣列或微陣列進(jìn)行。用于不同的試劑的貯存液可以手動(dòng)地或機(jī)器地配制，且所有隨后的吸取、稀釋、混合、分配、洗滌、孵育、樣品讀數(shù)、數(shù)據(jù)采集和分析可利用能夠檢測(cè)可檢測(cè)的標(biāo)記的商業(yè)上可獲得的分析軟件、機(jī)器和檢測(cè)設(shè)備在機(jī)器上進(jìn)行。

臨床應(yīng)用

在一些實(shí)施方案中，提供了用于鑒定和/或選擇對(duì)于治療方案應(yīng)答性的癌癥患者的方法。特別地，所述方法涉及鑒定或選擇對(duì)于治療方案應(yīng)答性的癌癥患者，所述治療方案包括施用直接或間接損傷dna的試劑。還提供了用于鑒定對(duì)于治療方案非應(yīng)答性的患者的方法。這些方法通常包括確定患者腫瘤(原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤或來(lái)自腫瘤的其他衍生物，例如，但不限于，血液或血液中的組分、尿液、唾液和其他體液)(例如，患者的癌細(xì)胞)中一系列預(yù)測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)水平，將表達(dá)水平與參考表達(dá)水平相比較，并鑒定樣品中的表達(dá)是否包括對(duì)應(yīng)于所選擇的對(duì)治療劑的應(yīng)答或非應(yīng)答的預(yù)測(cè)標(biāo)志物或標(biāo)志物集的表達(dá)的類型或譜。

在一些實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)dna損傷治療劑的應(yīng)答性的方法包括以下步驟：從個(gè)體中獲得試驗(yàn)樣品；測(cè)量試驗(yàn)樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中一種或多種生物標(biāo)志物選自由cxcl10、mx1、ido1、if144l、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4和apol3組成的組；獲得記錄表達(dá)水平的試驗(yàn)得分；提供包括與試驗(yàn)得分和應(yīng)答性有關(guān)的信息的閾值得分；以及將試驗(yàn)得分與閾值得分相比較；其中當(dāng)試驗(yàn)得分超過(guò)閾值得分時(shí)預(yù)測(cè)有應(yīng)答性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用本文提供的教導(dǎo)(包括實(shí)施例1中的教導(dǎo))可確定適當(dāng)?shù)拈撝档梅郑瓦m當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物加權(quán)。

在其他的實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)于dna損傷治療劑的應(yīng)答性的方法包括測(cè)量試驗(yàn)樣品中的一種或多種標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中一種或多種生物標(biāo)志物選自由cxcl10、mx1、ido1、if144l、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4、apol3、cdr1、fyb、tspan7、rac2、klhdc7b、grb14、ac138128.1、kif26a、cd274、cd109、etv7、mfap5、olfm4、pi15、fosb、fam19a5、nlrc5、prickle1、egr1、cldn10、adamts4、sp140l、anxa1、rsad2、esr1、ikzf3、or2l1p、egfr、nat1、lats2、cyp2b6、ptprc、ppp1r1a和al137218.1組成的組。表2a和2b提供了示例性的基因標(biāo)簽(或基因分類器)，其中生物標(biāo)志物分別由其中所列的40或44個(gè)基因產(chǎn)物組成，且其中閾值得分來(lái)源于其中所列的個(gè)體基因產(chǎn)物加權(quán)。在這些實(shí)施方案中的一個(gè)中，其中生物標(biāo)志物由表2b所列出的44個(gè)基因產(chǎn)物組成，且生物標(biāo)志物與表2b中所提供的加權(quán)相關(guān)聯(lián)，超出閾值得分0.3681的試驗(yàn)得分指示了個(gè)體將對(duì)于dna損傷治療劑為應(yīng)答性的可能性。

若與不接觸治療劑的生長(zhǎng)相比較，作為與治療劑接觸的結(jié)果癌癥的生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)，則癌癥對(duì)于治療劑是“應(yīng)答性的”。癌癥的生長(zhǎng)可以多種方法來(lái)測(cè)量，例如，可測(cè)量腫瘤的大小或適用于該腫瘤類型的腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。

若與其不接觸治療劑的生長(zhǎng)相比較時(shí)，作為與治療劑接觸的結(jié)果癌癥的生長(zhǎng)速率沒有被抑制，或被抑制的程度非常低，則癌癥對(duì)于治療劑是“非應(yīng)答性的”。如上所述，癌癥的生長(zhǎng)可用多種方法來(lái)測(cè)量，例如，可測(cè)量腫瘤的體積或適用于該腫瘤類型的腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。對(duì)治療劑非應(yīng)答性的性質(zhì)是高度可變的，不同的癌癥對(duì)于給定的治療劑表現(xiàn)出不同水平的“非應(yīng)答性”。更進(jìn)一步地，利用除腫瘤的生長(zhǎng)大小之外的另外的標(biāo)準(zhǔn)可評(píng)估非應(yīng)答性的測(cè)量，所述標(biāo)準(zhǔn)包括患者的生活質(zhì)量、轉(zhuǎn)移的程度等。

該試驗(yàn)的應(yīng)用將預(yù)測(cè)終點(diǎn)，包括但不限于，總存活期、無(wú)進(jìn)展存活期、放射性應(yīng)答、如recist所定義的應(yīng)答、完全應(yīng)答、部分應(yīng)答、穩(wěn)定病情和血清學(xué)標(biāo)志物，例如但不限于，psa、cea、ca125、ca15-3和ca19-9。

可選地，可使用在一種或多種核酸或其生物學(xué)衍生物例如編碼的蛋白的樣品中用于檢測(cè)、定量和定性rna、dna或蛋白的基于非陣列的方法，包括定量pcr(qpcr)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)或免疫組織化學(xué)(ihc)等。

從被測(cè)定的樣品中獲得表達(dá)譜之后，將表達(dá)譜與參考或?qū)φ兆V相比較以產(chǎn)生關(guān)于細(xì)胞或組織的治療應(yīng)答性表型的診斷，且因此產(chǎn)生關(guān)于獲得樣品的宿主的治療應(yīng)答性表型的診斷。如本文所用的關(guān)于表達(dá)譜的術(shù)語(yǔ)“參考”和“對(duì)照”意為待用于解釋給定患者的表達(dá)分類器并歸于預(yù)后或預(yù)測(cè)種類的基因的標(biāo)準(zhǔn)化類型或基因產(chǎn)物表達(dá)或某些生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。參考表達(dá)譜或?qū)φ毡磉_(dá)譜可以是獲自已知具有需要的表型的樣品的譜，所述表型例如，應(yīng)答性表型，且因此可以是陽(yáng)性參考或?qū)φ兆V。此外，參考譜可以來(lái)自已知不具有需要的表型的樣品，且因此是陰性參考譜。

如果使用定量pcr作為定量一種或多種核酸的水平的方法，該方法通過(guò)測(cè)量由雙重標(biāo)記的熒光探針(即，探針)釋放的熒光來(lái)定量pcr產(chǎn)物積累。

在某些實(shí)施方案中，將獲得的表達(dá)譜與單一參考譜相比較以獲得關(guān)于被測(cè)定的樣品的表型的信息。在又其他的實(shí)施方案中，將獲得的表達(dá)譜與兩種或更多種不同的參考譜相比較以獲得關(guān)于測(cè)定的樣品的表型的更深入的信息。例如，可將獲得的表達(dá)譜與陽(yáng)性和陰性參考譜相比較以獲得關(guān)于樣品是否具有目標(biāo)表型的確定的信息。

獲得的表達(dá)譜與一種或多種參考譜的比較可利用任何方便的方法來(lái)進(jìn)行，其中多種方法是陣列領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的，例如，通過(guò)比較表達(dá)譜的數(shù)字圖像、通過(guò)比較表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)等來(lái)進(jìn)行。描述比較表達(dá)譜的方法的專利包括，但不限于，美國(guó)專利第6,308,170號(hào)和第6,228,575號(hào)，其公開內(nèi)容在此通過(guò)引用并入。以上還描述了比較表達(dá)譜的方法。

比較步驟產(chǎn)生了關(guān)于所獲得的表達(dá)譜與一種或多種參考譜的相似或相異程度的信息，該相似信息用來(lái)確定被測(cè)定的樣品的表型。例如，與陽(yáng)性對(duì)照的相似性指示了測(cè)定的樣品具有與應(yīng)答性參考樣品相似的應(yīng)答性表型。相似地，與陰性對(duì)照的相似性指示了測(cè)定的樣品具有與非應(yīng)答性參考樣品相似的非應(yīng)答性表型。

可進(jìn)一步將生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與不同的參考表達(dá)水平相比較。例如，參考表達(dá)水平可以是預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)參考水平，以評(píng)估生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物集的表達(dá)是否是有信息含量的并關(guān)于確定患者是否為應(yīng)答性或非應(yīng)答性作出評(píng)價(jià)。此外，確定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可以與同生物標(biāo)志物同時(shí)測(cè)量的表達(dá)的內(nèi)部參考標(biāo)志物水平相比較以關(guān)于確定患者是否為應(yīng)答性或非應(yīng)答性作出評(píng)價(jià)。例如，并非由本發(fā)明的生物標(biāo)志物組成但已知表現(xiàn)恒定表達(dá)水平的不同的標(biāo)志物套組的表達(dá)可作為內(nèi)部參考標(biāo)志物水平來(lái)評(píng)價(jià)，且當(dāng)與參考相比較時(shí)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平是確定的。在一個(gè)可選的實(shí)例中，可將非腫瘤樣品的組織樣品中選擇的生物標(biāo)志物的表達(dá)評(píng)價(jià)作為內(nèi)部參考標(biāo)志物水平。在某些方面生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可被確定為具有增高的表達(dá)。在另外的方面生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可被確定為具有降低的表達(dá)。表達(dá)水平可被確定為與參考水平相比較表達(dá)上無(wú)信息含量的改變。在另外的方面，表達(dá)水平針對(duì)本文所提供的方法確定的預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平來(lái)確定。

本發(fā)明還與指導(dǎo)患者的常規(guī)治療有關(guān)。診斷試驗(yàn)顯示其為對(duì)于術(shù)語(yǔ)直接或間接影響dna損傷和/或dna損傷修復(fù)的種類的藥物的應(yīng)答者的患者，可被施用該治療，且該患者和腫瘤學(xué)家可有信心認(rèn)為患者將是受益的。由診斷試驗(yàn)指定為非應(yīng)答者的患者可被鑒定應(yīng)用更可能使其受益的可選的治療。

本發(fā)明還涉及選擇用于臨床試驗(yàn)的患者，其中新型藥物屬于直接或間接影響dna損傷和/或dna損傷修復(fù)的種類。具有潛在應(yīng)答者的試驗(yàn)群體的富集將利于在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)下對(duì)藥物更徹底的評(píng)估。

本發(fā)明還將涉及診斷患者為患有與dna損傷應(yīng)答缺陷(ddrd)有關(guān)的癌癥或易發(fā)展與dna損傷應(yīng)答缺陷(ddrd)有關(guān)的癌癥的方法。ddrd在本文被定義為其中患者的一種或多種細(xì)胞具有降低的修復(fù)dna損傷的能力的任何病癥，其降低的能力是腫瘤的發(fā)展或生長(zhǎng)中的誘發(fā)因素。ddrd診斷可與范可尼貧血/brca通路中的突變相關(guān)聯(lián)。ddrd診斷還可與乳腺癌或卵巢癌相關(guān)聯(lián)。這些診斷方法包括以下步驟：從個(gè)體中獲得試驗(yàn)樣品；測(cè)量試驗(yàn)樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中一種或多種生物標(biāo)志物選自由cxcl10、mx1、ido1、if144l、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4和apol3組成的組；取得記錄表達(dá)水平的試驗(yàn)得分；提供包括與試驗(yàn)得分和癌癥的診斷有關(guān)的信息的閾值得分；以及將試驗(yàn)得分與閾值得分相比較；當(dāng)試驗(yàn)得分超過(guò)閾值得分時(shí)，其中個(gè)體被確定為患有所述癌癥或易于發(fā)展所述癌癥。利用本文所提供的教導(dǎo)(包括實(shí)施例1的教導(dǎo))，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定適當(dāng)?shù)拈撝档梅趾瓦m當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物加權(quán)。

在其他的實(shí)施方案中，診斷患者為患有ddrd相關(guān)的癌癥或易于發(fā)展與ddrd相關(guān)的癌癥的方法包括測(cè)量試驗(yàn)樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中一種或多種生物標(biāo)志物選自由cxcl10、mx1、ido1、if144l、cd2、gbp5、prame、itgal、lrp4、apol3、cdr1、fyb、tspan7、rac2、klhdc7b、grb14、ac138128.1、kif26a、cd274、cd109、etv7、mfap5、olfm4、pi15、fosb、fam19a5、nlrc5、prickle1、egr1、cldn10、adamts4、sp140l、anxa1、rsad2、esr1、ikzf3、or2l1p、egfr、nat1、lats2、cyp2b6、ptprc、ppp1r1a和al137218.1。表2a和2b提供了示例性的基因標(biāo)簽(或基因分類器)，其中生物標(biāo)志物分別由其中所列的40個(gè)基因產(chǎn)物或44個(gè)基因產(chǎn)物所組成，且其中閾值得分來(lái)源于其中所列的單獨(dú)的基因產(chǎn)物加權(quán)。在這些實(shí)施方案中的一個(gè)中，其中生物標(biāo)志物由表2b所列的44個(gè)基因產(chǎn)物所組成，且生物標(biāo)志物與表2b中提供的加權(quán)相關(guān)聯(lián)，超過(guò)0.3681的閾值得分的試驗(yàn)得分指示了癌癥的診斷或易于發(fā)生癌癥的診斷。

以說(shuō)明而非限制的方式提供了以下的實(shí)施例。

實(shí)施例

實(shí)施例1

組織處理、層次聚類、亞型鑒定和分類器發(fā)生

腫瘤材料

確定為在本方法中有用的基因(表2)從來(lái)源于羅切斯特市梅奧診所(mayoclinicrochester)的107個(gè)巨切的乳腺腫瘤ffpe組織樣品組群的基因表達(dá)分析中被鑒定。該研究的倫理由機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(institutionalreviewboard)和北愛爾蘭倫理研究辦公室(officeofresearchethicsnorthernireland)批準(zhǔn)。

該樣品的組群可被進(jìn)一步描述為如下：

○47個(gè)樣品是brca1和brca2的野生型，即，表達(dá)了生物學(xué)功能性的brca1和brca2蛋白。這些樣品此后將被稱作散發(fā)性對(duì)照。

○31個(gè)樣品是brca1突變體，即，不表達(dá)生物學(xué)功能性的brca1蛋白。

○29個(gè)樣品是brca2突變體，即，不表達(dá)生物學(xué)功能性的brca2蛋白。

基因表達(dá)譜分析

利用roche高純度rna石蠟試劑盒(rochediagnosticsgmbh,mannheim,germany)從巨切的ffpe腫瘤樣品中提取總rna。利用nugenwt-ovation^tmffpe系統(tǒng)(nugentechnologiesinc.,sancarlos,ca,usa)擴(kuò)增總rna。然后使擴(kuò)增的單鏈cdna片段化并利用fl-ovation^tmcdnabiotinmodulev2(nugentechnologiesinc.)進(jìn)行生物素標(biāo)記。然后將其與almacbreastcancerdsa^tm雜交。對(duì)almac’sbreastcancerdsa^tm研究工具進(jìn)行優(yōu)化用于分析ffpe組織樣品，使有價(jià)值的貯存的組織庫(kù)的使用成為可能。almacbreastcancerdsa^tm研究工具是創(chuàng)新的微陣列平臺(tái)，代表正常乳腺組織和癌癥乳腺組織中的轉(zhuǎn)錄組。因此，breastcancerdsa^tm提供了乳腺疾病和組織背景中轉(zhuǎn)錄組的全面代表，利用普通微陣列平臺(tái)是不可用的。利用affymentrixscanner7g(affymetrixinc.,santaclara,ca)掃描陣列。

數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

利用mas5預(yù)處理算法對(duì)被譜分析的樣品進(jìn)行質(zhì)量控制(qc)。強(qiáng)調(diào)了不同的技術(shù)方面：平均噪聲和背景均質(zhì)性、當(dāng)前響應(yīng)的百分比(陣列質(zhì)量)、信號(hào)質(zhì)量、rna質(zhì)量和雜交質(zhì)量。分析相應(yīng)參數(shù)的分布和中位數(shù)絕對(duì)偏差并用來(lái)鑒定可能的逸出值。

almac’sovariancancerdsa^tm包含首先靶向自多核苷酸的3’端的300個(gè)核苷酸內(nèi)的區(qū)域。因此修改標(biāo)準(zhǔn)affymetrixrna質(zhì)量量度以適于3’端探針集的管家基因強(qiáng)度以及除通常的3’/5’比率之外使用了3’端探針集強(qiáng)度與平均背景強(qiáng)度的比率。檢查雜交對(duì)照以確保其強(qiáng)度和當(dāng)前響應(yīng)符合affymetrix所指定的必要條件。

基于esr1(雌激素受體1)的轉(zhuǎn)錄水平將來(lái)自brca1/2突變體和散發(fā)性對(duì)照訓(xùn)練集的腫瘤樣品分成2個(gè)數(shù)據(jù)集。通過(guò)所有esr1探針集(brad.15436_s_at、brad.19080_s_at、brem.1048_at、brih.10647c1n2_at、brih.5650c1n2_at、brpd.10690c1n5_at、brrs.81_at和brrs.81-22_at)的平均表達(dá)確定了每個(gè)樣品的mrna表達(dá)水平e.avg。對(duì)于所有樣品計(jì)算mrna中位數(shù)表達(dá)(e.med.all)。當(dāng)e.avg-e.med.all>0.5時(shí)認(rèn)為樣品是er陽(yáng)性的，和當(dāng)e.avg-e.med.all<0.5時(shí)認(rèn)為樣品是er陰性的。

在具有穩(wěn)健多陣列分析(rma)的表達(dá)控制臺(tái)v1.1中進(jìn)行預(yù)處理(irizarry等人,2003)，得到分別由56個(gè)樣品和51個(gè)樣品組成的er陽(yáng)性樣品和er陰性樣品的2個(gè)數(shù)據(jù)矩陣。進(jìn)行另外的轉(zhuǎn)化以去除如alter所描述的(alter等人,2000)與陣列質(zhì)量相關(guān)的差異。

特征選擇

將組合的背景&差異過(guò)濾器應(yīng)用于每個(gè)數(shù)據(jù)矩陣以鑒定最可變的探針集。背景過(guò)濾器基于探針集的選擇，表達(dá)e和表達(dá)差異vare高于由背景標(biāo)準(zhǔn)偏差σbg(來(lái)自表達(dá)平臺(tái)軟件)定義的閾值且若：

e>log2((zaσbg))；.log2((vare)>2[log2(σbg)-e-log2(log(2))]

則標(biāo)準(zhǔn)正常分布zα在特定的顯著性a探針集的分位點(diǎn)保持不變。其中顯著性閾值為a＝6.3.10^-5，關(guān)于選擇的探針集列表及其基因注釋參見表1。

層次聚類分析

利用卵巢癌dsa^tm(疾病特異性陣列)平臺(tái)將層次聚類技術(shù)應(yīng)用于來(lái)自所分析的199個(gè)上皮漿液性卵巢癌腫瘤的微陣列數(shù)據(jù)(圖1)。利用標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)健多芯片算法(rma)程序?qū)Υ直磉_(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。鑒定并去除數(shù)據(jù)集中的非生物學(xué)系統(tǒng)差異。鑒定表達(dá)水平在腫瘤之間顯著差異的那些探針集。這些探針集形成了內(nèi)在列表。

進(jìn)行2-d聚類信息(腫瘤，探針集)以建立基于內(nèi)在列表的腫瘤關(guān)系。應(yīng)用層次凝聚聚類(皮爾遜相關(guān)系數(shù)和ward關(guān)聯(lián))。利用gap指數(shù)選擇最佳分區(qū)數(shù)(tibshirani等人,2002,j.r.stat.soc.,63:411-423)。將亞聚類中可獲得的所有探針集映射至基因名稱。

基因聚類的功能分析

為建立探針集聚類的功能顯著性，將探針集映射至基因(entrez基因編號(hào))并基于超幾何函數(shù)(應(yīng)用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(benjamini和hochberg,1995,j.r.stat.soc.57:289:300))進(jìn)行富集分析。利用來(lái)自的metacore^tm單一試驗(yàn)分析工作流程對(duì)于通過(guò)關(guān)于er陽(yáng)性和er陰性樣品的層次聚類生成的每個(gè)基因組分析生物過(guò)程和通路的過(guò)表達(dá)。從分析中排除反義探針集。對(duì)于每個(gè)富集的功能實(shí)體種類評(píng)估超幾何p-值。選擇具有最高p-值的功能實(shí)體種類作為組的代表，并根據(jù)代表的顯著性(即，p-值)將代表這些功能實(shí)體的一般功能種類分配到基因聚類。

將富集ifn/dd一般功能條件的聚類中的基因分組到dna損傷應(yīng)答缺陷(ddrd)樣品組中并用于分類器生成。選擇來(lái)自ifn/dd一般功能條件所代表的er陽(yáng)性和er陰性數(shù)據(jù)集的樣品聚類以用于分類并標(biāo)記為ddrd。不被這些功能條件所代表的那些被標(biāo)記為非ddrd。

探針集水平上的分類器發(fā)生

在鑒定形成ddrd亞群的一類腫瘤之后，根據(jù)功能性ddrd基因列表(表1)進(jìn)行這些腫瘤對(duì)比腫瘤組群中所有其他腫瘤(非ddrd)的計(jì)算機(jī)分類，以鑒定將ddrd亞群分類的精細(xì)的基因分類模型。利用以下選擇(總18個(gè))的所有組合對(duì)其評(píng)估：

●三個(gè)樣品集

○er陰性樣品和er陽(yáng)性樣品的組合樣品集(組合樣品集)

○單獨(dú)的er陰性樣品

○單獨(dú)的er陽(yáng)性樣品

●兩個(gè)特征集

○具有75％變異/強(qiáng)度的完全特征列表過(guò)濾和ddrd列表的強(qiáng)迫列入。此處基于二者的平均等級(jí)去除具有最低組合差異和強(qiáng)度的探針集的75％。當(dāng)使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“varint”指該選擇。

○僅ddrd列表。當(dāng)使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“僅列表”指該選擇。

●三種分類算法

○pls(偏最小二乘法)(dejong,1993)

○sda(收縮判別分析)(ahdesmaki和strimmer,2010)

○dsda(對(duì)角sda)(ahdesmaki和strimmer,2010)

使用auc來(lái)評(píng)估不同模型的性能。在每個(gè)模型的發(fā)生中執(zhí)行迭代特征消除(ife)，其中最大auc是在交叉驗(yàn)證期間選擇最佳特征數(shù)目的主要標(biāo)準(zhǔn)。在跨越特征無(wú)可見的auc差異的情況下，選擇最小的特征長(zhǎng)度。

基因水平的分類器發(fā)生

為協(xié)助跨多陣列平臺(tái)對(duì)分類器的驗(yàn)證，將所選擇的探針集分類器在基因水平上重新生成。探針集分類器在基因水平上的重新發(fā)生需要兩個(gè)分別的步驟：

1.除反義探針集外，從映射每個(gè)基因的探針集的中值估計(jì)探針集分類器中單獨(dú)的基因的表達(dá)強(qiáng)度。

2.對(duì)用于分類的分類器參數(shù)進(jìn)行重新估計(jì)

在所有交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)期間根據(jù)最大敏感性和特異性選擇閾值。

相似地，通過(guò)在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的交叉驗(yàn)證中重新評(píng)估分類參數(shù)，基因水平限定的前10個(gè)基因(或當(dāng)前44個(gè)基因標(biāo)簽中存在的任何特征數(shù)目)的表達(dá)強(qiáng)度可用于重新開發(fā)基于僅此10個(gè)基因(或當(dāng)前44個(gè)基因標(biāo)簽中存在的任何特征數(shù)目)的分類器以及用于通過(guò)評(píng)估和最大化獲自所有交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)的敏感性和特異性重新建立閾值。該方法將與當(dāng)從較大的特征集(以上所描述的)進(jìn)行操作時(shí)所用的方法相似，除非將不包括特征選擇：特征將保持不變但被分配新的權(quán)重。

計(jì)算驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的分類器得分

公開的數(shù)據(jù)集

用于該分析的數(shù)據(jù)集為：即fac1[geo登錄號(hào)gse20271,(tabchy等人,2010)]、fac2[geo登錄號(hào)gse22093,(iwamoto等人,2011)]、fec[geo登錄號(hào)gse6861,(bonnefoi等人,2007)]、t/fac1[http://bioinformatics.mdanderson.org/pubdata.html,(hess等人,2006)]、t/fac2[geo登錄號(hào)gse16716,(lee等人,2010)]和t/fac3[geo登錄號(hào)gse20271,(tabchy等人,2010)]。必須注意的是在31個(gè)樣品中在fac1和fac2數(shù)據(jù)集之間存在重疊。這些樣品從fac2數(shù)據(jù)集中除去且從而僅在fac1、fac2和fec數(shù)據(jù)集的組合分析中包括一次。此外，樣品gsm508092從fac1中去除，因?yàn)槠涫寝D(zhuǎn)移性的淋巴結(jié)樣品。

利用rma對(duì)所有數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理(irizarry等人,2003)。對(duì)每個(gè)驗(yàn)證集，確定映射分類器基因的探針集，反義探針集(若可應(yīng)用)除外。對(duì)于affymetrixx3p和u133a陣列的注解從affymetrix網(wǎng)站上是可獲得的。計(jì)算跨映射分類器中的每個(gè)基因的所有探針集的中值強(qiáng)度，產(chǎn)生基因強(qiáng)度矩陣。然后將分類器應(yīng)用于該數(shù)據(jù)矩陣以產(chǎn)生關(guān)于每個(gè)樣品的分類器得分/預(yù)測(cè)。

計(jì)算性能矩陣

為計(jì)算npv和ppv，利用對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)集中的每個(gè)種類的比例評(píng)估每個(gè)端點(diǎn)(brca狀態(tài)/應(yīng)答)的廣泛性。

單變量和多變量分析

進(jìn)行單變量和多變量分析以分別評(píng)估ddrd分類器和應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)，并確定關(guān)聯(lián)(若有的話)是否獨(dú)立于已知臨床預(yù)測(cè)器。利用matlab中的邏輯回歸計(jì)算表4中呈現(xiàn)的用于單變量分析的p-值。對(duì)于多變量分析，我們使用了步進(jìn)式邏輯回歸(dupont，2009)，其中p-值代表變量的對(duì)數(shù)可能性。對(duì)數(shù)可能性是變量適合于模型的重要性的量度，因此強(qiáng)調(diào)了其作為預(yù)測(cè)器相對(duì)于其他預(yù)測(cè)器的獨(dú)立性。在單變量分析和多變量分析中，使用p-值<0.05作為顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。并且，在該評(píng)估中排除具有未知臨床因素的樣品。

結(jié)果

選擇用于分類器生成的樣品

本研究的目的是在轉(zhuǎn)錄組水平上表征可能能夠確定病理細(xì)胞對(duì)dna損傷治療劑的應(yīng)答性或抗性的一組基因。基于此，將選擇almac乳腺癌數(shù)據(jù)集中最佳表現(xiàn)該生物學(xué)的那些樣品并且關(guān)于分類器生成將其與其余樣品相比較(參見下一章節(jié))。確定的是er-ve樣品集中來(lái)自樣品聚類二的樣品是該選擇最相關(guān)的樣品，因?yàn)檫@些樣品表現(xiàn)出最高比例的brca突變體樣品(64％)且其表現(xiàn)出最顯著的生物學(xué)(ifn/免疫應(yīng)答)。從er+ve樣品集中，選擇來(lái)自樣品聚類二和三的樣品，因?yàn)檫@些樣品聚類分別具有73％和67％的brca突變體腫瘤。此外，這些聚類中的最顯著的生物學(xué)與細(xì)胞周期、dna損傷應(yīng)答和ifn/免疫應(yīng)答相關(guān)。已報(bào)道免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期通路在對(duì)dna-損傷的應(yīng)答中受調(diào)節(jié)(jackson,s.p.,和bartek,j.,nature461,1071-1078(2009)；rodier,f.,等人,natcellbiol11,973-979(2009)；xu,y.,natrevimmunol6,261-270(2006)，且這些亞群被組合以形成推定的ddrd亞群。er-ve樣品集的聚類二中的那些樣品(以下所描述的)和er+ve樣品集的聚類二和三中的那些樣品(以下所描述的)是被標(biāo)記ddrd(dna損傷應(yīng)答缺陷)的種類(參見圖1a)，同時(shí)er-ve樣品集的樣品聚類一和三中的樣品和er+ve樣品集的樣品聚類一、四、五和六中的樣品是被標(biāo)記為非ddrd的種類(參見圖1b)。

er-ve樣品集：在er-ve樣品集中，層次聚類分析確定了樣品聚類和6個(gè)探針集聚類組。探針集聚類三被鑒定為er-ve樣品集中最顯著的生物學(xué)且針對(duì)干擾素和免疫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行富集。

er+ve樣品集：在er+ve樣品集中，層次分析確定了6個(gè)樣品組和6個(gè)探針集聚類組。探針集聚類五被鑒定為er+ve樣品集中最顯著的生物學(xué)，且針對(duì)胞外基質(zhì)重塑進(jìn)行富集。er+ve樣品集中第二個(gè)最顯著的探針集聚類是探針集聚類六，且仍針對(duì)干擾素和免疫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行富集。

ddrd分類器模型的發(fā)生和驗(yàn)證

在鑒定形成ddrd亞群的腫瘤種類之后，進(jìn)行這些腫瘤對(duì)比腫瘤組群中所有其他腫瘤關(guān)于功能性ddrd(ifn/dna損傷)基因列表的計(jì)算機(jī)分類以鑒定精細(xì)的基因分類模型，其將ddrd亞群進(jìn)行分類。

利用組合的er-ve和er+ve乳腺癌樣品的集使用分類管線來(lái)獲得模型。分類管線按照公認(rèn)的良好實(shí)踐來(lái)開發(fā)[maqcconsortium,natbiotechnol2010]。該過(guò)程將并行地均在交叉驗(yàn)證下：1)從經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得基因分類模型；和2)評(píng)估模型的分類性能。分類器生成的性能和成功取決于可變的大量參數(shù)，例如，分類方法或探針集過(guò)濾的選擇?？紤]到此，評(píng)估了兩個(gè)特征集(i)具有75％差異/強(qiáng)度過(guò)濾的完全特征列表(ddrd(ifn/dna損傷)列表的強(qiáng)迫列入，表1)和(ii)僅ddrd(ifn/dna損傷)列表；且評(píng)估了三種分類算法，即pls(偏最小二乘)；sda(收縮判別分析)和dsda(對(duì)角sda)。在每個(gè)模型的開發(fā)中使用迭代特征消除(ife)，其為在每次迭代中去除最差排序的特征部分的迭代程序；當(dāng)僅最小數(shù)目的特征存在時(shí)即停止。接受者工作特征曲線下面積(auc-roc)，代表auc，用于評(píng)估分類性能，因?yàn)樵摐y(cè)量獨(dú)立于數(shù)據(jù)的組和廣泛率之間的截?cái)?。其也是用于分類性能的選擇的可識(shí)別的量度之一。因此，基于交叉驗(yàn)證下的平均auc選擇每個(gè)模型的最佳數(shù)目的特征。

模型的交叉比較通過(guò)以下來(lái)生成：首先基于最高平均auc對(duì)每個(gè)模型選擇最佳數(shù)目的特征，然后利用箱形圖來(lái)顯現(xiàn)每個(gè)模型的性能。這表現(xiàn)在圖2中。從左到右，前三個(gè)圖分別代表pls、sda和dsda分類器，其利用探針集的初始過(guò)濾而開發(fā)，以除去最低平均差異和強(qiáng)度的75％(強(qiáng)迫基因列表的列入)。接下來(lái)的三個(gè)圖分別代表著僅利用ddrd(ifn/dna損傷)開發(fā)的pls、sda和dsda分類器。

從圖2中，清楚的是，包括53個(gè)探針集的‘plsvarint’分類器模型是最高執(zhí)行模型，具有比其他5個(gè)模型的大多數(shù)顯著高的auc。然后該模型進(jìn)行到下一階段以基于獨(dú)立的外部數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，以評(píng)估ddrd分類得分的能力而關(guān)于應(yīng)答和預(yù)后將患者分層。

由于驗(yàn)證數(shù)據(jù)集其中公開數(shù)據(jù)或內(nèi)部數(shù)據(jù)利用不同的陣列平臺(tái)的事實(shí)，采取了驗(yàn)證分類模型的非正統(tǒng)方法。通常所用的方法并未設(shè)計(jì)為針對(duì)可選的陣列平臺(tái)可用的，且從而用于分類模型開發(fā)和獨(dú)立驗(yàn)證的分階段方法如下：

1.階段i–探針集水平的模型生成，在用于將ddrd亞群分類的交叉驗(yàn)證下選擇最佳模型(先前所描述的)

2.階段ii–探針集水平分類模型到基因水平分類模型的轉(zhuǎn)化

3.階段iii–利用外部數(shù)據(jù)集對(duì)再開發(fā)的基因分類模型的驗(yàn)證

使選擇的候選模型發(fā)展為驗(yàn)證階段，需要在基因水平上重建該模型(階段ii)。這包括將分類模型中的探針集映射到基因水平，并重新計(jì)算每個(gè)基因的權(quán)重。當(dāng)注解管線的準(zhǔn)確度通過(guò)進(jìn)一步分析而提高時(shí)，將所選擇的模型中的53個(gè)探針集映射到表2a中所列的40個(gè)基因，且隨后映射到表2b中所列的44個(gè)基因。

在基因分類模型的重新開發(fā)中，為確保使用與基因有關(guān)的所有信息，將與每個(gè)基因(表2c)有關(guān)的所有探針集的中值強(qiáng)度用作基因表達(dá)值。關(guān)于所有樣品對(duì)其進(jìn)行計(jì)算，得到基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣，與用于模型開發(fā)和選擇的階段i中使用的探針集表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣形成對(duì)照。為穩(wěn)定跨不同批次的強(qiáng)度，將每個(gè)樣品的全部探針集的中值從該樣品的相應(yīng)的每個(gè)基因的強(qiáng)度中減去。

利用pls回歸計(jì)算每個(gè)基因的新權(quán)重，得到最終基因分類器模型(40-基因和44-基因分類器模型)，其可用于在來(lái)自不同的陣列平臺(tái)的外部數(shù)據(jù)集基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證(階段iii)。

在階段iii中，利用可能來(lái)自其他陣列平臺(tái)的數(shù)據(jù)集對(duì)分類器進(jìn)行驗(yàn)證，采用以下的步驟：

1.確定映射于分類器中的基因的探針集，排除反義探針集(若可用的話)

2.計(jì)算關(guān)于分類器中的每個(gè)基因的所有探針集的中值強(qiáng)度，得到簡(jiǎn)化基因強(qiáng)度矩陣

a.若關(guān)于特定陣列平臺(tái)上的基因不存在探針集時(shí)，從訓(xùn)練數(shù)據(jù)中觀察到的平均值將用作替代。

3.關(guān)于每個(gè)樣品計(jì)算所有探針集的中值，并從簡(jiǎn)化的基因強(qiáng)度矩陣中減去。

4.將每個(gè)基因的值乘以標(biāo)簽中該基因的“權(quán)重”。

5.將在第4點(diǎn)獲得的關(guān)于標(biāo)簽中的每個(gè)基因的值加在一起以產(chǎn)生該樣品的標(biāo)簽得分。

6.分類器產(chǎn)生了關(guān)于每個(gè)樣品的得分，然后可將其用于從所謂的較可能應(yīng)答的患者到較不可能應(yīng)答的患者進(jìn)行分層。

實(shí)施例2

44-基因ddrd分類器模型的計(jì)算機(jī)模擬驗(yàn)證

通過(guò)原始almac乳腺數(shù)據(jù)集和三個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中的roc(受試者工作特征)曲線下的面積(auc)對(duì)44-基因ddrd分類器模型的性能進(jìn)行驗(yàn)證。auc是在所觀察到的疾病規(guī)模上計(jì)算的統(tǒng)計(jì)數(shù)值，并且是利用分類器模型的表型的預(yù)測(cè)效率的量度(wray等人,plosgenetics第6卷,1-9)。0.5的auc是隨機(jī)分類器的典型，且1.0的auc將代表種類的理想分離。因此，為確定44-基因ddrd分類器模型是否能夠預(yù)測(cè)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)乳腺癌和卵巢癌治療藥物種類的應(yīng)答，并能夠選擇用于標(biāo)準(zhǔn)乳腺癌和卵巢癌治療藥物種類的患者，所述藥物種類包括dna損傷誘導(dǎo)劑和dna修復(fù)靶向治療，前提為這些數(shù)據(jù)集內(nèi)的應(yīng)用之后的auc應(yīng)大于0.5，且最低置信區(qū)間也大于0.5。

44-基因分類器模型從散發(fā)性腫瘤分離brca突變體的能力的評(píng)價(jià)

預(yù)測(cè)ddrd狀態(tài)的分類器得分用于評(píng)價(jià)模型從散發(fā)性樣品中分離brca突變體樣品的能力。進(jìn)行該分析以評(píng)價(jià)分類器模型和brca突變狀態(tài)之間的關(guān)系。由于因?yàn)槿鄙俟δ苄詁rca1/2導(dǎo)致的dna損傷應(yīng)答的缺陷，brca突變體腫瘤表現(xiàn)出高度的基因組不穩(wěn)定性。從而，前提為ddrd分類器模型應(yīng)該能夠?qū)rca突變體樣品與brca野生型散發(fā)性樣品分離。

圖3顯示了44-基因分類器模型將brca突變體與散發(fā)性樣品分離，auc為～0.68，其中對(duì)于兩種模型而言較低的置信區(qū)間為～0.56(表3a)；顯示性能顯著優(yōu)于隨機(jī)分類器。從而，該分析確定了44-基因ddrd分類器模型能夠鑒定由于不能修復(fù)dna損傷導(dǎo)致的高基因組不穩(wěn)定性的樣品。

分類器模型應(yīng)用于獨(dú)立的微陣列臨床數(shù)據(jù)集

獨(dú)立的乳腺微陣列臨床數(shù)據(jù)集

(1)44-基因ddrd分類器模型對(duì)于dna損傷化學(xué)治療的預(yù)測(cè)能力的評(píng)估

為評(píng)估44-基因ddrd分類器模型預(yù)測(cè)對(duì)于dna損傷化學(xué)治療的應(yīng)答的能力，將其應(yīng)用于由三個(gè)公眾可獲得的數(shù)據(jù)集組合的數(shù)據(jù)。在每個(gè)研究中，用基于新輔助治療5-氟尿嘧啶、蒽環(huán)類和環(huán)磷酰胺的方案，直接損傷dna的藥物治療乳腺癌患者。在利用氟尿嘧啶、阿霉素和環(huán)磷酰胺(fac)的新輔助治療后，第一(tabchy等人,2010)和第二(iwamoto等人,2011)數(shù)據(jù)集分別具有87個(gè)er陽(yáng)性原發(fā)乳腺腫瘤樣品和50個(gè)er陰性原發(fā)乳腺腫瘤樣品的應(yīng)答數(shù)據(jù)。在新輔助治療5-氟尿嘧啶、表柔比星和環(huán)磷酰胺(fec)治療后，第三數(shù)據(jù)集(bonnefoi等人,lancetoncol8,1071-1078(2007))具有66個(gè)er陰性原發(fā)乳腺腫瘤樣品的應(yīng)答數(shù)據(jù)。每個(gè)研究使用病理完全應(yīng)答(pcr)或病變殘存(rd)作為終點(diǎn)。由于每個(gè)數(shù)據(jù)集相對(duì)小，將數(shù)據(jù)組合以提高分析的能力。

分析顯示44-基因ddrd分類器模型與對(duì)于基于蒽環(huán)類的化學(xué)治療的應(yīng)答顯著相關(guān)(相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(rr)＝4.13，ci＝1.94-9.87；auc＝0.78，ci＝0.70-0.85，p＝0.001；表3b，圖4)。分類器的陰性預(yù)測(cè)值(npv)顯著地高于陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(ppv)(0.90對(duì)比0.44，表3b)，表明ddrd-陰性腫瘤不可能對(duì)dna損傷化學(xué)治療應(yīng)答。

使用逐步邏輯回歸來(lái)確定44-基因ddrd分類器模型預(yù)測(cè)當(dāng)調(diào)整用于臨床變量時(shí)的組合數(shù)據(jù)集中的應(yīng)答的能力(表4)。44-基因ddrd分類器模型被確定為單變量分析中最有意義的臨床變量。多變量分析確定了44-基因ddrd分類器模型的預(yù)測(cè)值獨(dú)立于階段、等級(jí)且尤其是er狀態(tài)。

已提議將對(duì)于雌激素、孕酮和her2受體陰性作為異常ddr的生物標(biāo)志物且因此作為對(duì)dna損傷和dna修復(fù)靶治療的應(yīng)答的生物標(biāo)志物(foulkes等人,2010)。然而，該方法排除了被報(bào)道為er陽(yáng)性的20％的brca1突變體腫瘤和40％的brca2突變體腫瘤(foulkes等人,2004；tung等人,2010)。相比之下，根據(jù)我們采用的分析方法，44-基因ddrd分類器在er陽(yáng)性和er陰性腫瘤兩者中檢測(cè)了ddrd亞群，這通過(guò)fec和fac數(shù)據(jù)集的組合分析中的44-基因ddrd分類器的預(yù)測(cè)值的多變量分析來(lái)驗(yàn)證，證明了其對(duì)于er狀態(tài)的獨(dú)立性。臨床上，這是ddrd分類器的變換應(yīng)用的重要方面，因?yàn)檎J(rèn)為其可應(yīng)用于所有乳腺癌患者來(lái)確定其對(duì)于dna損傷治療的預(yù)測(cè)的應(yīng)答性，而無(wú)論er狀態(tài)如何。

(2)44-基因ddrd分類器模型對(duì)于含紫杉烷的化學(xué)治療方案的預(yù)測(cè)能力的評(píng)估

評(píng)估了44-基因ddrd分類器模型預(yù)測(cè)對(duì)于含非dna損傷劑(例如紫杉烷)的化學(xué)治療方案的應(yīng)答的能力。在利用紫杉醇和fac(t/fac)對(duì)321例原發(fā)乳腺癌患者進(jìn)行新輔助治療后，從應(yīng)答數(shù)據(jù)的3個(gè)數(shù)據(jù)集中組合數(shù)據(jù)，其中應(yīng)答被定義為pcr(hess等人,2006；lee等人,2010；tabchy等人,2010)。雖然44-基因ddrd分類器模型與應(yīng)答相關(guān)聯(lián)(auc＝0.61，ci＝～0.52-0.69，表3b，圖5)，該性能與僅用fac/fec處理的樣品中的相比顯著降低。此外，多變量分析顯示ddrd分類器在其預(yù)測(cè)對(duì)于t/fac的應(yīng)答的能力(表4)中并非與其他臨床參數(shù)無(wú)關(guān)(p＝0.21)。這表明由ddrd分類器檢測(cè)的亞群對(duì)于單獨(dú)的dna損傷方案比還包含抗微管劑的方案更靈敏。

獨(dú)立的卵巢癌微陣列臨床數(shù)據(jù)集

決定在另一個(gè)疾病區(qū)域中探查44-基因ddrd分類器模型的性能。從而，在一組具有漿液性癌病史的259個(gè)ffpe原發(fā)卵巢癌樣品中評(píng)估了分類器模型的性能。這些樣品來(lái)自接受輔助鉑治療或輔助鉑和紫杉烷治療的患者，且在卵巢癌dsa^tm上被譜分析。應(yīng)答數(shù)據(jù)通過(guò)resist和/或血清標(biāo)志物ca125水平來(lái)確定。將44-基因ddrd分類器模型應(yīng)用于這些樣品以證明應(yīng)答者與非應(yīng)答者顯著分離，auc為～0.68和較低的置信限度為約0.59(圖6)。44-基因ddrd分類器模型檢測(cè)了范可尼貧血/brca通路的功能障礙。

包括brca1和brca2的范可尼貧血/brca(fa/brca)通路在dna修復(fù)中起不可或缺的作用，且在乳腺癌中由于突變或表觀遺傳沉默可能是喪失的(kennedy和d'andrea,2006)。因此確定44-基因ddrd分類器模型是否能夠檢測(cè)該通路除brca1和brca2之外的成員的缺失。利用從攜帶fa/brca通路中的一系列突變的21個(gè)fa患者和具有功能性的fa/brca通路的11個(gè)健康對(duì)照的骨髓中生成的微陣列數(shù)據(jù)鑒定公開的數(shù)據(jù)集(vanderwerf,s.m.,等人,blood114,5290-5298(2009))。44-基因ddrd分類器模型在fa/brca突變體和正常樣品之間顯著地不同，auc為0.90(ci＝0.76-1.00，p<0.001，圖7)，證明ddrd分類器和fa/brca通路的功能障礙通過(guò)多重機(jī)制的強(qiáng)相關(guān)。

44-基因ddrd分類器模型的計(jì)算機(jī)模擬驗(yàn)證的總結(jié)

44-基因ddrd分類器模型的計(jì)算機(jī)模擬驗(yàn)證表明了以下：

(a)44-基因ddrd分類器模型能夠顯著地將brca突變體乳腺腫瘤樣品與野生型brca(散發(fā)性)乳腺腫瘤樣品相分離。這暗示了ddrd分類器模型能夠檢測(cè)與具有高水平的基因組不穩(wěn)定性相關(guān)的腫瘤例如brca突變體腫瘤的生物學(xué)。這些腫瘤通常對(duì)于dna損傷化學(xué)治療方案較好地應(yīng)答。

(b)在利用fac和fec(bonnefoi等人,2007；iwamoto等人,2011；tabchy等人,2010)以及t/fac(hess等人,2006；lee等人,2010；tabchy等人,2010)進(jìn)行新輔助治療后，44-基因ddrd分類器模型能夠在3個(gè)獨(dú)立的乳腺數(shù)據(jù)集的組合中將確定的應(yīng)答者(表現(xiàn)pcr的那些)與非應(yīng)答者(不表現(xiàn)pcr的那些)顯著地分離。44-基因ddrd分類器模型被發(fā)現(xiàn)獨(dú)立于其他臨床因子并且在fac/fec組合分析中是最顯著的獨(dú)立的預(yù)測(cè)器。這些研究的進(jìn)行利用了新鮮冷凍(ff)的樣品并利用了兩種不同的微陣列平臺(tái)，即，affymetrixx3p微陣列和affymetrixu133a微陣列。這些結(jié)果在獨(dú)立的乳腺數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了44-基因ddrd分類器模型的性能，所述乳腺數(shù)據(jù)集利用不同的樣品材料(ff而非ffpe)以及利用來(lái)自兩個(gè)不同的微陣列平臺(tái)的微陣列數(shù)據(jù)。

(c)44-基因ddrd分類器模型能夠在利用基于鉑或鉑/紫杉烷治療的輔助治療后的獨(dú)立的almac卵巢數(shù)據(jù)集中將應(yīng)答者與非應(yīng)答者顯著地分離。該數(shù)據(jù)利用在almacovariandsa^tm上譜分析的ffpe樣品而生成。

(d)利用骨髓組織樣品，44-基因ddrd分類器模型能夠在fa/brca突變體和正常樣品之間顯著地區(qū)分，表明了ddrd分類器和fa/brca通路的功能障礙通過(guò)多重機(jī)制而強(qiáng)相關(guān)。

總之，ddrd分類器模型在跨越3個(gè)不同的疾病區(qū)域(乳腺、卵巢和fa)時(shí)在性能上具有獨(dú)立驗(yàn)證和證明的穩(wěn)健性，表現(xiàn)出了利用來(lái)自4個(gè)不同的微陣列平臺(tái)(almacbreastdsa^tm和almacovariandsa^tm，affymetrixx3p微陣列和affymetrixu133a微陣列)的數(shù)據(jù)將兩個(gè)不同的樣品類型(ffpe和ff)中對(duì)于4種不同的化學(xué)治療方案(fac、fec、t/fac和鉑/紫杉烷)的應(yīng)答者與非應(yīng)答者相分離的能力。已證明ddrd是對(duì)于dna損傷治療劑的應(yīng)答的獨(dú)立預(yù)測(cè)器且可預(yù)測(cè)fa/brca通路中的突變。這種性能的可塑性和可重復(fù)性暗示了經(jīng)由44-基因分類器模型鑒定的ddrd亞群中鑒定的生物學(xué)與預(yù)測(cè)對(duì)dna損傷誘導(dǎo)劑的應(yīng)答顯著地和穩(wěn)健地相關(guān)，且從而支持了本發(fā)明的權(quán)利要求，其為了鑒定可用于預(yù)測(cè)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)乳腺癌和卵巢癌治療藥物種類應(yīng)答并選擇用于所述藥物種類的患者，所述藥物種類包括直接損傷dna、間接損傷dna或抑制正常dna損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或修復(fù)過(guò)程的藥物。

表3：

乳腺數(shù)據(jù)集中44-基因ddrd分類器模型的

性能指標(biāo)和獨(dú)立性評(píng)價(jià)

括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示來(lái)自交叉驗(yàn)證(a)或來(lái)自具有1000次迭代的自助法(b)的+/-2sd的95％置信限度。auc＝接受者工作特征曲線下面積；acc＝準(zhǔn)確度；sens＝敏感性；spec＝特異性；ppv＝陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；npv＝陰性預(yù)測(cè)值；rr＝相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，pcr＝病理完全應(yīng)答，rd＝病變殘存。

表4

44-基因ddrd分類器模型的單變量和多變量分析

44-基因ddrd分類器模型與獨(dú)立驗(yàn)證集中的標(biāo)準(zhǔn)病理參數(shù)的比較。利用具有來(lái)自對(duì)數(shù)可能性試驗(yàn)的p-值的邏輯回歸模型在單變量和多變量分析中評(píng)估ddrd分類器模型的預(yù)測(cè)值和顯著的臨床參數(shù)。

實(shí)施例3

44-基因ddrd分類器模型的體外驗(yàn)證

為評(píng)價(jià)44-基因分類器模型中所包含的基因潛在的生物學(xué)，利用一組乳腺細(xì)胞系在體外進(jìn)行了大量的研究。

方法

細(xì)胞系的維持

hcc1937親代、hcc1937-ev和hcc1937-br細(xì)胞系由貝爾法斯特女王大學(xué)(queen’suniversitycollegebelfast，qub)的paulharkin教授所惠贈(zèng)。細(xì)胞系通常維持在rpmi-1640培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有50u青霉素/ml，50μg鏈霉素/ml，2mm谷氨酰胺，1mm丙酮酸鈉和20％(v/v)胎牛血清(fbs)。hcc1937-ev和hcc937-br細(xì)胞系還需要0.2ml/mg遺傳霉素。在37℃下在5％co2的濕潤(rùn)空氣中培養(yǎng)細(xì)胞系。

克隆源性測(cè)定-parp-1抑制劑敏感性的確定

為測(cè)量parp-1抑制劑的敏感性(ku0058948)，將指數(shù)生長(zhǎng)中的細(xì)胞接種到6孔板中。接種后24小時(shí)，細(xì)胞與含增加劑量的藥物的培養(yǎng)基相接觸。每4-5天補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基。12-14天之后，在甲醇中固定細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)。計(jì)算關(guān)于給定劑量的對(duì)照的存活百分比，將關(guān)于該劑量的接種效率除以運(yùn)載體處理的細(xì)胞的接種效率。利用graphpadprism計(jì)算存活曲線和半數(shù)最大抑制濃度(ic50)值。

細(xì)胞存活率測(cè)定-順鉑敏感性的確定

為測(cè)量對(duì)于順鉑的敏感性，將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞接種到96孔板中。接種后24小時(shí)將細(xì)胞與含增加劑量的順鉑的培養(yǎng)基相接觸。在藥物存在下將細(xì)胞孵育96小時(shí)，然后利用promegacelltitre-glo發(fā)光細(xì)胞存活率測(cè)定評(píng)價(jià)細(xì)胞的生活力。計(jì)算細(xì)胞的敏感性作為運(yùn)載體(dmso)對(duì)照的百分比。利用graphpadprism計(jì)算存活曲線和半數(shù)最大抑制濃度(ic50)值。

結(jié)果

可在乳腺癌細(xì)胞系模型中鑒定ddrd亞群

使用臨床前模型系統(tǒng)來(lái)確定44-基因ddrd分類器是異常ddr的量度。由于brca1突變hcc1937乳腺癌細(xì)胞系是ddrd(tomlinson等人,1998)。44-基因分類器被應(yīng)用于hcc1937空載體對(duì)照細(xì)胞(hcc1937-ev)和hcc1937細(xì)胞，其中brca1功能性被校正(hcc1937-br)(圖7a)。發(fā)現(xiàn)ddrd44-基因分類器得分在hcc1937-ev中相對(duì)于hcc1937-br細(xì)胞要高，平均得分分別為0.5111和0.1516(圖7b)。與ddrd44-基因分類器得分相一致，hcc1937brca1突變體細(xì)胞系相對(duì)于brca1校正的細(xì)胞系對(duì)于parp-1抑制劑ku0058948(圖7c)和順鉑(圖7d)更敏感。這些臨床前數(shù)據(jù)表明ddrd44-基因分類器測(cè)量ddrd陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并與對(duì)dna損傷劑(順鉑)和dna修復(fù)靶向劑(parp-1抑制劑)的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。

ddrd44-基因分類器檢測(cè)范可尼貧血/brca通路的功能障礙

包括brca1和brca2的范可尼貧血/brca(fa/brca)通路在dna修復(fù)中具有不可或缺的作用，且由于突變或表觀遺傳沉默在乳腺癌中可能是喪失的(kennedy,r.d.,和d'andrea,a.d.,jclinoncol24,3799-3808(2006))。確定ddrd44-基因分類器是否能夠檢測(cè)該通路除brca1和brca2之外的成員的缺失。利用從攜帶fa/brca通路中的一系列突變的21個(gè)fa患者和具有功能性的fa/brca通路的11個(gè)健康對(duì)照的骨髓中生成的微陣列數(shù)據(jù)鑒定公開的數(shù)據(jù)集(vanderwerf等人，2009)。ddrd44-基因分類器模型在fa/brca突變體和正常樣品之間顯著地不同，auc為0.90(ci＝0.76-1.00，p<0.001)，證明ddrd分類器和fa/brca通路的功能障礙通過(guò)多重機(jī)制的強(qiáng)相關(guān)。

結(jié)論

ddrd44-基因分類器得分在brca1突變體hcc1937乳腺癌細(xì)胞系中相對(duì)于等基因brca1校正的細(xì)胞系中顯著較高，且因此ddrd亦如此。因?yàn)?4-基因分類器得分在這些細(xì)胞中與ddr功能障礙相關(guān)聯(lián)，證明了由ddrd分類器檢測(cè)的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞固有的而非淋巴細(xì)胞性浸潤(rùn)的功能。brca1和brca2代表fa/brcaddr網(wǎng)絡(luò)的部分，其包含被報(bào)道在約33％的乳腺癌中突變的或低表達(dá)的大量其他蛋白(kennedy,r.d.,和d'andrea,a.d.,jclinoncol24,3799-3808(2006))。如先前所描述的，ddrd44-基因分類器將來(lái)自患有fa突變的患者的骨髓樣品與正常對(duì)照顯著地分離。這表明ddrd分類器能夠檢測(cè)通路中的任何異常而非特異性地檢測(cè)brca1或brca2功能障礙。可能是ddrd44基因分類器可鑒定由于其他機(jī)制例如pten缺失，細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)功能障礙或代謝紊亂導(dǎo)致的增多的活性氧物質(zhì)導(dǎo)致的ddr缺陷的腫瘤。由于組成型的dna損傷，這些腫瘤可能對(duì)于dna修復(fù)靶向治療例如parp-1或chk1/2抑制劑是應(yīng)答的。

序列表

<110>almacdiagnosticslimited

mulligan,jude

bylesjo,max

mcdyer,fionnuala

deharo,steve

hill,lauraa.

keating,katherinee.

davison,timothy

proutski,vatali

harkin,dennispaul

kennedy,richard

goffard,nicolas

<120>用于癌癥的分子診斷試驗(yàn)

<130>adl-0702wp

<150>us61/383,201

<151>2010-09-15

<150>us61/490,039

<151>2011-05-25

<160>202

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>541

<212>dna

<213>智人

<400>1

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