本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，涉及一種重組腺病毒載體表達(dá)體內(nèi)自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,rsv)是引起全球5歲以下嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒性病原，常引發(fā)肺炎、支氣管炎(hall,c.b.,e.a.simoes,andl.j.anderson,clinicalandepidemiologicfeaturesofrespiratorysyncytialvirus.currtopmicrobiolimmunol,2013.372:p.39-57.)。老年人和免疫缺陷病人也是rsv的易感人群(jorquera,p.a.,l.anderson,andr.a.tripp,understandingrespiratorysyncytialvirus(rsv)vaccinedevelopmentandaspectsofdiseasepathogenesis.expertrevvaccines,2016.15(2):p.173-87.)。人在一生中可反復(fù)感染rsv，自然感染rsv僅能誘導(dǎo)短期的免疫力，產(chǎn)生不完全的保護(hù)(graham,b.s.,k.modjarrad,andj.s.mclellan,novelantigensforrsvvaccines.curropinimmunol,2015.35:p.30-8.)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：1歲以內(nèi)的嬰幼兒，有超過60％的急性呼吸道感染、超過80％的下呼吸道感染是由rsv引起(mazur,n.i.,etal.,lowerrespiratorytractinfectioncausedbyrespiratorysyncytialvirus:currentmanagementandnewtherapeutics.lancetrespirmed,2015.3(11):p.888-900。)。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年在世界范圍內(nèi)rsv可引起至少6400萬人發(fā)病和16萬人死亡。盡管rsv危害嚴(yán)重，但是尚缺乏可靠、有效的方法來診斷、預(yù)防及治療rsv病毒感染(girard,m.p.,etal.,areviewofvaccineresearchanddevelopment:humanacuterespiratoryinfections.vaccine,2005.23(50):p.5708-24；murata,y.,respiratorysyncytialvirusvaccinedevelopment.clinlabmed,2009.29(4):p.725-39.)。具有預(yù)防rsv病毒感染作用的rsv疫苗亟待研制。世界衛(wèi)生組織及美國醫(yī)學(xué)研究院有關(guān)21世紀(jì)疫苗報(bào)告中均將開發(fā)rsv疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項(xiàng)目之一。
rsv屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，有一個(gè)血清型，二個(gè)抗原亞型，單股負(fù)鏈rna病毒，共編碼11種蛋白，其中跨膜包膜糖蛋白f為rsv的主要中和抗原，基質(zhì)蛋白m為rsv的骨架蛋白(mclellan,j.s.,w.c.ray,andm.e.peeples,structureandfunctionofrespiratorysyncytialvirussurfaceglycoproteins.currtopmicrobiolimmunol,2013.372:p.83-104)。
病毒樣顆粒(virus-likeparticles,vlps)是利用病毒衣殼或其他結(jié)構(gòu)蛋白的自組裝能力形成的一種具有病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的顆粒狀物質(zhì)，不含病毒核酸，僅包括大量重復(fù)的病毒表面蛋白。病毒的糖蛋白像天然病毒一樣插入到vlps的膜上，從而保持了與天然病毒一樣的大小、空間構(gòu)象、重復(fù)排列的中和抗原表位和顆粒特征，vlps的病毒抗原表位不會發(fā)生丟失、變性和增加，能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。
vlps作為rsv候選疫苗的研究取得了初步成果，但臨床應(yīng)用仍存在許多問題有待探討。例如，rsv的f蛋白有5-6個(gè)n糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)對于f蛋白空間構(gòu)象、融合活性、抗原性等都具有重要作用，但采用昆蟲和禽細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備rsvvlps，可能存在蛋白質(zhì)翻譯后修飾修飾不足，影響vlps的空間構(gòu)象和免疫原性(fang,n.x.,i.h.frazer,andg.j.fernando,differencesinthepost-translationalmodificationsofhumanpapillomavirustype6bmajorcapsidproteinexpressedfromabaculovirussystemcomparedwithavacciniavirussystem.biotechnolapplbiochem,2000.32(pt1):p.27-33；zhou,w.,etal.,molecularcharacterizationofrecombinanthepatitisbsurfaceantigenfromchinesehamsterovaryandhansenulapolymorphacellsbyhigh-performancesizeexclusionchromatographyandmulti-anglelaserlightscattering.jchromatogrbanalyttechnolbiomedlifesci,2006.838(2):p.71-7.)。而以天然病毒感染的宿主(或同源宿主)來源的表達(dá)系統(tǒng)能產(chǎn)生與天然病毒生物活性高度一致的vlps，并誘導(dǎo)產(chǎn)生最有效的免疫應(yīng)答，取得更好的免疫保護(hù)效果(frietze,k.m.,d.s.peabody,andb.chackerian,engineeringvirus-likeparticlesasvaccineplatforms.curropinvirol,2016.18:p.44-9.)。另一方面，vlps的體外制備、表達(dá)和純化成本高昂，純化過程也可能引發(fā)蛋白構(gòu)象變化而降低免疫原性。這些不足為其臨床應(yīng)用帶來較大限制。
腺病毒載體(adenovirusvector,adv)對分裂期及非分裂期細(xì)胞均具有高感染效率、遺傳穩(wěn)定性好、易制備高滴度病毒等多種優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于基因治療和疫苗載體研究。重組腺病毒具有體外復(fù)制滴度高，制備成本低，能高效表達(dá)外源蛋白及安全性好等特點(diǎn)。因此，建立一種以腺病毒為載體的vlps的新方法，既能發(fā)揮vlps的作用，又能適于大規(guī)模生產(chǎn)，且能有效降低成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種重組腺病毒表達(dá)自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述呼吸道合胞病毒樣顆粒的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
一種重組腺病毒表達(dá)自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包含呼吸道合胞病毒f和m蛋白，所述f和m蛋白分別采用哺乳動物細(xì)胞偏愛的密碼子優(yōu)化的f和m基因進(jìn)行編碼。
進(jìn)一步，所述密碼子優(yōu)化的f基因的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示；所述密碼子優(yōu)化的m基因的核苷酸序列如序列表seqidno.2所示；
進(jìn)一步，所述重組腺病毒表達(dá)的呼吸道合胞病毒f和m蛋白的基因由如seqidno.3所示的2a序列連接，連接后得到的核苷酸序列如seqidno.4所示。
進(jìn)一步，所述重組腺病毒為一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒ad5載體系統(tǒng)，包括一個(gè)骨架質(zhì)粒、一個(gè)穿梭質(zhì)粒和一個(gè)包裝細(xì)胞系。
本發(fā)明基于腺病毒的生物遞送和表達(dá)系統(tǒng)，提供了一種重組腺病毒表達(dá)呼吸道合胞病毒f和m蛋白自組裝成呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：
(1)按照哺乳動物細(xì)胞密碼子偏好分別優(yōu)化rsvf、m基因；pcr方法用2a序列連接f和m基因，得到f-m基因，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
(2)將f-m基因克隆到穿梭載體中，得到攜帶f-m基因的穿梭質(zhì)粒，并進(jìn)一步將穿梭質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化到攜帶腺病毒基因組padeasy-1的bj5183的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行重組，經(jīng)篩選鑒定獲得重組質(zhì)粒padeasy-f-m；
(3)將重組質(zhì)粒padeasy-f-m線性化后轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，獲得重組腺病毒rad-f-m；
(4)用cscl密度梯度法離心純化重組腺病毒rad-f-m；
(5)將純化后的重組腺病毒rad-f-m感染vero細(xì)胞，用透射電鏡可觀察病毒樣顆粒的形成。
優(yōu)選地，所述用透射電鏡觀察病毒樣顆粒的步驟為：
(1)重組腺病毒rad-f-m感染vero細(xì)胞72h后收取細(xì)胞，2.5％戊二醛固定；
(2)經(jīng)脫水、包埋、固化后做超薄切片；
(3)3％醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色；
(4)透射電鏡觀察、拍照。
優(yōu)選地，所述穿梭載體為pshuttle載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了重組腺病毒表達(dá)自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒在制備用于預(yù)防或治療呼吸道合胞病毒感染疫苗或藥物、呼吸道合胞病毒抗體和呼吸道合胞病毒的診斷試劑中的應(yīng)用。
其中，所述疫苗為注射劑、口服劑、滴鼻劑或透皮劑。
本發(fā)明的有益效果如下：
在本發(fā)明中，對rsva亞型long株f、m蛋白基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，有效的增加了蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明以單一腺病毒為載體，通過構(gòu)建可共表達(dá)rsvf-m的重組腺病毒rad-f-m，感染宿主細(xì)胞后可原位產(chǎn)生自組裝的內(nèi)生性rsvvlps(endogenousrsvvlps,rsvevlps)，避免了體外制備、純化vlp面臨的諸多問題，可在最大程度上保持f蛋白天然的構(gòu)象和免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更具保護(hù)性的中和抗體。因此，以重組腺病毒載體傳遞rsvf和m蛋白原位組裝vlps的方法，制備相對簡單、顯著降低成本，有助于提高rsv疫苗的安全性、免疫效果和免疫保護(hù)作用。
附圖說明
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
圖1示出pshuttle-cmv-f-m酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖，1：dl15000dnamarker；2：目的基因，f-m，大小是2547bp；
圖2示出重組腺病毒質(zhì)粒padeasy-f-m經(jīng)paci酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，1：dl15000dnamarker；2：目的基因f-m，條帶大小是33kb和4.5kb的片段；
圖3示出為重組腺病毒rad-f-m感染293細(xì)胞，導(dǎo)致293細(xì)胞發(fā)生病變，a：病變的293細(xì)胞，b：正常的293細(xì)胞；
圖4示出重組腺病毒rad-f-m感染293細(xì)胞72h后細(xì)胞上清的westernblot鑒定結(jié)果，a為rsvf單抗檢測f蛋白的條帶，b為rsvm多抗檢測m蛋白的條帶，位置均在270kda處；
圖5示出氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒rad-f-m形成的條帶；
圖6示出氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒rad-f-m的電鏡照片；
圖7示出重組腺病毒rad-f-m感染vero細(xì)胞形成vlps的電鏡觀察結(jié)果(3％醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，jem-1400,20,000×)；
圖8示出免疫后小鼠血清抗體分析，a為rsv特異性血清抗體滴度檢測結(jié)果，b為中和抗體滴度檢測結(jié)果；
圖9示出免疫后小鼠在rsv攻毒后肺病毒滴度分析結(jié)果，a為實(shí)時(shí)定量pcr法檢測小鼠肺病毒滴度的結(jié)果，b為對肺病毒滴度檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)分析；
圖10示出免疫后小鼠在rsv攻毒后肺病理分析結(jié)果，a為肺血管周圍炎癥評分，b為肺支氣管周圍炎癥評分，c為肺間質(zhì)炎癥評分。
具體實(shí)施方式
為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所用的呼吸道合胞病毒和重組腺病毒來自北京交通大學(xué)生物工程與生命科學(xué)研究院基因工程實(shí)驗(yàn)室。
實(shí)施例1重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
1.構(gòu)建：為提高rsvf、m蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)量，采用哺乳動物細(xì)胞偏好的密碼子對rsvf、m密碼子進(jìn)行優(yōu)化并全基因合成，pcr方法用2a序列連接f和m，經(jīng)xhoi、sacii雙酶切后將目的片段連接至pshuttle載體。
2.酶切鑒定及測序：所獲得的質(zhì)粒經(jīng)xhoi、sacii雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在2547bp處和7500bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1)，分別與f-m和pshuttle載體大小一致，酶切鑒定陽性結(jié)果的質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證為正確質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pshuttle-f-m構(gòu)建成功。
實(shí)施例2構(gòu)建含有f-m基因的重組腺病毒質(zhì)粒
1.線性化穿梭質(zhì)粒及重組
pmei線性化所獲得的重組質(zhì)粒pshuttle-f-m，取0.5μg的已線性化的pshuttle-f-m轉(zhuǎn)化至攜帶腺病毒基因組padeasy-1的bj5183的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行重組，kana+抗性lb平板37℃培養(yǎng)16h，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。
2.酶切篩選鑒定重組質(zhì)粒
paci酶切所獲得的質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒酶切結(jié)果(圖2)，電泳結(jié)果顯示獲得了4.5kb和33kb二個(gè)片段。經(jīng)酶切鑒定獲得正確重組質(zhì)粒padeasy-f-m。
3.擴(kuò)增重組質(zhì)粒
用獲得的正確重組質(zhì)粒padeasy-f-m轉(zhuǎn)化ecoli.dh10b感受態(tài)，擴(kuò)增并純化獲得較大量的padeasy-f-m質(zhì)粒。具體方法參考adeasyadenoviralvectorsystem第24頁：amplifyingrecombinantadplasmid。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞包裝重組腺病毒
1.paci線性化重組腺病毒質(zhì)粒padeasy-f-m
用paci酶切重組腺病毒質(zhì)粒padeasy-f-m，乙醇沉淀、室溫干燥，取20μl滅菌去離子水溶解。
2.轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞
hek293細(xì)胞來自于由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所。
hek293細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔板)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞豐度約為50％-70％；取10μlpaci線性化處理的重組腺病毒質(zhì)粒padeasy-f-m加入240μlopti-mem(gibco)并混勻，10μllipofactamine2000加入240μlopti-mem并混勻，室溫孵育5min；將上述二種溶液混勻，室溫孵育20min。將上述500μl的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)4h后更換新的培養(yǎng)基。約在轉(zhuǎn)染后10d左右，hek293細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、變圓、折光性增強(qiáng)等典型的細(xì)胞病變(cpe)(圖3a)，圖3b為正常細(xì)胞對照。收集細(xì)胞及上清于-80℃、37℃反復(fù)凍融3次，取離心后的上清(p0代)感染hek293細(xì)胞，至細(xì)胞出現(xiàn)完全cpe，重復(fù)上述操作，獲得p1、p2、p3代病毒。
實(shí)施例4重組腺病毒蛋白表達(dá)及鑒定
1.接種重組腺病毒于hek293細(xì)胞，72h后收獲上清，上清經(jīng)冷凍干燥保存于-80℃。
2.取凍干濃縮10倍的細(xì)胞上清上樣做sds-page電泳。
3.轉(zhuǎn)膜做westernblot，分別用rsvf單抗(131-2a；merckmillipore)、rsvm小鼠多抗檢測，結(jié)果在上清中均可檢測到約270kda的條帶，說明rsvf蛋白與m蛋白結(jié)合在一起，且均成功表達(dá)，結(jié)果見圖4。
實(shí)施例5重組腺病毒rad-f-m的制備和純化
1.擴(kuò)大培養(yǎng)hek293細(xì)胞，約用15個(gè)150mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞傳代6h后(豐度為90％)接種重組腺病毒，約3d后細(xì)胞呈現(xiàn)完全cpe且約有50％脫落時(shí)收獲細(xì)胞上清，于4℃5000rpm離心10min，收獲細(xì)胞。
2.用pbs重懸細(xì)胞沉淀，凍存于-80℃。
3.氯化銫密度梯度法離心純化重組腺病毒(圖5)。具體方法參考djpalmer,png.methodsfortheproductionoffirstgenerationadenoviralvectors.methodsinmolecularbiology,2008,433(433):55-78
4.收集純化后的腺病毒經(jīng)透析后加入5％甘油保存于-80℃。
5.取10μl純化樣品制備電鏡負(fù)染樣品，并用透射電鏡觀察拍照(圖6)。
實(shí)施例6重組腺病毒滴度測定
重組腺病毒滴度測定參考clontech的adeno-xrapidtiterkit方法檢測。以2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種hek293細(xì)胞于24孔板，10倍系列稀釋病毒，每孔加入100μl病毒稀釋液，37℃5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，經(jīng)固定后加入鼠抗-hexon抗體、相應(yīng)的二抗、tmb顯色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒滴度(方法參考：clontech,adeno-xrapidtiterkitmanual第9頁的adeno-xtmrapidtiterprocedure)，所獲得的重組腺病毒滴度為：2.4×1010pfu/ml。
實(shí)施例7電鏡檢測重組腺病毒rad-f-m感染vero細(xì)胞組裝vlps
為檢測所獲得的重組腺病毒rad-f-m是否能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)組裝vlps，用30moi的rad-f-m感染vero細(xì)胞，72h收集細(xì)胞，2.5％戊二醛固定，經(jīng)脫水、包埋、固化后制備電鏡超薄切片，3％醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，用透射電鏡觀察拍照，觀察到病毒樣顆粒形成(圖7)。
實(shí)施例8重組腺病毒免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生rsv特異性抗體及中和抗體
為評價(jià)重組腺病毒免疫小鼠抗體產(chǎn)生情況，通過滴鼻途徑免疫小鼠，檢測小鼠血清中rsv特異性抗體產(chǎn)生情況(圖8a)，抗體滴度測定是采用elisa方法檢測。進(jìn)一步地，分析了所獲得的小鼠血清中的rsv特異性中和抗體的滴度(圖8b)。從抗體及中和抗體的數(shù)據(jù)分析，采用重組腺病毒rad-f-m表達(dá)rsvf、m能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體及中和抗體，rad-f-m與rad-f兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這意味著這種方法沒有影響rsvf蛋白的功能。
實(shí)施例9重組腺病毒免疫小鼠誘導(dǎo)rsv特異性免疫保護(hù)
重組腺病毒rad-f-m誘導(dǎo)的免疫保護(hù)是通過用rsvlong株對免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒來檢測。在rsv感染后的第5天取小鼠的肺臟進(jìn)行肺病毒滴度檢測(圖9)及肺病理分析(圖10)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，rad-f-m及rad-f均能有效地降低小鼠肺組織中的rsv病毒滴度，且rad-f-m免疫組的肺病毒數(shù)量僅為rad-f免疫組的12％(表1)。肺病理分析結(jié)果顯示：rad-f-m免疫組較rad-f免疫組能更有效地減輕小鼠肺血管周圍炎病變的嚴(yán)重程度(圖10)。
表1對肺病毒滴度檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)分析
顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
sequencelisting
<110>北京交通大學(xué)
<120>重組腺病毒載體表達(dá)體內(nèi)自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用
<130>jlc17i0053ea
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1725
<212>dna
<213>人工合成的密碼子優(yōu)化后的f基因序列
<400>1
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<212>dna
<213>人工合成的密碼子優(yōu)化后的m基因序列
<400>2
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aacgtgctggaaaaggacgacgaccccgccagcctgaccatctgggtgcccatgttccag120
agcagcatgcccgccgacctgctgatcaaagaactggccaacgtgaacatcctggtcaag180
cagatcagcacccccaagggccccagcctgagagtgatgatcaacagcagaagcgccctg240
ctggcccagatgcccagcaagttcaccatctgcgccaacgtgtccctggacgagcggagc300
aagctggcctacgacgtgaccaccccctgcgagatcaaggcctgcagcctgacctgcctg360
aagtccaagaacatgctgaccaccgtgaaggacctgaccatgaagaccctgaaccccacc420
cacgacatcattgccctgtgcgagttcgagaacatcgtgaccagcaagaaagtgatcatc480
cccacctacctgcggagcatcagcgtgcggaacaaggacctgaacaccctggaaaacatc540
accaccaccgagttcaagaacgccatcaccaacgccaagatcatcccttacagcggcctg600
ctgctggtcatcaccgtgatcgacaacaagggcgccttcaagtacatcaagccccagagc660
cagttcatcgtggacctgggcgcctacctggaaaaagaatccatctactacgtcaccacc720
aactggaagcacaccgccaccagattcgccatcaagcccatggaagattga771
<210>3
<211>108
<212>dna
<213>人工合成的2a序列
<400>3
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agaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct108
<210>4
<211>2547
<212>dna
<213>f-m基因序列
<400>4
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aacaccaagaaaaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggagattcctgggcttt420
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agcctgagagtgatgatcaacagcagaagcgccctgctggcccagatgcccagcaagttc2040
accatctgcgccaacgtgtccctggacgagcggagcaagctggcctacgacgtgaccacc2100
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aacaagggcgccttcaagtacatcaagccccagagccagttcatcgtggacctgggcgcc2460
tacctggaaaaagaatccatctactacgtcaccaccaactggaagcacaccgccaccaga2520
ttcgccatcaagcccatggaagattga2547