本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及利用crispr/cas9技術在低轉(zhuǎn)染效率細胞系中實現(xiàn)多基因同時敲除的技術及應用。具體涉及一種基于crispr/cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細胞系的新方法。

背景技術：

crispr/cas9是細菌和古細菌長期演化形成的免疫防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)是利用crispr-derivedrna(crrna)通過堿基配對與trans-activatingrna結(jié)合形成復合物，cas9內(nèi)切酶在此復合物引導下對與crrna配對的序列進行定點切割。所以，通過人工設計具有引導作用的sgrna(shortguiderna)，可以引導cas9對宿主細胞dna進行定點切割，然后通過非同源性末端接合(nhej)的機制進行修復，實現(xiàn)基因編輯。

目前，crispr/cas9系統(tǒng)被成功應用于真核細胞基因敲除、基因組修飾、條件型knockout和knock-in。但是對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，磷酸鈣或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法難以成功將表達sgrna與cas9的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞。由于慢病毒不僅能感染分裂或非分裂細胞，對于神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多類型細胞有極高的感染效率，并且慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上進行持久表達，所以利用慢病毒對較難轉(zhuǎn)染的細胞進行基因敲除具有廣闊的應用前景。但是利用慢病毒進行基因敲除時，sgrna與cas9隨機整合入基因組中并進行持久表達，當打靶完成后，過表達的sgrna與cas9容易造成脫靶效應。

cre重組酶是1981年從p1噬菌體中發(fā)現(xiàn)的，屬于λint酶超基因家族。cre重組酶由343個氨基酸組成，cre重組酶不需借助任何輔助因子，可作用于線形、環(huán)狀或超螺旋dna。cre重組酶能夠特異性識別loxp位點，使兩個loxp位點間的基因序列被刪除或重組。所以利用cre-loxp系統(tǒng)與慢病毒相結(jié)合的方式，構建sgrna與cas9介于兩個同向loxp之間的慢病毒，待打靶完成后，通過cre-loxp系統(tǒng)將sgrna與cas9去除，從而有效地提高打靶效率，同時降低脫靶的風險。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用crispr/cas9技術，提供一種基于crispr/cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細胞系的新方法。

為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術解決方案：

一種基于crispr/cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細胞系的新方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在目的基因的外顯子區(qū)域設計并合成相應的sgrna，室溫退火后連入載體pu6-sgrna1.0，獲得sgrna表達組件；

2)將若干針對目的基因的一個或多個sgrna表達組件進行串聯(lián)，獲得多個sgrna表達組件；

3)將兩個同向的loxp位點克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1α-puro載體，獲得pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1α-puro慢病毒載體；

4)將多個sgrna表達組件與cas9基因克隆至pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1α-puro慢病毒載體，獲得pcdh-cmv-loxp-cas9-sgrnas-loxp-ef1α-puro質(zhì)粒，該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)hek293t細胞進行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為lenti-cas9-sgrnas；

5)將cre基因克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1α-neo慢病毒載體，該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)hek293t細胞進行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為lenti-cre；

6)lenti-cas9-sgrnas感染待打靶的細胞，感染后加1.0mg/ml的puromycin篩選3～4天后，再用慢病毒lenti-cre感染篩選后的細胞，然后加入1.0mg/ml的新霉素篩選3～4天；

7)獲得的細胞采用有限稀釋法進行克隆化，獲得目的基因敲除的單克隆細胞系。

根據(jù)本發(fā)明，步驟1)中所述的合成相應的sgrna為針對ecm1外顯子6與ecm1外顯子7以及針對pgrn外顯子5與pgrn外顯子6設計的sgrna，其中：

針對ecm1外顯子6的sgrna序列為：ggatggcttcccccctggg；

針對ecm1外顯子7的sgrna序列為：agctactgaccccctacaa；

針對pgrn外顯子5的sgrna序列為：cgtgctgtgttatggtcga；

針對pgrn外顯子6的sgrna序列為：cggtgccttctgcgacc。

進一步地，步驟2)中所述的多個sgrna表達組件分別是ecm1與pgrn的四個sgrna表達組件進行串聯(lián)。

步驟7)中所述的基因敲除的單克隆細胞系為乳腺癌細胞系mda-mb-231。

本發(fā)明的基于crispr/cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細胞系的新方法，具有如下優(yōu)點：

將針對目的基因的sgrna與cas9基因通過慢病毒介導轉(zhuǎn)入待打靶細胞，提高了sgrna與cas9表達水平，從而提高打靶效率；利用cre-loxp系統(tǒng)，通過慢病毒介導在待打靶細胞內(nèi)表達cre，去除兩個同向loxp位點間的sgrna與cas9，降低了過表達的sgrna與cas9產(chǎn)生的細胞毒性，進而降低脫靶風險。

結(jié)合了慢病毒具備的能夠高效感染較難轉(zhuǎn)染的細胞以及cre重組酶能夠使兩個同向loxp位點間的基因序列被刪除或重組的特點進行基因組編輯，具有毒性小、基因敲除效率高、準確性高，周期短等特點，對于在難轉(zhuǎn)染細胞系中實現(xiàn)多基因敲除意義重大。

附圖說明

圖1是攜帶sgrna及cas9的慢病毒載體結(jié)構圖。

圖2是攜帶cre的慢病毒載體結(jié)構圖。

圖3是sgrna與cas9慢病毒介導的ecm1與pgrn打靶后pcr結(jié)果圖。

圖4是t7e1酶切鑒定sgrna與cas9慢病毒介導的ecm1與pgrn打靶效率檢測圖。

圖5是southernblot檢測cre慢病毒介導的sgrna與cas9去除結(jié)果圖。

圖6是sgrna與cas9慢病毒介導的ecm1與pgrn測序結(jié)果圖。

圖7是利用慢病毒敲除ecm1和pgrn基因建立細胞系潛在脫靶檢測圖。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的做進一步的詳細說明。

具體實施方式

按照本發(fā)明的技術方案，一種基于crispr/cas9多基因敲除低轉(zhuǎn)染效率細胞系的新方法，包括以下步驟：

1)在目的基因的外顯子區(qū)域設計并合成相應的sgrna，室溫退火后連入載體pu6-sgrna1.0，獲得sgrna表達組件；

2)將若干針對目的基因的一個或多個sgrna表達組件進行串聯(lián)，獲得多個sgrna表達組件；

3)將兩個同向的loxp位點克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1α-puro載體，獲得pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1α-puro慢病毒載體；

4)將多個sgrna表達組件與cas9基因克隆至pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1α-puro慢病毒載體，獲得pcdh-cmv-loxp-cas9-sgrnas-loxp-ef1α-puro質(zhì)粒，該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)hek293t細胞進行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為lenti-cas9-sgrnas；

5)將cre基因克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1α-neo慢病毒載體，該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)hek293t細胞進行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為lenti-cre；

6)lenti-cas9-sgrnas感染待打靶的細胞，感染后加1.0mg/ml的puromycin(嘌呤霉素)篩選3～4天后，再用慢病毒lenti-cre感染篩選后的細胞，然后加入neomycin(新霉素，1.0mg/ml)篩選3～4天；

7)獲得的細胞采用有限稀釋法進行克隆化，獲得目的基因敲除的單克隆細胞系。

上述步驟1)中所述的合成相應的sgrna為針對ecm1外顯子6與7以及針對pgrn外顯子5與6設計的sgrna，其中：

針對ecm1外顯子6的sgrna序列為：ggatggcttcccccctggg；

針對ecm1外顯子7的sgrna序列為：agctactgaccccctacaa；

針對pgrn外顯子5的sgrna序列為：cgtgctgtgttatggtcga；

針對pgrn外顯子6的sgrna序列為：cggtgccttctgcgacc。

上述步驟2)中所述的多個sgrna表達組件分別是ecm1與pgrn的四個sgrna表達組件進行串聯(lián)。

上述步驟7)中所述的基因敲除的單克隆細胞系為乳腺癌細胞系mda-mb-231。

該方法涉及兩種慢病毒，一種是表達sgrna及cas9的慢病毒，另一種是表達cre蛋白的慢病毒。其中：

所提供的表達sgrna及cas9的慢病毒載體是將sgrna表達組件和cas9基因的克隆至慢病毒載體pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1αα-puro的mcs區(qū)，再將該載體與包裝質(zhì)粒在hek293t細胞內(nèi)包裝，獲得用于基因打靶的慢病毒。

所提供的表達cre蛋白的慢病毒，是將cre基因克隆至慢病毒載體pcdh-cmv-mcs-ef1αα-neo，再將該載體與包裝質(zhì)粒在hek293t細胞內(nèi)包裝，獲得表達cre蛋白的慢病毒。

所述的sgrna表達組件是針對一個或多個基因設計的一個或多個sgrna。

將多基因的sgrna及cas9同時克隆至慢病毒載體的兩個同向loxp之間，在低轉(zhuǎn)染效率的細胞內(nèi)實現(xiàn)多基因同時敲除，再利用表達cre的慢病毒，對基因組中整合的cas9及sgrna進行有效去除，防止過度表達cas9及sgrna造成脫靶效應。

以下是發(fā)明人給出的具體實施例。

實施例1：靶向ecm1和pgrn基因外顯子sgrna的設計、合成及載體構建

(1)選取基因主要發(fā)揮功能的區(qū)域?qū)膃xon，長度大約為400-1200bp；

(2)在exon區(qū)找出所有ngg及其前12位堿基在ncbi進行blast，篩選出與目標序列完全匹配并且唯一匹配的序列(若無符合要求的ngg，反向查找ccn)，減少潛在脫靶位點；

本實施例設計了ecm1外顯子6與ecm1外顯子7的sgrna以及針對pgrn外顯子5與pgrn外顯子6設計的sgrna，其中：針對ecm1外顯子6的sgrna序列為：ggatggcttcccccctggg(序列表<210>1)；針對ecm1外顯子7的sgrna序列為：agctactgaccccctacaa(序列表<210>2)，針對pgrn外顯子5的sgrna序列為：cgtgctgtgttatggtcga(序列表<210>3)；針對pgrn外顯子6的sgrna序列為：cggtgccttctgcgacc(序列表<210>4)，分別在其5’加上accg得到正向寡核苷酸，獲得其互補鏈，并且在其5’加上aaac得到反向寡核苷酸。將合成的正向和反向寡核苷酸室溫退火后連入pu6-sgrna1.0，獲得sgrna表達組件。再將若干sgrna表達組件進行串聯(lián)，獲得多個ecm1與pgrnsgrna表達組件。

實施例2：靶向ecm1和pgrn基因的慢病毒構建及包裝

(1)將兩個同向的loxp位點克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1α-puro載體，獲得pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1α-puro載體；

(2)將串聯(lián)的ecm1與pgrnsgrna表達組件及cas9基因克隆至pcdh-cmv-loxp-mcs-loxp-ef1α-puro慢病毒載體，獲得同時表達多個pgrn與ecm1sgrna表達組件及cas9基因的慢病毒載體pcdh-cmv-loxp-cas9-ecm1&pgrnsgrnas-loxp-ef1α-puro(如圖1所示)；

(3)將cre基因克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1α-neo載體，獲得表達cre蛋白的慢病毒載體pcdh-cmv-cre-ef1α-neo(如圖2所示)；

(4)慢病毒載體pcdh-cmv-loxp-cas9-ecm1&pgrnsgrnas-loxp-ef1α-puro、pcdh-cmv-cre-ef1α-neo分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)hek293t細胞進行慢病毒包裝，獲得的慢病毒命名為lenti-cas9-sgrnas與lenti-cre。

實施例3：利用慢病毒特異性敲除ecm1和pgrn基因

以靶向乳腺癌細胞系mda-mb-231的ecm1和pgrn基因為例，其過程如下：

(1)mda-mb-231細胞培養(yǎng)于60mm皿，利用慢病毒lenti-cas9-sgrnas感染，感染后加puromycin(1.0mg/ml)篩選3～4天，獲得整合ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞；收集整合ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞基因組，使用引物hecm1testfor序列aggtaccgaacgccagctccatttg(序列表<210>5)、hecm1testback序列aagatctggccttccatgtacaggtgtg(序列表<210>6)、hpgrntestfor序列aggtacctgtgtgatgggggagtcacctt(序列表<210>7)和hpgrntestback序列aagatctgctggctccagcccctcactca(序列表<210>8)進行pcr擴增并變性退火(如圖3，其中l(wèi)ine2為hecm1、line4為hpgrnpcr擴增產(chǎn)物，line1為hecm1和line3為hpgrn野生型對照)，將野生型大小條帶進行純化，取500ng進行t7e1酶切檢測(如圖4所示，左圖為hecm1酶切結(jié)果，右圖為hpgrn酶切結(jié)果)；

(2)慢病毒lenti-cre感染puromycin篩選后的細胞，然后加入neomycin(1.0mg/ml)篩選3～4天，獲得ecm1和pgrnsgrna與cas9去除后的mda-mb-231細胞；

(3)獲得的mda-mb-231細胞采用有限稀釋法進行多次克隆化，獲得ecm1和pgrn基因敲除的mda-mb-231單克隆細胞系。

(4)收集整合ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞與lenti-cre去除ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞基因組，使用spei與ndei進行雙酶切，再使用由引物cas9southernblotprobefor序列aatcgatgccaccatggacaa(序列表<210>9)和cas9southernblotprobeback序列catatgcgccagcgcgag(序列表<210>10)擴增獲得的southernblot探針與酶切后基因組進行雜交，檢測cas9基因在基因組中整合與去除情況(如圖5所示，line1為整合ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞、line2為lenti-cre去除ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞、line3為慢病毒載體pcdh-cmv-loxp-cas9-ecm1&pgrnsgrnas-loxp-ef1α-puro。

實施例4：ta克隆對慢病毒特異性敲除ecm1和pgrn基因的細胞系測序

將實施例3步驟(2)獲得的野生型大小條帶純化產(chǎn)物3μl與0.5μlpgem-t連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞；

(2)挑取單克隆以序列aggtaccgaacgccagctccatttg(序列表<210>5)和序列aggtacctgtgtgatgggggagtcacctt(序列表<210>7)的引物測序，靶基因ecm1和pgrn兩個sgrna靶序列發(fā)生多種類型突變，基因敲除成功(如圖6所示)。

實施例5：利用慢病毒特異性敲除ecm1和pgrn基因建立細胞系脫靶檢測

分析ecm1和pgrn基因的sgrna潛在的脫靶位點，潛在的脫靶位點序列：ggatggctgctcccctggg、tgatggattccccccaggg、ccctactgaccctctacaa、atctactgacccctttcaa、caggctgtgttatggccga、gatgctctgttatggtgga、cggtgccttctgctgcc、cggtgcctactgggacc(序列表<210>11～18)，并對潛在的脫靶位點進行引物設計，使用引物offtarget1for序列agggctctgtcttatgtcc(序列表<210>19)和offtarget1back序列tggcagcaactttcattt(序列表<210>20)、offtarget2for序列ggcccttatccaacacgagg(如序列表<210>21)和offtarget2back序列actgtggatgcttcacaccc(如序列表<210>22)、offtarget3for序列ccacaggccatgacacttgta(如序列表<210>23)和offtarget3back序列agactagcccggcaacaaag(如序列表<210>24)、offtarget4for序列tgcaccttggttttagggaa(序列表<210>25)、offtarget4back序列agattctcccagtagtggcct(序列表<210>26)、offtarget5for序列taaaagaaagaggacctgtgcg(序列表<210>27)、offtarget5back序列tcccttgcccccatgaaaag(序列表<210>28)、offtarget6for序列tacgcaccatgtgtctagtg(序列表<210>29)、offtarget6back序列aagctgctgcttctgtactct(序列表<210>30)、offtarget7for序列actgaagcacgtctggcata(序列表<210>31)、offtarget7back序列ccgcttggccctgtattttc(序列表<210>32)、offtarget8for序列ggtaaagttaggagcaaggg(序列表<210>33)和offtarget8back序列aagacaatgagggtatcaggtag(序列表<210>34)對lenti-cre去除ecm1和pgrnsgrna與cas9的mda-mb-231細胞進行pcr擴增，并進行測序檢測脫靶效率，結(jié)果如圖7所示，利用lenti-cre去除sgrna與cas9后的細胞，8個潛在脫靶位點未發(fā)生脫靶。

核苷酸或氨基酸序列表

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<110>陜西師范大學

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<213>人工合成

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<400>7

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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