紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案包括：介孔硅殼納米顆粒表面連接分子量大小為1,800的低分子量聚醚酰亞胺(PEI)。紅色羅丹明染料染料的包埋:將紅色羅丹明染料包埋至介孔二氧化硅納米的介孔中。制備出的紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的直徑為80～150納米，孔徑為0.5～2納米，載藥率為20～40％。其基因轉(zhuǎn)染效率為40～70％，細(xì)胞存活率為80％～95％。此外，還可通過觀察納米載體內(nèi)紅色羅丹明染料的分布情況來實(shí)時跟蹤基因所到達(dá)的位置。
【專利說明】
紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法及應(yīng)用，屬生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]基因轉(zhuǎn)染是一種非常常規(guī)的生物和醫(yī)藥技術(shù)，但是通常的基因轉(zhuǎn)染用的試劑是相對分子質(zhì)量為25，000的聚醚酰亞胺(PEI)，雖然該P(yáng)EI比相對分子質(zhì)量為I，800的PEI的轉(zhuǎn)染效率高，但是其細(xì)胞毒性也比相對分子質(zhì)量為I，800的PEI大得多，因此將相對分子質(zhì)量為I，800的PEI連接至一納米微球上便可以成功制備出一種轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低的新型基因轉(zhuǎn)染載體。
[0003]此外，用常規(guī)的基因轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，很難方便的示蹤基因載體的具體位置，也就無法判定目標(biāo)細(xì)胞是否有外源基因的的進(jìn)入。于是可以通過先合成一種含有介孔的納米基因載體，然后裝載有機(jī)染料(如可以對細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行著色的紅色羅丹明染料)來對細(xì)胞核進(jìn)行著色，以達(dá)到示蹤基因載體和對靶向細(xì)胞著色的目的，并評估目的基因是否進(jìn)入了靶向細(xì)胞。因此，研制出一種具有轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小，并且可以實(shí)時跟蹤外源基因的納米載體等優(yōu)勢的新型基因載體具有重大的意義，在生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域具有重要的科研和臨床應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，我們提出具有轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小，并且可以實(shí)時跟蹤外源基因的納米載體等優(yōu)勢的新型基因載體的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案包括:介孔硅殼納米顆粒表面連接分子量大小為I，800的低分子量聚醚酰亞胺(PEI)。紅色羅丹明染料染料的包埋:將紅色羅丹明染料包埋至介孔二氧化娃納米的介孔中。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)勢:I)具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率。2)具有較低的細(xì)胞毒性。3)可以通過觀察納米載體內(nèi)紅色羅丹明染料的分布情況來實(shí)時跟蹤基因所到達(dá)的位置。
[0007]具體技術(shù)方案如下:
[0008]—種紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法;其特征是步驟如下:
[0009]I)稱取介孔二氧化硅納米顆粒用去離子水配制成I?100毫克每毫升的溶液，加入質(zhì)量比為1:3?1:30的3-溴丙酸，在磁力攪拌條件下，攪拌反應(yīng)6?12小時，得到羧基化的介孔二氧化娃納米顆粒；
[0010]2)將羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒溶解于去離子水中；加入質(zhì)量比為1:1?1:
10、相對分子質(zhì)量為I，800的聚醚酰亞胺，并在磁力攪拌條件下，攪拌反應(yīng)6?12小時;待反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌沉淀I?3遍，得到可吸附DNA的基因納米載體；
[0011]3)將基因納米載體配成I?10毫克每毫升的無水乙醇溶液，然后加入與基因納米載體的質(zhì)量比為1:2?1:20的紅色羅丹明染料，在磁力攪拌條件下，攪拌反應(yīng)6?12小時;待反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌沉淀I?3遍，得到實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體。
[0012]制備的紅色羅丹明料示蹤基因納米載體，直徑為80?150納米，孔徑為0.5?2納米，載藥率為20?40 %。
[0013]本發(fā)明的方法制備的紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體，其基因轉(zhuǎn)染效率為40?70 %，細(xì)胞存活率為80 %?95 %。
[0014]本發(fā)明可通過觀察納米載體內(nèi)紅色羅丹明染料的分布情況來實(shí)時跟蹤基因所到達(dá)的位置。
[0015]具體說明如下:
[0016]介孔二氧化娃基因納米載體的步驟如下:
[0017]I)介孔二氧化硅納米顆粒的羧基化:取一干凈的小玻璃瓶，向其中量取濃度為5?10毫克/毫升，直徑為80?150納米，孔徑為0.5?2納米的介孔二氧化硅納米顆粒。然后加入10?100毫克的3-溴丙酸，以50?100W的功率超聲溶解3-溴丙酸，最后于100?500轉(zhuǎn)/分鐘，15?50°C條件下攪拌反應(yīng)6?12小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以9,000?11，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5?20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍。
[0018]2)介孔硅殼納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將步驟I)中羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒溶解至2?5毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入30?200微升，相對分子質(zhì)量為I，800的聚醚酰亞胺(PEI)，并于100?500轉(zhuǎn)/分鐘，，15?50°C條件下攪拌反應(yīng)6?12小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以9，000?11，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5?20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即得到可以吸附DNA的基因納米載體。
[0019]3)將紅色羅丹明染料包埋至介孔二氧化硅基因納米載體中并進(jìn)行基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染:紅色羅丹明染料包埋介孔二氧化硅基因納米載體:將權(quán)利要求1所述的基因納米載體溶解至2?5毫升的無水乙醇中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入10?50毫克的紅色羅丹明染料，于100?500轉(zhuǎn)/分鐘，15?50°C條件下攪拌反應(yīng)6?12小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以9，000?11，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5?20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即得到可以實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體。
[0020]評估本發(fā)明制備的可實(shí)時示蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體的轉(zhuǎn)染效果的方法如下:I)介孔二氧化硅基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將得到的可實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體溶解至100?500微升的無菌去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入50?200微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.3?3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻，再加入I?5微升裝載有紅色羅丹明染料的介孔二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止10?30分鐘。
[0021]2)將介孔二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細(xì)胞:將得到的含有外源基因質(zhì)粒DAN和介孔二氧化硅基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細(xì)胞中，再于37 °C,5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?8小時后吸取培養(yǎng)液，加入200?500毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)12?48小時后于熒光顯微鏡觀察并計算轉(zhuǎn)染效率。
[0022]本發(fā)明制備出的紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的直徑為80?150納米，孔徑為0.5?2納米，載藥率為20?40%。其基因轉(zhuǎn)染效率為40?70%，細(xì)胞存活率為80%?95%。此外，還可通過觀察納米載體內(nèi)紅色羅丹明染料的分布情況來實(shí)時跟蹤基因所到達(dá)的位置。
【附圖說明】
[0023]圖1:制備的介孔二氧化硅基因納米載體的透射電子顯微鏡照片(形貌分析)。
[0024]圖2:將裝載有紅色羅丹明染料細(xì)胞核染料的介孔二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因至人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)后的轉(zhuǎn)染結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面的實(shí)施例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0026]實(shí)施例1:
[0027]介孔二氧化硅基因納米載體裝載紅色羅丹明染料并轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒至Hela細(xì)胞:
[0028]I)紅色羅丹明染料包埋介孔二氧化硅基因納米載體:將按步驟I所述的基因納米載體溶解至2毫升的無水乙醇中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入10毫克的紅色羅丹明染料，于100轉(zhuǎn)/分鐘，50 °C條件下攪拌反應(yīng)6小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以11，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I遍，即得到可以實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體。
[0029]2)介孔二氧化硅基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將上述步驟I)中得到的可實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體溶解至100微升的去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入50微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻，再加入I微升裝載有紅色羅丹明染料的介孔二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止10分鐘。
[0030]3)將介孔二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細(xì)胞:將上述步驟2)中得到的含有外源基因質(zhì)粒DAN和介孔二氧化硅基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細(xì)胞中，然后于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時后吸取培養(yǎng)液，加入200毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時后于焚光顯微鏡觀察。
[0031]實(shí)施例2:
[0032]介孔二氧化硅基因納米載體裝載紅色羅丹明染料并轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒至Hela細(xì)胞:
[0033]I)紅色羅丹明染料包埋介孔二氧化硅基因納米載體:將按步驟I所述的基因納米載體溶解至3毫升的無水乙醇中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入30毫克的紅色羅丹明染料，于300轉(zhuǎn)/分鐘，35°C條件下攪拌反應(yīng)9小時。待反應(yīng)結(jié)束后，立即以10，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，并用去離子水洗滌沉淀2遍，即得到可以實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化娃基因納米載體。
[0034]2)介孔二氧化硅基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將上述步驟I)中得到的可實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體溶解至300微升的去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入100微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和I微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻，再加入2微升裝載有紅色羅丹明染料的介孔二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止15分鐘。
[0035]3)將介孔二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細(xì)胞:將上述步驟2)中得到的含有外源基因質(zhì)粒DAN和介孔二氧化硅基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細(xì)胞中，然后于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后吸取培養(yǎng)液，加入300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時后于焚光顯微鏡觀察。
[0036]實(shí)施例3:
[0037]介孔二氧化硅基因納米載體裝載紅色羅丹明染料并轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒至Hela細(xì)胞:
[0038]I)紅色羅丹明染料包埋介孔二氧化硅基因納米載體:將按步驟I所述的基因納米載體溶解至5毫升的無水乙醇中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入50毫克的紅色羅丹明染料，于500轉(zhuǎn)/分鐘，50°C條件下攪拌反應(yīng)12小時。待反應(yīng)結(jié)束后，立即以11，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀3遍，即得到可以實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化娃基因納米載體。
[0039]2)介孔二氧化硅基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將上述步驟I)中得到的可實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體溶解至500微升的去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入200微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻，再加入5微升裝載有紅色羅丹明染料的介孔二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止30分鐘。
[0040]3)將介孔二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細(xì)胞:將上述步驟2)中得到的含有外源基因質(zhì)粒DAN和介孔二氧化硅基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細(xì)胞中，然后于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后吸取培養(yǎng)液，加入500毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)12小時后于熒光顯微鏡觀察并計算轉(zhuǎn)染效率，如圖2所示。[0041 ] 實(shí)施例4:
[0042]形態(tài)觀察、粒徑及其分布測定。取介孔二氧化硅納米基因載體溶液經(jīng)離心分離后，取出沉淀物，加蒸餾水少量使分散，滴于碳支持膜上制樣，在透射電鏡下觀察其形貌狀態(tài)并拍照。透射電鏡下觀察到介孔二氧化硅納米基因載體呈均勻規(guī)則的球形粒子，其直徑在80?150nm范圍內(nèi)可控。所制得的納米載體如圖1所示。
[0043]本發(fā)明公開和提出的紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法及應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改變條件路線等環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)，盡管本發(fā)明的方法和制備技術(shù)已通過較佳實(shí)施例子進(jìn)行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和技術(shù)路線進(jìn)行改動或重新組合，來實(shí)現(xiàn)最終的制備技術(shù)。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體的制備方法;其特征步驟如下: 1)介孔二氧化硅納米顆粒的羧基化:稱取介孔二氧化硅納米顆粒用去離子水配制成I?100毫克每毫升的溶液，加入質(zhì)量比為1:3?1:30的3-溴丙酸，在磁力攪拌條件下，攪拌反應(yīng)6?12小時，得到羧基化的介孔二氧化娃納米顆粒； 2)介孔硅殼納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺:將羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒溶解于去離子水中；加入質(zhì)量比為1:1?1:10，相對分子質(zhì)量為1,800的聚醚酰亞胺，并在磁力攪拌條件下，攪拌反應(yīng)6?12小時;待反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌沉淀I?3遍，得到可吸附DNA的基因納米載體； 3)將紅色羅丹明染料染料包埋至介孔二氧化硅基因納米載體中并進(jìn)行基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將基因納米載體配成I?10毫克每毫升的乙醇溶液，然后加入與基因納米載體的質(zhì)量比為1:2?1:20的紅色羅丹明染料，在磁力攪拌條件下，攪拌反應(yīng)6?12小時;待反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌沉淀I?3遍，得到實(shí)時跟蹤外源基因的介孔二氧化硅基因納米載體。2.如權(quán)利要求1所述的方法制備的紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體，其特征是:直徑為80?150納米，孔徑為0.5?2納米，載藥率為20?40%。3.如權(quán)利要求1所述的方法制備的紅色羅丹明染料示蹤基因納米載體，其基因轉(zhuǎn)染效率為40?70 %，細(xì)胞存活率為80 %?95 %。4.利用納米載體內(nèi)紅色羅丹明染料的分布情況來實(shí)時跟蹤基因所到達(dá)的位置。
【文檔編號】C12N15/87GK105861561SQ201610210251
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】常津, 鄭斌, 王漢杰, 諶紅彬, 潘慧卓
【申請人】天津大學(xué)