本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗cd10蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗cd10單克隆抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

cdl0分子最初作為普通急性淋巴細(xì)胞白血病抗原(calla)被發(fā)現(xiàn)，由mme基因編碼含750aa的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為90-110kda的ii型單鏈穿膜糖蛋白。cdl0主要表達(dá)在骨髓中的早期b細(xì)胞和胎兒胸腺的一群細(xì)胞上，主要是cd2^-的細(xì)胞。cdl0可以鑒別骨髓來(lái)源的t細(xì)胞前體，隨著細(xì)胞進(jìn)入t細(xì)胞的分化，cdl0的表達(dá)開(kāi)始減少。在b細(xì)胞內(nèi)，cdl0的表達(dá)隨著細(xì)胞獲得膜表面免疫球蛋白而開(kāi)始減少。cdl0也表達(dá)在生發(fā)中心的b細(xì)胞上和成熟的中性粒細(xì)胞上。在非造血組織中，cdl0分子也表達(dá)在許多組織細(xì)胞上，如腎小管和腎小球細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、膽管、乳腺和涎腺的肌上皮細(xì)胞等，腦組織中觸突膜，培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞和某些實(shí)體腫瘤細(xì)胞系上也有cdl0的表達(dá)。

cdl0分子廣泛分布在各種組織，具有中性肽鏈內(nèi)切酶(nep)的功能，并且表達(dá)在不同的組織，其功能不盡相同。目前廣泛應(yīng)用于用血液系統(tǒng)腫瘤以及部分實(shí)體腫瘤的診斷和預(yù)后判斷，還用于造血細(xì)胞分化發(fā)育研究和部分組織干細(xì)胞的研究。

目前臨床上通常用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,ihc)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞中cd10的表達(dá)狀況，其實(shí)驗(yàn)方法的核心為特異性結(jié)合cd10的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個(gè)檢測(cè)的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對(duì)cd10蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗cd10蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗cd10單克隆抗體和應(yīng)用，提高所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗與cd10蛋白的結(jié)合特異性并應(yīng)用到相關(guān)產(chǎn)品的制備中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

抗cd10蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，保藏編號(hào)為cgmccno：13286。

本發(fā)明所述抗cd10蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞由以下方法制備獲得：

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)cd10orf核苷酸序列(cd10orf核苷酸序列如seqidno.1所示，2250bp；cd10氨基酸序列如seqidno.2所示)設(shè)計(jì)引物，以origene公司產(chǎn)品cd10全長(zhǎng)質(zhì)粒rc224141為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增cd10的c末端411-750aa片段，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)ecori和xhoi，插入表達(dá)載體pet-23a(+)(novagen公司,貨號(hào)69745-3)，構(gòu)建cd10重組表達(dá)質(zhì)粒pet-23a/rcd10；

(2)cd10重組蛋白的表達(dá)與純化：將cd10重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入e.coli，擴(kuò)增培養(yǎng)后裂解離心取上清，his親和層析柱純化，獲得純化的cd10重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的cd10重組蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗cd10特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株；通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基制備抗體，通過(guò)親和層析柱純化獲得cd10單克隆抗體。通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

經(jīng)過(guò)上述方法制備后，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗cd10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為umab235，亞型鑒定為igg1，并于2016年11月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno：13286。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗cd10蛋白單克隆抗體，由保藏編號(hào)為cgmccno：13286的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。制備抗cd10蛋白單克隆抗體可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法，如通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基制備抗體，通過(guò)親和層析柱純化獲得cd10單克隆抗體。

本發(fā)明所述保藏編號(hào)為cgmccno：13286的雜交瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定，其分泌產(chǎn)生的抗cd10蛋白單克隆抗體為igg1型，效價(jià)較高。所述單克隆抗體的蛋白印記(western-blot)檢測(cè)結(jié)果顯示在k562，ramos和raji細(xì)胞中的cd10蛋白。

同時(shí)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，其能夠特異性識(shí)別腎透明細(xì)胞癌組織、乳腺癌組織、淋巴瘤組織、正常扁桃體和腎組織中的cd10蛋白。

此外，采用origene高密度蛋白芯片檢測(cè)所述單抗的特異性試驗(yàn)表明，本發(fā)明所述單克隆抗體與近10000種其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

因此，本發(fā)明還提供了保藏編號(hào)為cgmccno：13286的的雜交瘤細(xì)胞在制備抗cd10蛋白單克隆抗體中的應(yīng)用以及所分泌的抗cd10蛋白單克隆抗體在制備檢測(cè)cd10蛋白的免疫檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述免疫檢測(cè)產(chǎn)品為試劑盒、試紙或芯片。

本發(fā)明還提供一種免疫組化檢測(cè)的試劑盒，包括保藏編號(hào)為cgmccno：13286的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗cd10蛋白單克隆抗體。所述免疫檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)腫瘤組織及其微環(huán)境中cd10的表達(dá)狀況。

此外，本發(fā)明還提供保藏編號(hào)為cgmccno：13286的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗cd10蛋白單克隆抗體在制備標(biāo)記腫瘤組織及其微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述腫瘤包括腎透明細(xì)胞癌、淋巴瘤和乳腺癌。

本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞可穩(wěn)定分泌產(chǎn)生抗cd10蛋白單克隆抗體，且與cd10蛋白特異性結(jié)合，而與蛋白芯片上近10000種其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，顯著提高了cd10蛋白免疫檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，廣泛適用于各種腫瘤組織及其微環(huán)境中cd10的檢測(cè)。

生物保藏信息說(shuō)明

umab235，分類命名為cd10單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，于2016年11月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno：13286。

附圖說(shuō)明

圖1所示為實(shí)施例1中克隆位點(diǎn)圖；

圖2所示為實(shí)施例2中cd10蛋白sds-page結(jié)果圖；

圖3所示為實(shí)施例4中cd10蛋白蛋白印記western-blot結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗，1:500)；

圖4所示實(shí)施例5腎透明細(xì)胞癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗，1:600)；

圖5所示實(shí)施例5淋巴瘤組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗，1:600)；

圖6所示實(shí)施例5乳腺癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗，1:600)；

圖7所示實(shí)施例5人正常扁桃體組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗，1:600)；

圖8所示實(shí)施例5人正常腎組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗，1:600)；

圖9所示實(shí)施例6origene蛋白芯片鑒定結(jié)果圖(一抗為umab235分泌產(chǎn)生的cd10單抗,1:100；二抗為alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠igg，1:500)。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明公開(kāi)了抗cd10蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗cd10單克隆抗體和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

下面就本發(fā)明提供的抗cd10蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗cd10單克隆抗體和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：cd10重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)cd10的全長(zhǎng)cdna序列模板rc224141(origene公司產(chǎn)品，貨號(hào)rc224141)，針對(duì)其c端411-750aa片段設(shè)計(jì)兩條引物并分別引入酶切位點(diǎn)ecori和xhoi，克隆入表達(dá)載體pet-23a(+)(novagen公司,貨號(hào)69745-3)，建立cd10的c末端片段411-750aa蛋白的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序確定重組質(zhì)粒的正確性?？寺∥稽c(diǎn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

實(shí)施例2：cd10重組蛋白的表達(dá)與純化

1、轉(zhuǎn)化e.coli感受態(tài)細(xì)菌：取一個(gè)1.5ml離心管，加入100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，置冰上：加入2ul質(zhì)粒pet-23a/rcd10，用移液器輕柔混勻。冰上靜置20min；42℃水浴中熱激90秒，然后迅速置冰上3～5min；加入1mllb液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)(180rpm)1小時(shí)；取100ul菌液，至含有抗生素amp的lb固體培養(yǎng)基上，涂布均勻；待菌液被培養(yǎng)基吸收后，37℃倒置培養(yǎng)12～16小時(shí)，菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)，取出，然后挑單菌落菌株于5mllb(amp+)挑上述單菌落菌株于5mllb(amp+)培養(yǎng)基220rpm培養(yǎng)8小時(shí)后轉(zhuǎn)移至1升lb(amp+)培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到od280＝0.6后加入iptg至終濃度為0.25mm誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)4度200rpm振蕩培養(yǎng)12～14小時(shí)后，4度離心菌液，收集菌體沉淀。

2、蛋白純化：將上步收集的菌體沉淀用pbs緩沖液重選并進(jìn)行超聲破碎(超聲探頭為6ф，功率為400w，全程工作時(shí)間30min,每個(gè)循環(huán)超聲3秒間隔5秒)，離心(12000rpm,5min)，收集上清，并按照novagen公司蛋白純化方法進(jìn)行純化(novagen,ni-ntahis-bindresin試劑盒，貨號(hào)：70666-5)，收獲得到純化的帶his標(biāo)簽的重組蛋白rcd10/411-750aa。

3、純化蛋白鑒定：純化后的重組cd10的c端411-750片段蛋白用sds-page鑒定，見(jiàn)圖2。

由圖2結(jié)果可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)his親和層析柱純化，得到高純度的cd10重組蛋白。

實(shí)施例3：抗cd10單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其單克隆抗體的制備篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用重組產(chǎn)生的純化的全長(zhǎng)cd10重組蛋白rcd10/411-750aa(以下簡(jiǎn)稱為cd10抗原)用于對(duì)b6/c57小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫。具體方法如下：

1、動(dòng)物免疫：經(jīng)過(guò)純化的cd10抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測(cè)定血清效價(jià)；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用balb/c來(lái)源的sp2/0，融合時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養(yǎng)基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、篩選和克?。喝诤?-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用純化的cd10重組蛋白進(jìn)行elisa測(cè)試。標(biāo)記細(xì)胞株號(hào)。對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測(cè)定elisa值，挑取od280陽(yáng)性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至elisa測(cè)定96孔板全板結(jié)果為陽(yáng)性。挑取陽(yáng)性值高的單克隆定株。其對(duì)應(yīng)融合板細(xì)胞株為umab235。

4、細(xì)胞上清單抗的制備與純化：將細(xì)胞株umab235用含15％血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，擴(kuò)培至約4×10⁷個(gè)時(shí)，800rpm離心5min，棄上清并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2l轉(zhuǎn)瓶中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度約為3×10⁵個(gè)/ml。繼續(xù)培養(yǎng)1～2周后，當(dāng)細(xì)胞死亡率達(dá)到60％-70％時(shí)(此時(shí)細(xì)胞密度大概為1-2×10⁶個(gè)/ml)，收取細(xì)胞懸液6000rpm高速離心20min，取上清，親和層析法進(jìn)行上清純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，細(xì)胞株umab235產(chǎn)生的單抗亞型為igg1，采用proteing進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y(cè)定、分裝(100ul/管，濃度為1mg/ml)、保存在4-8℃。

實(shí)施例4：cd10單克隆抗體umab235為一抗的蛋白印記(western-blot，以下簡(jiǎn)稱wb)檢測(cè)

(1)、實(shí)驗(yàn)方法：

1、準(zhǔn)備細(xì)胞：準(zhǔn)備k562,hl-60,ramos和raji細(xì)胞(均購(gòu)買自atcc)，培養(yǎng)于含5％co2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2、制備細(xì)胞裂解液：將上述細(xì)胞消化，水平離心機(jī)800-1000rpm/5min離心,pbs洗2次，細(xì)胞沉淀用pbs定容到400ul-ep管，加入細(xì)胞裂解液，冰浴裂解20分鐘后，12000rpm離心10分鐘，收集上清加入5xloadingbuffer稀釋成1x作為細(xì)胞裂解液，-80℃存儲(chǔ)備用。

3、sds-page電泳：恒壓180v50min溴酚蘭至凝膠底部。

4、轉(zhuǎn)膜：提前用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡nc膜與濾紙，三明治形式置于濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，順序?yàn)椋弘姌O(-)-海綿-濾紙-凝膠-nc膜-濾紙-電極(+)，一定要保證膠在下膜在上，即凝膠靠近負(fù)極。恒流600ma,45分鐘。

5、染色：用立春紅s染色2min，用蒸餾水清洗，至marker條帶顯出，用圓珠筆做好標(biāo)記。蒸餾水沖洗膜。

6、封閉：用封閉液(含5％脫脂奶的tbst)浸沒(méi)nc膜并置于37℃孵育1小時(shí)。

7、一抗孵育：將nc膜置于pr鼠單抗umab235(以封閉液將抗體稀釋500倍)中，37℃溫箱孵育1小時(shí)后，再用15mltbst洗膜15min*3次。(根據(jù)容器大小可調(diào)整tbst用量)

8、二抗孵育：將nc膜置于hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗(jackson，catlogno.115-035-146；1：5000)中，室溫?fù)u床孵育1小時(shí)后，tbst洗膜5次，15min/次。

9、底物曝光：魯米諾和雙氧水1：1混勻后加在nc膜上(1ml/膜),壓上x(chóng)射線膠片曝光，然后將膠片進(jìn)行顯影和定影(暗室中可根據(jù)膠片上的熒光估算艷片時(shí)間)。

10、根據(jù)陰性，陽(yáng)性，空白對(duì)照來(lái)進(jìn)行結(jié)果分析和判定，見(jiàn)圖3。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖3結(jié)果可見(jiàn)，cd10鼠單抗umab235(1:500)能檢測(cè)到k562,ramos和raji細(xì)胞中cd10蛋白，分子量大小與預(yù)期相符，而在hl-60和jurkat細(xì)胞中則沒(méi)有相應(yīng)大小的條帶，表明umab235能檢測(cè)到cd10蛋白的特異性表達(dá)。

實(shí)施例5：umab235分泌產(chǎn)生的單克隆抗體為一抗的免疫組化檢測(cè)

(1)、實(shí)驗(yàn)方法：

1、分別取腎透明細(xì)胞癌、bukitt淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤、乳腺癌、正常扁桃體和腎組織塊進(jìn)行石蠟包埋，使用sakura組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為4μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無(wú)水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復(fù)液(1mmedta,ph9.0的10mmtris-hcl緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)2.5min，待高壓鍋溫度降至約90℃時(shí)，打開(kāi)高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過(guò)氧化氫滅活組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入cd10單抗(umab235分泌產(chǎn)生)，稀釋比1:600，使用封閉液進(jìn)行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加聚合物hrp染色試劑盒中試劑pv8000(購(gòu)買自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)pv-8000)，37℃孵育15分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹(shù)膠封片。

11、鏡檢，見(jiàn)圖4、圖5、圖6、圖7和圖8。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖4結(jié)果可見(jiàn)，cd10蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織的腫瘤細(xì)胞呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示腫瘤細(xì)胞。

由圖5結(jié)果可見(jiàn)，cd10蛋白在淋巴瘤組織中的淋巴細(xì)胞上呈特異性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，如圖箭頭所示淋巴瘤細(xì)胞。

由圖6結(jié)果可見(jiàn)，cd10蛋白在乳腺癌組織的肌上皮細(xì)胞呈特異性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，如圖箭頭所示肌上皮細(xì)胞。

由圖7結(jié)果可見(jiàn)，cd10蛋白在正常扁桃體組織中的淋巴細(xì)胞上呈特異性細(xì)胞膜表達(dá)，如圖箭頭所示淋巴細(xì)胞。

由圖8結(jié)果可見(jiàn)，cd10蛋白在正常腎組織中的腎小管和腎小球細(xì)胞上呈特異性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，如圖箭頭所示組織細(xì)胞。

結(jié)果表明本發(fā)明umab235產(chǎn)生的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別腎透明細(xì)胞癌、淋巴瘤組織、乳腺癌、正常扁桃體和腎組織中的cd10蛋白。

實(shí)施例6：umab235分泌產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性蛋白芯片檢測(cè)

origene高密度蛋白芯片上包含10000個(gè)hek293t細(xì)胞蛋白過(guò)表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個(gè)拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過(guò)excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個(gè)亞矩陣，每個(gè)亞矩陣上有一些參照，通過(guò)參照，可以定量每個(gè)芯片點(diǎn)上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽(yáng)性信號(hào)的方向。以下為使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片進(jìn)行umab235分泌產(chǎn)生的單克隆抗體鑒定實(shí)驗(yàn)的方法：

1、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤(rùn)芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mlpbst平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50ml離心管中加入40ml5％脫脂牛奶(用pbst進(jìn)行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗umab235，稀釋比列為1：100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片nc膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤(rùn)芯片nc膜，直至整張nc膜浸潤(rùn)在一抗溶液中。整個(gè)操作過(guò)程避免產(chǎn)生氣泡。將芯片移到4℃環(huán)境下，靜置，一抗孵育過(guò)夜。在芯片上加蓋培養(yǎng)皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長(zhǎng)時(shí)間孵育導(dǎo)致抗體蒸發(fā)。

6、第二天將芯片移至50ml離心管中，使用pbst漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠igg，稀釋比例為1：500。

8、按照上述步驟4，步驟5進(jìn)行二抗孵育操作。室溫孵育1小時(shí)。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發(fā)生信號(hào)漂白。

9、按照上述步驟6，使用pbst洗滌芯片。

10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。

11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。

12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號(hào)。

13、根據(jù)bsa-cy3以及bsa-cy5確定芯片方向以及陽(yáng)性信號(hào)的位點(diǎn)。

14、根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)位點(diǎn)找出對(duì)應(yīng)蛋白裂解液id，根據(jù)裂解液數(shù)據(jù)庫(kù)信息，查找到對(duì)應(yīng)蛋白名稱，ncbi錄入號(hào)(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9結(jié)果顯示，在蛋白芯片上的cd10蛋白與umab235分泌產(chǎn)生的單克隆抗體特異性結(jié)合，而與其他蛋白無(wú)任何結(jié)合信號(hào)，表明本發(fā)明所述單抗umab235能特異性識(shí)別cd10蛋白，而與其他近10000種蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110>無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗cd10蛋白單克隆抗體及其用途

<210>1

<211>2250

<212>dna

<213>人工序列

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