本發(fā)明涉及一種提高淀粉分支酶在大腸桿菌中胞外分泌表達(dá)的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

淀粉分支酶(branchingenzyme；be；ec2.4.1.18)是一種屬于糖苷水解酶家族13的糖基轉(zhuǎn)移酶，是合成糖原及支鏈淀粉的關(guān)鍵酶。經(jīng)淀粉分支酶改性的淀粉具有高支化的特點(diǎn)，因此在食品、醫(yī)藥等工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

淀粉分支酶主要來(lái)源于植物，而微生物來(lái)源的淀粉分支酶又通常是胞內(nèi)酶，天然菌產(chǎn)酶能力低下，嚴(yán)重制約了該酶的發(fā)展應(yīng)用。為了克服這一缺陷，通過(guò)構(gòu)建基因工程菌實(shí)現(xiàn)酶的胞外過(guò)量表達(dá)是行之有效的途徑之一。通過(guò)大腸桿菌bl21(de3)表達(dá)的geobacillusthermoglucosidans淀粉分支酶，所得淀粉分支酶基本都在胞內(nèi)，一直未能實(shí)現(xiàn)大量的胞外分泌表達(dá)，需提從胞內(nèi)提取淀粉分支酶，不可避免地需要破壁，而破壁成本高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于淀粉分支酶的胞內(nèi)表達(dá)需破壁，工藝復(fù)雜；胞外表達(dá)酶活較低。針對(duì)這一問(wèn)題提出一種提高淀粉分支酶在大腸桿菌中胞外分泌表達(dá)的方法，通過(guò)兩階段變溫誘導(dǎo)提高淀粉分支酶的胞外產(chǎn)量。

本發(fā)明技術(shù)方案主要包括以下步驟：

(1)將來(lái)源于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(geobacillusthermoglucosidans)的成熟淀粉分支酶基因連接質(zhì)粒pet-20b(+)的t7啟動(dòng)子下游，構(gòu)建表達(dá)載體e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)并轉(zhuǎn)化宿主菌e.colibl21，得到基因工程菌e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)。

(2)將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)，接種入tb培養(yǎng)基發(fā)酵，37℃下培養(yǎng)至發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷，繼續(xù)37℃培養(yǎng)12h，然后降溫至25℃培養(yǎng)12h；或者在加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷后，調(diào)節(jié)溫度至25℃培養(yǎng)12h，再調(diào)節(jié)溫度為30℃或37℃培養(yǎng)12h；或者在加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷后，調(diào)節(jié)溫度至30℃培養(yǎng)8～16h，再調(diào)節(jié)溫度為25℃培養(yǎng)8～16h。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過(guò)多階段溫度控制策略提高淀粉分支酶的胞外酶活，相對(duì)于優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，成本更低；獲得較高的胞外酶活(48.2u/ml)后，避免了菌體破壁，降低了工業(yè)成本；淀粉分支酶產(chǎn)量的提高更利于高支化淀粉的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為在20℃、25℃、30℃、37℃恒溫誘導(dǎo)溫度下的分支酶的胞外分泌(a)與菌體生長(zhǎng)(b)情況，其中■：20℃；○：25℃；▲：30℃；▽:37℃。

圖2為在兩階段不同誘導(dǎo)溫度下分支酶的胞外分泌情況，其中a(×)：25℃升溫至30℃(實(shí)施例3)；b(●):25℃升溫至37℃(實(shí)施例4)；c(▲)：30℃降溫至25℃(實(shí)施例5)；d(◆):37℃降溫至25℃(實(shí)施例6)。

圖3為在不同時(shí)間變溫后分支酶的胞外分泌情況，其中a(×)：30℃誘導(dǎo)12h降溫至25℃后繼續(xù)誘導(dǎo)12h(實(shí)施例5)；b(●):30℃誘導(dǎo)24h降溫至25℃后繼續(xù)誘導(dǎo)12h(實(shí)施例7)；c(▲)：30℃誘導(dǎo)36h降溫至25℃后繼續(xù)誘導(dǎo)12h(實(shí)施例8)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

淀粉分支酶酶活力測(cè)定方法:用50mmol/l磷酸緩沖液(ph7.5)配制0.25％(w/v)馬鈴薯支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.9ml底物，加入0.1ml發(fā)酵上清液，在50℃下反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶10min，并以10000r/min離心2min待顯色用，空白為滅活后的酶。顯色體系為0.3ml反應(yīng)上清液與5.0ml顯色液(0.05％(w/v)ki，0.005％(w/v)i2，ph7.5)于7ml離心管中混合，顯色15min后在530nm處測(cè)定吸光值。

淀粉分支酶酶活定義：常溫下在530nm處，吸光值每分鐘降低1％為一個(gè)酶活單位。

實(shí)施例2

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，分別在20℃、25℃、30℃、37℃溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)。在20℃、25℃、30℃、37℃誘導(dǎo)溫度下的分支酶的胞外酶活與菌體生長(zhǎng)情況如圖1所示。結(jié)果表明發(fā)酵時(shí)間為12h時(shí)，30℃條件下的酶活最大；進(jìn)一步發(fā)酵至24h時(shí)，25℃條件下的酶活最大，而20℃和37℃均不利于酶的分泌；因此，在25℃恒溫發(fā)酵24h時(shí)，酶活最高可達(dá)到19.9u/ml。

實(shí)施例3

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溫度至25℃誘導(dǎo)12h后，升高溫度至30℃繼續(xù)誘導(dǎo)12h。結(jié)果如圖2a所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸增長(zhǎng)，變溫誘導(dǎo)24h后獲得最高酶活37.4u/ml。

實(shí)施例4

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溫度至25℃誘導(dǎo)12h后，升高溫度至37℃繼續(xù)誘導(dǎo)12h。結(jié)果如圖2b所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸增長(zhǎng)，在誘導(dǎo)18h后有所降低，因此最高酶活為28.4u/ml。

實(shí)施例5

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溫度至30℃誘導(dǎo)12h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導(dǎo)12h。結(jié)果如圖2c所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸增長(zhǎng)，變溫誘導(dǎo)24h后獲得最高酶活48.2u/ml。

實(shí)施例6

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，繼續(xù)37℃誘導(dǎo)12h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導(dǎo)12h。結(jié)果如圖2d所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸增長(zhǎng)，變溫誘導(dǎo)24h后獲得最高酶活45.9u/ml。

實(shí)施例7

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溫度至30℃誘導(dǎo)8h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導(dǎo)16h。結(jié)果如圖3b所示，在誘導(dǎo)8h變溫后，酶活逐漸增長(zhǎng)速率加快后有所減慢，最高酶活為42.6u/ml。

實(shí)施例8

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進(jìn)行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達(dá)到0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溫度至30℃誘導(dǎo)16h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導(dǎo)8h。結(jié)果如圖3c所示，在誘導(dǎo)16h變溫后，酶活逐漸增長(zhǎng)速率加快，最高酶活為40.2u/ml。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。