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      耐脂肪酸干擾的抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):11400608閱讀:351來源:國知局
      耐脂肪酸干擾的抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制造方法與工藝

      本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種抗干擾能力強(qiáng)的抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      急性冠狀動(dòng)脈綜合征是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲,繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征,包括不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,ami)。ami是心血管疾病的主要類型,近十年來,我國ami的發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì),已接近國際平均水平。ami起病突然,急性期死亡率約為30%,其誘發(fā)原因主要是為心臟供血的冠狀動(dòng)脈堵塞,導(dǎo)致由其供血的心肌細(xì)胞缺血發(fā)生變性壞死。目前,國際上治療ami的最佳方法是早期快速確診并進(jìn)行急性冠狀動(dòng)脈介入治療。

      心電圖的觀察是診斷ami的常用手段,但對(duì)于那些心電圖正常的ami患者,選擇一種合適的生化指標(biāo)來診斷ami是十分必要的。目前常用的診斷標(biāo)志物有肌紅蛋白(myoglobin,myo)、心肌肌鈣蛋白i(caidiactroponini,ctni)和肌酸激酶同工酶(creatinekinaseisoenzyme-mb,ck-mb)。但是myo指標(biāo)不能區(qū)分骨骼肌損傷和心肌損傷;而ctni指標(biāo)雖然特異性高,但在ami發(fā)生6-8小時(shí)后濃度才明顯上升;ck-mb指標(biāo)也存在特異性差,對(duì)心肌微小損傷不敏感等缺點(diǎn)。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-typefattyacidbindingprotein,h-fabp)則克服了以上缺點(diǎn),對(duì)于早期診斷ami具有很好的特異性和敏感性,成為目前國內(nèi)外研究較多的ami早期診斷指標(biāo)。

      h-fabp是一種由132個(gè)氨基酸組成的可溶性胞質(zhì)蛋白,分子量約為15kda[1]。h-fabp特異地大量存在于心肌組織中,占心臟全部可溶性蛋白的4%-8%,在骨骼肌、腎小管、腦組織、乳腺、胎盤組織中也有少量分布。h-fabp能夠與心肌中的長鏈脂肪酸結(jié)合,為心肌收縮提供能量[2]。正常人的血漿和尿中不含或含有極低含量的h-fabp,而當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷后,h-fabp迅速釋放至血液中,損傷后1-3小時(shí)就可以檢測(cè)到其存在,6-8小時(shí)血液中的濃度達(dá)到峰值,12-24小時(shí)后又可以恢復(fù)正常[3,4],其動(dòng)力學(xué)與myo一致,但特異性更高。因此,h-fabp可以作為ami早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一種優(yōu)秀的生化指標(biāo)[5,6]。

      釋放到血液中的h-fabp大部分處于與長鏈脂肪酸結(jié)合的狀態(tài)。但在制備診斷用單克隆抗體時(shí),用來免疫動(dòng)物和篩選抗體的抗原均為重組表達(dá)的h-fabp蛋白,因此所得單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)可能位于脂肪酸結(jié)合區(qū)。由于血液中h-fabp分子上的抗體識(shí)別位點(diǎn)已被脂肪酸占據(jù),無法被這些單克隆抗體所識(shí)別,因此基于這些單克隆抗體制備診斷試劑經(jīng)常會(huì)得到假陰性的診斷結(jié)果。本領(lǐng)域迫切需要一種能夠耐受脂肪酸干擾的抗h-fabp單克隆抗體,從而開發(fā)準(zhǔn)確度高的診斷試劑。

      參考文獻(xiàn):

      [1]karthikviswanathan,alistairshall,julianhbarth.anevidence-basedapproachtotheassessmentofheart-typefattyacidbindingproteininacutecoronarysyndrome.clinbiochemrevvol33february2012:3-11.

      [2]劉洪梅,黃體鋼.心型脂肪酸結(jié)合蛋白在臨床診斷中的研究進(jìn)展[j].實(shí)用心腦肺血管病雜志,2006,14(5):417-418

      [3]hsubg,chenyc,leerp,leecc,leecj,wangjh.fastingserumleveloffattyacidbindingprotein4positivelycorrelateswithmetabolicsyndromeinpatientswithcoronaryarterydisease.circulationjournal2010;74:327-331.

      [4]ozcanruzgar,ahmetkayabilge,zehrabugra,sabahattinumman,ercumentyilmaz,besteozben,berrinumman,mehmetmeric.theuseofhumanheart-typefattyacid-bindingproteinasanearlydiagnosticbiochemicalmarkerofmyo-cardialnecrosisinpatientswithacutecoronarysyndrome,anditscomparisonwithtroponin-tandcreatinekinase-myocardialband.heartvessels2006;21:309-314.

      [5]conorj.mccann,benm.glover,lanb.a.menown,michaelj.moore,janemceneny,columg.owen,berniesmith,peterc.sharpe,lans.young,jennifera.adgey.novelbiomarkersinearlydiagnosisofacutemyocardialinfarctioncomparedwithcardiactroponint.europeanheartjournal(2008)29,2843-2850.

      [6]呂嬌鳳,謝愛民,姚全良.心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白定性檢測(cè)對(duì)急性心肌梗死早期診斷的價(jià)值[j].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(4):647-649.



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足,本發(fā)明提供一種耐脂肪酸干擾的抗人h-fabp蛋白單克隆抗體,還提供了分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,及該單克隆抗體及其特異性抗原的應(yīng)用。

      本發(fā)明的目的之一在于提供一株分泌抗人h-fabp蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分類命名為雜交瘤細(xì)胞株fp1,于2016年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址為中國武漢大學(xué),其保藏編號(hào)為cctccno:c2016199。

      本發(fā)明目的之二在于提供由所述的雜交瘤細(xì)胞株fp1分泌的耐脂肪酸干擾的抗人h-fabp蛋白單克隆抗體fp1。

      本發(fā)明所述的單克隆抗體fp1屬于igg1亞型。

      本發(fā)明所述的單克隆抗體fp1結(jié)合位點(diǎn)位于h-fabp蛋白的脂肪酸結(jié)合區(qū)域之外。

      本發(fā)明所述的單克隆抗體fp1親和力為1×10-10–1×10-13m。

      本發(fā)明目的之三在于提供一種組合物,包括本發(fā)明所述的抗體fp1,和藥學(xué)上的常用輔料。

      本發(fā)明目的之四在于提供所述的單克隆抗體fp1在制備心肌梗死診斷或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

      本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體fp1在制備心肌梗死早期診斷或輔助診斷試劑中的應(yīng)用。

      本發(fā)明目的之五在于提供包含所述的單克隆抗體fp1的h-fabp早期檢測(cè)、心肌梗死診斷或檢測(cè)試劑盒。

      所述的試劑盒是膠乳免疫比濁法的診斷試劑盒。

      本發(fā)明目的之六在于提供所述的單克隆抗體fp1在制備治療心肌梗死的藥物或抗心肌梗死研究生物制劑中的應(yīng)用。

      本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體fp1的特異性抗原作為靶點(diǎn)在制備治療心肌梗死的藥物或抗心肌梗死研究生物制劑中的應(yīng)用。

      本發(fā)明的有益效果:

      本發(fā)明提供一株能穩(wěn)定分泌高效價(jià)抗人h-fabp蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株fp1,該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體具有良好的親和力和特異性,能夠避免血液中脂肪酸所帶來的干擾,可以作為h-fabp早期檢測(cè)的關(guān)鍵原料。為建立快速、靈敏檢測(cè)h-fabp的包括免疫金標(biāo)、酶聯(lián)免疫試劑、免疫比濁法等臨床診斷試劑提供重要原料。

      本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞株fp1是一株可穩(wěn)定高效的產(chǎn)生耐脂肪酸干擾的抗人h-fabp蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

      本發(fā)明提供的由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的耐脂肪酸干擾的抗人h-fabp蛋白單克隆抗體,其亞類屬于igg1,它具有以下特性:(a)特異性地與h-fabp蛋白結(jié)合,且結(jié)合位點(diǎn)位于h-fabp蛋白的脂肪酸結(jié)合區(qū)域之外,與脂肪酸結(jié)合狀態(tài)和非脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白親和力相同,并且(b)所述單克隆抗體親和力為1×10-10–1×10-13m。它的制備方法包括以下步驟:

      (a)用重組h-fabp蛋白免疫小鼠;

      (b)將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,獲得雜交瘤細(xì)胞;

      (c)從步驟(b)中的雜交瘤細(xì)胞中選出能夠分泌對(duì)重組h-fabp蛋白效價(jià)為1:106以上的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞;

      (d)從步驟(c)中的雜交瘤細(xì)胞中選出能夠分泌對(duì)非脂肪酸結(jié)合狀態(tài)和脂肪酸結(jié)合狀態(tài)h-fabp蛋白具有相同親和力的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞;

      (e)從步驟(d)的雜交瘤細(xì)胞中制得單克隆抗體。

      本發(fā)明所述抗體可檢測(cè)血液中pg/ml級(jí)的h-fabp(如200pg/ml的h-fabp分子)蛋白,具有極高的檢測(cè)靈敏度。

      與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:

      1.本發(fā)明最終獲得了能穩(wěn)定分泌耐脂肪酸干擾的抗人h-fabp蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株fp1,該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體對(duì)血清中的天然h-fabp蛋白的效價(jià)高達(dá)1:106,對(duì)重組h-fabp蛋白的親和力達(dá)到1×10-13m,且該單克隆抗體具有良好的特異性,能夠有效識(shí)別脂肪酸結(jié)合狀態(tài)和非脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白。

      2.該單克隆抗體具有良好的溫度穩(wěn)定性,37℃保存長達(dá)8天效價(jià)不下降,可以作為準(zhǔn)確檢測(cè)血液中h-fabp含量的體外診斷試劑盒的關(guān)鍵原料。

      3.采用該h-fabp單克隆抗體作為原料制備的檢測(cè)h-fabp抗原含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)血液中h-fabp的含量,靈敏度達(dá)到200pg/ml,且能夠耐受血液中脂肪酸的干擾。為今后國內(nèi)h-fabp定量快速檢測(cè)試劑的發(fā)展的打下良好的基礎(chǔ),對(duì)我國心肌損傷疾病早期診斷試劑的研發(fā)具有重要意義。

      附圖說明

      圖1為重組h-fabp蛋白純化后鑒定結(jié)果圖,lanem:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品;lane1:離心上清;lane2:his-taq柱純化后的蛋白;lane3:分子篩層析純化后的蛋白。

      圖2為單克隆抗體fp1十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果圖,lanem:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);lane1:純化前腹水(還原劑處理的樣品);lane2:純化后單克隆抗體(還原劑處理的樣品);lane3:純化前腹水(未加還原劑);lane4:純化后單克隆抗體(未加還原劑)。

      圖3為單克隆抗體fp1免疫特異性鑒定結(jié)果圖,lanem:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);lane1:重組h-fabp蛋白;lane2:人血清。

      圖4為間接elisa法測(cè)定抗h-fabp單克隆抗體fp1的效價(jià)。

      圖5為抗h-fabp單克隆抗體fp1的穩(wěn)定性檢測(cè)。

      圖6為h-fabp膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)試劑盒的校準(zhǔn)曲線。附圖中各部件的標(biāo)記如下:a圖是實(shí)施例7中制備的h-fabp膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)試劑盒的校準(zhǔn)曲線;b圖是實(shí)施例8中制備的h-fabp膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)試劑盒的校準(zhǔn)曲線.

      圖7為h-fabp膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)試劑盒抗干擾實(shí)驗(yàn)。附圖中各部件的標(biāo)記如下:a圖是實(shí)施例7中制備的h-fabp膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)試劑盒的抗脂肪酸干擾實(shí)驗(yàn);b圖是實(shí)施例8中制備的h-fabp膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)試劑盒的抗脂肪酸干擾實(shí)驗(yàn)。

      具體實(shí)施方式

      下面結(jié)合附圖通過具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明,以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解,從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定,但并不是對(duì)本發(fā)明的限制,僅作示例說明。下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,均按照常規(guī)條件,如sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(coldspringharborlaboratorypress,2001)中所述的條件,或者按照制造廠商所建議的條件執(zhí)行。

      實(shí)施例1重組h-fabp蛋白的表達(dá)純化和純度鑒定

      將含有h-fabp基因序列的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),用lb平板培養(yǎng)。從平板上挑取單菌落接種lb培養(yǎng)基中,擴(kuò)大培養(yǎng)后,在菌液od600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入終濃度為1mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。4小時(shí)后離心收集菌體,超聲破碎細(xì)菌后離心收集上清。上清用his-taq柱和分子篩層析柱純化,收集樣品并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定蛋白純度。

      電泳后從凝膠上觀察到分子量為15kda左右的目的蛋白條帶(圖1),h-fabp重組蛋白的純度在95%以上,達(dá)到了制備單抗的純度要求。

      實(shí)施例2動(dòng)物免疫與血清效價(jià)檢測(cè)

      將濃度為1mg/ml純化的重組h-fabp蛋白與等量的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化,乳化方法采用雙注射器互推法。將6-8周無特定病原體級(jí)雌性balb/c小鼠以弗氏完全佐劑乳化的免疫抗原h(huán)-fabp對(duì)每只小鼠從跗關(guān)節(jié)處注射40μg抗原,2天后,用弗氏不完全佐劑乳化的免疫抗原h(huán)-fabp對(duì)每只小鼠再次從跗關(guān)節(jié)處注射40μg抗原。8天后,尾靜脈采血,離心取上清,以免疫前血清為陰性對(duì)照用間接elisa法檢測(cè)血清效價(jià),2次免疫后,百萬倍稀釋后血清效價(jià)已高達(dá)2.0以上(表1)。選取血清效價(jià)大于106的小鼠,頸椎脫臼處死后取小鼠淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

      表1間接elisa檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)

      實(shí)施例3細(xì)胞融合、陽性雜交瘤細(xì)胞篩選與亞克隆

      1.高效價(jià)雜交瘤細(xì)胞株的制備及篩選

      選擇生長狀態(tài)良好的sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠的淋巴細(xì)胞以1:2-1:3比例混合,以37℃預(yù)熱的peg1500作為融合劑。融合細(xì)胞置于含20%fbs血清的hat-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。5-7天后觀察融合效果并換液,換液3天后取細(xì)胞培養(yǎng)液。用臨床確診心肌梗死發(fā)生6-12小時(shí)內(nèi)病人的血清包被elisa板,該血清中含有高濃度的天然h-fabp蛋白,用間接elisa方法篩選陽性克隆,選擇陽性值與細(xì)胞數(shù)比值較高的細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆,最終得到多株能夠穩(wěn)定分泌抗h-fabp蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫。該雜交瘤細(xì)胞庫分泌的單克隆抗體與血液中天然h-fabp蛋白有很高的親和力。

      2.耐脂肪酸干擾的雜交瘤細(xì)胞株的篩選

      將濃度為1mg/ml純化的重組h-fabp蛋白與濃度為0.1mg/ml的脂肪酸混合物(購自sigma)混勻孵育,制備脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白。之后分別用純化的重組h-fabp蛋白和上述脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白分別包被elisa板。用含20%fbs血清的hat-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)上述雜交瘤細(xì)胞庫中的細(xì)胞,3天后取細(xì)胞培養(yǎng)液,用間接elisa方法分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的單克隆抗體與脂肪酸結(jié)合狀態(tài)和非脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白的相對(duì)親和力。選取與脂肪酸結(jié)合狀態(tài)和非脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白親和力相同,且親和力最高的單克隆細(xì)胞,最終得到一株能夠分泌耐脂肪酸干擾的抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為fp1。

      實(shí)施例4單克隆抗體的產(chǎn)生與純化

      取成年balb/c小鼠,腹腔注射無菌石蠟油0.5ml,7天后再向腹腔內(nèi)注入fp1雜交瘤細(xì)胞,細(xì)胞密度調(diào)整為1×106-2×106/ml,每只小鼠注射0.5ml。10-14天后開始采集腹水。將采集好的腹水按1:1體積比緩慢加入飽和硫酸銨初步純化,冰上攪拌30分鐘后在4℃下12000g離心10分鐘,棄上清。沉淀用一定體積pbs溶解后于20倍體積的bindingbuffer(proteinasefinosekit中提供)中透析,然后用proteina親和柱純化,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化效果。

      將純化前與純化后的腹水抗體制備蛋白樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。純化后的抗體在還原的膠上呈現(xiàn)分子量為50kda和25kda的重鏈和輕鏈,而在非還原膠上呈現(xiàn)分子量約為150kda的單一條帶(圖2)。這說明經(jīng)親和層析后單克隆抗體達(dá)到了較高的純度,可以用于進(jìn)一步的研究。

      實(shí)施例5單克隆抗體亞型、特異性及效價(jià)鑒定

      1.單克隆抗體亞型鑒定

      采用sinobiological公司的mousemonoclonalantibodyisotypingreagents鑒定單克隆抗體亞型,操作按說明書進(jìn)行。經(jīng)鑒定,制備的單克隆抗體為igg1亞型。

      2.單克隆抗體的特異性鑒定

      用臨床確診心肌梗死發(fā)生6-12小時(shí)內(nèi)病人的血清和純化的重組h-fabp蛋白分別進(jìn)行westernblotting實(shí)驗(yàn)鑒定fp1單克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示于病人血清中天然h-fabp蛋白及重組表達(dá)h-fabp蛋白處均可見抗h-fabp單克隆抗體fp1的特異結(jié)合條帶,且在其它位置沒有明顯雜帶(圖3),說明fp1單克隆抗體能夠特異性識(shí)別血液中的h-fabp蛋白,與血液中的其他抗原沒有非特異反應(yīng),適合用來檢測(cè)病人血液中h-fabp蛋白的含量,具有良好的特異性。

      3.單克隆抗體效價(jià)鑒定

      用濃度為1μg/ml的重組h-fabp蛋白包被elisa板,加入梯度稀釋的抗h-fabp單克隆抗體fp1。之后加入hrp-羊抗鼠二抗,用450/630nm雙波長檢測(cè),od值大于0.2則認(rèn)為該濃度的抗體能夠識(shí)別h-fabp抗原,此濃度值越低,親和力越高。結(jié)果表明抗h-fabp單克隆抗體fp1效價(jià)達(dá)到1:106以上(圖4)。

      4.單克隆抗體親和力測(cè)定

      用表面等離子體共振法(spr)在biacore3000儀器上測(cè)定fp1單克隆抗體的親和力。用10μg/ml的純化的重組h-fabp抗原包被cm5芯片,偶聯(lián)方式為edc/nhs化學(xué)偶聯(lián)抗原表面的伯氨基和芯片表面的羧基。加入梯度稀釋的抗h-fabp單克隆抗體fp1,測(cè)定fp1單克隆抗體與重組h-fabp蛋白的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)。經(jīng)過儀器附帶的軟件計(jì)算,fp1單克隆抗體的親和力達(dá)到0.1pm,即1×10-13m。結(jié)果表明,fp1單克隆抗體具有極高的親和力,能夠作為高靈敏度h-fabp檢測(cè)試劑盒的原料。

      實(shí)施例6單抗穩(wěn)定性的鑒定

      將純化后的單抗fp1分別置于-20℃、4℃和37℃環(huán)境中,濃度為1mg/ml,每24小時(shí)取樣一次,間接elisa檢測(cè)其免疫反應(yīng)活性的變化。結(jié)果顯示在-20℃、4℃和37℃孵育24小時(shí)后,效價(jià)無差別,超過8天后37℃組抗體的效價(jià)才開始有下降(圖5),說明單抗具有良好的溫度穩(wěn)定性。

      實(shí)施例7h-fabp含量檢測(cè)試劑盒的制備(膠乳增強(qiáng)免疫比濁法)

      本試劑盒包含雙試劑,試劑1為膠乳反應(yīng)緩沖液,試劑2為包被上述抗h-fabp單克隆抗體的膠乳顆粒。

      制備試劑1時(shí),稱取60.57mg的tris,116.88mg的nacl,100mg的peg6000,3.9mg的nan3溶于8ml的蒸餾水中,調(diào)節(jié)ph至7.5,定容至10ml。攪拌混勻,經(jīng)過0.22μm濾膜抽濾后,即得試劑1。

      制備試劑2時(shí),取0.1ml濃度為10%粒徑為300nm的聚苯乙烯膠乳(購自日本合成橡膠公司)于10ml離心管中,再向離心管中加入8.9ml0.1mmes緩沖溶液(ph5.0),混合均勻,得到稀釋膠乳溶液。準(zhǔn)確稱取0.51mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺用1ml0.1mhepes緩沖溶液(ph7.0)溶解,并將此溶液加入稀釋膠乳溶液中,震蕩混合均勻,并置于25℃恒溫?fù)u床上,200轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)30分鐘;將稀釋膠乳均分成兩份,分別加入0.5ml1mg/ml抗h-fabp單克隆抗體fp1和另一株抗h-fabp單克隆抗體fp5(來自南京諾唯贊生物科技有限公司),震蕩混合均勻,置于水平搖床上,室溫,200轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完成后,向兩稀釋膠乳中分別加入1ml10%濃度的bsa溶液,混合均勻,并置于37℃恒溫?fù)u床上,200轉(zhuǎn)/分鐘,反應(yīng)1小時(shí)。將上述體系于16000g,離心30分鐘,棄上清,將沉淀分別用5ml含50mmtris,ph7.0,50mmnacl,1‰nan3的緩沖液重懸。將兩膠乳溶液等體積混合后,超聲分散,即得試劑2。

      實(shí)施例8h-fabp含量檢測(cè)試劑盒的制備(膠乳增強(qiáng)免疫比濁法)

      本試劑盒包含雙試劑,試劑1為膠乳反應(yīng)緩沖液,試劑2為包被上述抗h-fabp單克隆抗體的膠乳顆粒。

      制備試劑1時(shí),稱取60.57mg的tris,116.88mg的nacl,100mg的peg6000,3.9mg的nan3溶于8ml的蒸餾水中,調(diào)節(jié)ph至7.5,定容至10ml。攪拌混勻,經(jīng)過0.22μm濾膜抽濾后,即得試劑1。

      制備試劑2時(shí),取0.1ml濃度為10%粒徑為300nm的聚苯乙烯膠乳(購自日本合成橡膠公司)于10ml離心管中,再向離心管中加入9.9ml50mmtris緩沖溶液(ph7.0),混合均勻,得到稀釋膠乳溶液。將稀釋膠乳均分成兩份,分別加入0.5ml1mg/ml抗h-fabp單克隆抗體fp1和另一株抗h-fabp單克隆抗體fp5(來自南京諾唯贊生物科技有限公司),震蕩混合均勻,置于水平搖床上,室溫,200轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完成后,向兩稀釋膠乳中分別加入1ml10%濃度的bsa溶液,混合均勻,并置于37℃恒溫?fù)u床上,200轉(zhuǎn)/分鐘,反應(yīng)1小時(shí)。將上述體系于16000g,離心30分鐘,棄上清,將沉淀分別用5ml含50mmtris,ph7.0,50mmnacl,1‰nan3的緩沖液重懸。將兩膠乳溶液等體積混合后,超聲分散,即得試劑2。

      實(shí)施例9h-fabp含量檢測(cè)試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)

      1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。稱取60.57mg的tris、87.66mg的nacl、186.12mg的edta·na2和100mg的bsa,溶于溶于8ml的蒸餾水中,調(diào)節(jié)ph值至7.5,定容至10ml,攪拌使其完全混勻,并經(jīng)過0.22μm濾膜抽濾,得到標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。用上述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解純化的重組h-fabp蛋白,制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、80ng/ml、160ng/ml)。用上述制備的兩種h-fabp含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品中h-fabp的含量。該方法為兩點(diǎn)終點(diǎn)法,采用日立7170生化分析儀測(cè)定,包括以下步驟:向10μl待檢測(cè)樣本(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品,空白以蒸餾水為樣品)中加入100μl的試劑1充分混勻,于37℃孵育5分鐘,再向混合體系中加入100μl試劑2,混勻,37℃恒溫1分鐘后,空白管調(diào)零,波長600nm,測(cè)定各管吸光度a1,4分鐘后測(cè)定各管吸光度a2。計(jì)算δa=a2-a1。根據(jù)多點(diǎn)校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)吸光度變化值δa,采用多點(diǎn)非線性校準(zhǔn)模式確定工作曲線,樣本吸光度變化在工作曲線上相對(duì)應(yīng)的濃度值即為測(cè)定濃度。

      采用上述制備的試劑盒及測(cè)量方法,采用日立7170生化分析儀測(cè)得的上述6種不同含量的h-fabp標(biāo)準(zhǔn)品的曲線(圖6),每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)含量的參考標(biāo)準(zhǔn)品,其中x軸表示h-fabp含量(ng/ml);y軸表示吸光度。本發(fā)明中的試劑盒測(cè)定實(shí)驗(yàn)是采用日立公司制造的7170全自動(dòng)生化儀進(jìn)行的,但本發(fā)明的試劑不限于上述儀器,還適用于其他全自動(dòng)、半自動(dòng)或手動(dòng)的生化分析儀。

      2.h-fabp檢測(cè)試劑盒靈敏度測(cè)定

      本實(shí)施例中測(cè)定了上述h-fabp檢測(cè)試劑盒的功能靈敏度,該指標(biāo)是體外診斷試劑性能評(píng)估中常用的靈敏度指標(biāo),是指試劑能夠準(zhǔn)確檢出的最低抗原濃度。用不含h-fabp的血清作為稀釋液,配制成含不同濃度的重組h-fabp蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0ng/ml,0.1ng/ml,0.2ng/ml,0.5ng/ml,1ng/ml,5ng/ml,10ng/ml),按照上述的實(shí)驗(yàn)條件,每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定20次,計(jì)算每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(cv),變異系數(shù)小于20%的濃度最低的點(diǎn)即為試劑的功能靈敏度。

      結(jié)果表明實(shí)施例7和8中制備的h-fabp檢測(cè)試劑盒的功能靈敏度均達(dá)到200pg/ml,能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出血液中微量的h-fabp蛋白,能夠準(zhǔn)確診斷出病人是否發(fā)生了心肌損傷。

      實(shí)施例10h-fabp含量檢測(cè)試劑盒干擾性實(shí)驗(yàn)

      將濃度為1mg/ml純化的重組h-fabp蛋白與濃度為0.1mg/ml的脂肪酸混合物(購自sigma)混勻孵育,制備脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白。用不含h-fabp的血清作為稀釋液,分別配制濃度為1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml和160ng/ml的重組h-fabp蛋白和脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白。按照實(shí)施例9中的實(shí)驗(yàn)條件,用實(shí)施例7和8中制備的h-fabp含量檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定各稀釋樣品的濃度。

      結(jié)果表明實(shí)施例7和8中制備的h-fabp含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定純化的重組h-fabp蛋白和脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白濃度的線性相關(guān)系數(shù)和回歸直線斜率均達(dá)到了0.99以上(圖7),說明用fp1單克隆抗體制備的h-fabp檢測(cè)試劑盒測(cè)定脂肪酸結(jié)合狀態(tài)和非脂肪酸結(jié)合狀態(tài)的h-fabp蛋白時(shí)沒有差異,試劑盒能夠耐受脂肪酸結(jié)合對(duì)h-fabp含量測(cè)定的干擾。

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