本發(fā)明涉及蛋白偶聯(lián)物，具體屬于一種合成特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的方法。

背景技術(shù)：

瘦肉精屬于飼料添加劑，可提高飼料的轉(zhuǎn)化率，增加動(dòng)物的瘦肉率，用量大、代謝慢，有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，150℃以上才會(huì)分解。人食用后，會(huì)漸漸中毒，產(chǎn)生異常生理反應(yīng)，嚴(yán)重影響健康。特布他林屬于兒茶酚型瘦肉精化合物。目前，采用4-氨基苯甲為聯(lián)結(jié)物，用1,4-丁二醇縮水甘油醚和對(duì)氨基苯甲酸將特布他林與bsa偶聯(lián)，制備特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物。此過(guò)程需要至少兩步合成，還需要4-氨基苯甲等多種反應(yīng)試劑，所以開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、低能耗、制備時(shí)間短、快捷方便的新方法是很有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種合成特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的方法，該方法應(yīng)低能耗、制備簡(jiǎn)單、時(shí)間短、方便快捷。

本發(fā)明以特布特林與bsa偶聯(lián)，制備特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物，有效地解決其繁瑣且高昂的合成過(guò)程。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種合成特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的方法，特征在于，包括如下步驟：

將bsa溶于pbs(ph＝6.0)緩沖液中，再加入特布他林，攪拌溶解，然后滴加甲醛溶液，室溫條件下攪拌反應(yīng)20-25小時(shí)，得反應(yīng)液；將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，將透析袋放入盛有蒸餾水的容器中，室溫?cái)嚢钘l件下透析3天；將透析產(chǎn)物經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心，收集上清液，真空冷凍干燥12小時(shí)，即得到特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物白色粉末。其中，特布他林、甲醛和bsa的摩爾比為10-30∶10-30∶1。

其反應(yīng)式如下：

上述步驟中的合成條件進(jìn)一步優(yōu)選為：

特布他林、甲醛和bsa的摩爾比為30∶30∶1。

室溫條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明的有益效果：本申請(qǐng)利用mannich反應(yīng)制備特布他林與牛血清白蛋白偶聯(lián)物，通過(guò)亞甲基直接將特布他林小分子與載體蛋白bsa相偶聯(lián)，有效避開(kāi)了繁瑣的設(shè)計(jì)和合成過(guò)程，簡(jiǎn)化了合成步驟，合成過(guò)程簡(jiǎn)單、時(shí)間短、成本低。同時(shí)本發(fā)明充分保留了特布他林的特征官能團(tuán)叔丁基，通過(guò)紫外光譜和紅外光譜等表征方法，證明特布他林與載體蛋白bsa偶聯(lián)成功，因此，所述偶聯(lián)物可用于食品中瘦肉精添加劑的免疫檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1特布他林、bsa和偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜

圖2特布他林、bsa和偶聯(lián)物的紅外光譜圖

圖3bsa、特布他林、偶聯(lián)物、特布他林與bsa混合液的熒光效果對(duì)比圖

圖4偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性檢測(cè)

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明，本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。

實(shí)施例1

將bsa(66.43mg,1μmol)溶于pbs(ph＝6.0)緩沖液中，再加入特布他林(8.23mg,30μmol)，攪拌溶解，然后滴加40％甲醛溶液(30μl)，室溫條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，得反應(yīng)液；將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，將透析袋放入盛有蒸餾水的燒杯中，室溫?cái)嚢钘l件下透析3天；將透析產(chǎn)物經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心，收集上清液，真空冷凍干燥12小時(shí)，即得到偶聯(lián)物白色粉末(26.3mg，產(chǎn)率：39.42％)。

將bsa、特布他林和偶聯(lián)物用pbs(ph＝6.0)分別配制成0.5mg/ml溶液備用。先用pbs緩沖溶液(ph＝6.0)在波長(zhǎng)220～400nm范圍內(nèi)基線平衡，然后分別掃描已配好的3份溶液，記錄在各波段波長(zhǎng)掃描的吸光度值。bsa的特征吸收峰在290nm處，最大吸光度值約為0.290；特布他林在波長(zhǎng)277nm處有最大吸收峰，最大吸光度值為2.550；而偶聯(lián)物在波長(zhǎng)285nm處有最大吸收峰，最大吸光度值約為0.678，與特布他林和bsa的特征吸收峰有明顯區(qū)別，同時(shí)又處于兩者的吸收峰之間。根據(jù)紫外掃描圖譜，可初步推測(cè)特布他林與bsa偶聯(lián)成功。見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2

將bsa、特布他林和偶聯(lián)物分別用kbr壓片后，進(jìn)行紅外光譜掃描，偶聯(lián)物的紅外吸收曲線雖與bsa的很相似，但部分吸收峰相對(duì)bsa來(lái)說(shuō)有了一定移動(dòng)或加強(qiáng)，推測(cè)是由于bsa偶聯(lián)了特布他林造成的。從特布他林的紅外譜圖上可以看出1,3,5-三取代芳烴的吸收：695cm^-1處的1,3,5-三取代化合物強(qiáng)吸收峰，苯環(huán)的骨架振動(dòng)在1610cm^-1、1522cm^-1和1486cm^-1這三個(gè)吸收峰，也可以看到-c(ch3)3結(jié)構(gòu)的甲基有兩個(gè)強(qiáng)度不等的吸收峰，即約1382cm^-1、1344cm^-1，圖中3334cm^-1的寬峰是羥基的伸縮振動(dòng)，偶聯(lián)物的紅外譜圖中都有相似的吸收峰。此外，偶聯(lián)物的紅外譜圖中還可以看到蛋白質(zhì)類物質(zhì)共有的吸收，如3303cm^-1處的胺基n-h吸收峰，1655cm^-1、1538cm^-1的酰胺譜帶，說(shuō)明偶聯(lián)物中含有bsa的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，沉淀在1655cm^-1和3303cm^-1附近的吸收峰相對(duì)bsa來(lái)說(shuō)有所增強(qiáng)，而特布他林在這兩處都有強(qiáng)吸收，可能是連接特布他林分子后分別受其苯環(huán)骨架振動(dòng)和酚羥基的影響。故此推測(cè)特布他林與bsa偶聯(lián)成功。見(jiàn)圖2。

實(shí)施例3

圖3顯示了bsa、特布他林、偶聯(lián)物和特布他林與bsa等摩爾混合溶液在365nm紫外燈下的熒光效果圖。前三組溶液中物質(zhì)均為0.1mm。混合溶液中bsa與特布他林的總和為0.1mm。可明顯看出，僅偶聯(lián)物有熒光，也可以推測(cè)特布他林與bsa偶聯(lián)成功。見(jiàn)圖3，圖中：(a)bsa的熒光效果圖、(b)特布他林的熒光效果圖、(c)偶聯(lián)物的熒光效果圖、(d)特布他林和bsa混合液的熒光效果圖。

實(shí)施例4

在dmem培養(yǎng)基中加入100單位/ml的青霉素/鏈霉素和10％的胎牛血清，制備成培養(yǎng)液，在5％co2和37℃的培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞hepg2和小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞株ht22細(xì)胞。用培養(yǎng)液分別重懸混勻細(xì)胞，鋪在96孔板中，每孔200μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。向細(xì)胞中分別加入不同濃度的偶聯(lián)物48h后，加入20μlmtt(終濃度為0.5mg/ml)，37℃下放置4小時(shí)，倒掉mtt，分別加入150μldmso。用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸收值，空白對(duì)照組中dmso的含量為0.1％。結(jié)果顯示，在1～100μm濃度范圍內(nèi)，偶聯(lián)物對(duì)hepg2和ht22兩種細(xì)胞均無(wú)毒性(n＝6)。見(jiàn)圖4，圖中：a圖為偶聯(lián)物對(duì)hepg2細(xì)胞的毒性檢測(cè)圖，b圖為偶聯(lián)物對(duì)ht22細(xì)胞的毒性檢測(cè)圖。