本發(fā)明涉及一種磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌種類的方法。

背景技術(shù)：

人體腸道中存在1000多種腸道菌，這些腸道菌構(gòu)成了一個(gè)極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)與我們的身體健康存在密切關(guān)系。雖然近年來(lái)對(duì)于腸道微生態(tài)系統(tǒng)的研究得到了越來(lái)越多的重視，但是對(duì)于腸道菌表面抗原的研究還處于初始階段，已知在腸道菌表面存在多種糖抗原和鞭毛蛋白等，研究發(fā)現(xiàn)這些腸道菌抗原與腸道菌定殖和腸道穩(wěn)態(tài)有重要聯(lián)系，因此研究這些腸道菌表面抗原就成為研究的熱點(diǎn)，而對(duì)于含有這些抗原的腸道菌的篩選就成為了研究腸道菌表面抗原的基礎(chǔ)工作，所以有必要將含特定抗原的腸道菌篩選出來(lái)，并鑒定其種類。

免疫磁珠技術(shù)是以高均一性的磁性微球?yàn)楣滔嘀С治?，將免疫配?如抗體,抗原等)功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體上形成免疫磁性微球，利用特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，在磁力作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，從混合溶液中分離出特異性的靶物質(zhì)。免疫磁珠技術(shù)目前多用于致病菌的分離，例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。16srdna序列分析已成為細(xì)菌分類鑒定的重要方法，這種序列分析方法比傳統(tǒng)方法有更高的檢出率。因?yàn)槟c道菌有很多種類是不可培養(yǎng)的，因此我們不能用傳統(tǒng)的表型觀察等手段來(lái)鑒定其種類，因此只能用16srdna測(cè)序來(lái)鑒定其種類。但檢索發(fā)現(xiàn)利用磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌種類的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌種類的方法。

本發(fā)明是利用抗原抗體特異性結(jié)合和16srdna測(cè)序相結(jié)合的原理，將表面含有特定抗原的腸道菌特異性地結(jié)合在連接有相應(yīng)抗體的磁珠上，從而在磁場(chǎng)力的作用下，將含有特定抗原的腸道菌從腸道菌群中分離出來(lái)，然后利用16srdna測(cè)序方法鑒定其種類。

本發(fā)明所述磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌種類的方法，包括腸道菌樣品的處理和提取、含相應(yīng)抗體磁珠的制備、利用磁珠分選表面含特定抗原的腸道菌、16srdna測(cè)序分析判定腸道菌的物種種類，其特征在于：

所述腸道菌樣品的處理和提取方法是：稱取糞便0.5g放置于15ml離心管中，加5mlpbs(磷酸鹽緩沖溶液)，漩渦振蕩10分鐘；200～500rpm離心3分鐘，把上清液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加10mlpbs后10000rpm離心10分鐘；棄掉上清液，加2mlpbs懸浮菌體，再加10mlpbs后10000rpm離心10分鐘，如此過(guò)程重復(fù)至離心后上清液無(wú)色；用1mlpbs懸浮菌體，每管加入4ml固定液，室溫放置12個(gè)小時(shí)；每管加入20mlpbs，7000rpm離心10分鐘，倒掉上清，加入1ml6％封閉液懸浮菌體，再將其吸到1.5ml離心管中，7000rpm離心10分鐘，倒掉上清，再用0.6％封閉液洗滌菌體2次，然后用pbs稀釋腸道菌，使其od600＝0.6；

所述含相應(yīng)抗體磁珠的制備方法是：以常規(guī)方法或委托北京市科學(xué)器材公司將相應(yīng)抗體連接到磁珠上；

所述利用磁珠分選表面含特定抗原的腸道菌：用pbs將含相應(yīng)抗體的磁珠稀釋至1mg/ml，吸取100ul此磁珠溶液，加入到提取到的od600＝0.6的900ul腸道菌溶液中，共放置于1.5ml離心管中并在混勻器上振蕩混勻30分鐘，然后快速離心去除溶液層；將含有磁珠的樣品溶液放在磁力架裝置上，靜置30±10分鐘至管內(nèi)液體澄清，輕輕吸取上清液棄掉，避免吸到磁珠，如吸取的上清中含有磁珠，則放回離心管中重新放置到磁力架裝置上再進(jìn)行分選；將棄掉上清液的離心管從磁力架上取出，加入1mlpbs溶液，重懸，再放在磁力架上靜置30±10分鐘至管內(nèi)液體澄清，小心吸取上清液棄掉，如此重復(fù)以上步驟三次；最后向離心管中加入200ulpbs溶液，重懸，獲得表面含特定抗原的腸道菌樣品；

所述16srdna測(cè)序分析判定腸道菌的物種種類的方法是：對(duì)獲得表面含特定抗原的腸道菌樣品進(jìn)行dna提取，檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)，用合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和16srdna測(cè)序；用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的cleandata方可用于后期分析；通過(guò)reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；在給定的相似度下將tags聚成otu，然后通過(guò)otu與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)otu進(jìn)行物種注釋；根據(jù)otu和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度和組成分析，給出腸道菌的物種種類的判定。

以上磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌的方法中：所述相應(yīng)抗體優(yōu)選是a血型抗體或b血型抗體。

以上磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌的方法中：磁珠的粒徑為300nm。

以上磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌的方法中：固定液為5％多聚甲醛。

以上磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌的方法中：封閉液為牛血清白蛋白。

以上磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌的方法中：16srdna測(cè)序應(yīng)用的是illumina平臺(tái)檢測(cè)的v4區(qū)序列。

本發(fā)明公開(kāi)了一種磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含特定抗原腸道菌種類的方法，是采用抗原與抗體特異性結(jié)合和16srdna測(cè)序相結(jié)合的原理，通過(guò)包被有相應(yīng)抗體的磁珠，特異性的結(jié)合腸道菌表面特定抗原，從而將含有特定抗原的腸道菌篩選出來(lái)，然后用16srdna測(cè)序的方法，對(duì)篩選到的腸道菌進(jìn)行物種鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本方法可以將腸道菌中所有帶有特定抗原的腸道菌篩選鑒定出來(lái)，避免了常規(guī)表型分析方法中對(duì)不可培養(yǎng)細(xì)菌的檢測(cè)遺漏；同時(shí)，本發(fā)明又具有快速、高效、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。本發(fā)明為篩選不同表面抗原的腸道菌提供了一個(gè)可行的方法，同時(shí)也為下一步精準(zhǔn)的研究腸道菌奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為利用本方法檢測(cè)到含a血型抗原的腸道菌在門的組成情況。

圖2為利用本方法檢測(cè)到含b血型抗原的腸道菌在門的組成情況。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:

磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含a血型抗原的腸道菌，具體步驟是：

腸道菌樣品的處理和提取方法是：稱取糞便0.5g放置于15ml離心管中，加5mlpbs(磷酸鹽緩沖溶液)，漩渦振蕩10分鐘；200～500rpm離心3分鐘，把上清液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加10mlpbs后10000rpm離心10分鐘；棄掉上清液，加2mlpbs懸浮菌體，再加10mlpbs后10000rpm離心10分鐘，如此過(guò)程重復(fù)至離心后上清液無(wú)色；用1mlpbs懸浮菌體，每管加入4ml固定液，室溫放置12個(gè)小時(shí)；每管加入20mlpbs，7000rpm離心10分鐘，倒掉上清，加入1ml6％封閉液懸浮菌體，再將其吸到1.5ml離心管中，7000rpm離心10分鐘，倒掉上清，再用0.6％封閉液洗滌菌體2次，然后用pbs稀釋腸道菌，使其od600＝0.6；

含a血型抗體磁珠的制備方法是：委托北京市科學(xué)器材公司將市售a血型抗體連接到磁珠上；

利用磁珠分選表面含a血型抗原的腸道菌：用pbs將含a血型抗體的磁珠稀釋至1mg/ml，吸取100ul此磁珠溶液，加入到提取到的od600＝0.6的900ul腸道菌溶液中，共放置于1.5ml離心管中并在混勻器上振蕩混勻30分鐘，然后快速離心去除溶液層；將含有磁珠的樣品溶液放在磁力架裝置上，靜置30±10分鐘至管內(nèi)液體澄清，輕輕吸取上清液棄掉，避免吸到磁珠，如吸取的上清中含有磁珠，則放回離心管中重新放置到磁力架裝置上再進(jìn)行分選；將棄掉上清液的離心管從磁力架上取出，加入1mlpbs溶液，重懸，再放在磁力架上靜置30±10分鐘至管內(nèi)液體澄清，小心吸取上清液棄掉，如此重復(fù)以上步驟三次；最后向離心管中加入200ulpbs溶液，重懸，獲得表面含a血型抗原的腸道菌樣品；

16srdna測(cè)序分析判定腸道菌的物種種類的方法是：對(duì)獲得表面含a血型抗原的腸道菌樣品進(jìn)行dna提取，檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)，用合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和16srdna測(cè)序；用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的cleandata方可用于后期分析；通過(guò)reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；在給定的相似度下將tags聚成otu，然后通過(guò)otu與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)otu進(jìn)行物種注釋；根據(jù)otu和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度和組成分析，給出腸道菌的物種種類的判定。

結(jié)果分析：

含a血型抗原的腸道菌集中在五個(gè)門，擬桿菌門占28％，厚壁菌門占27％，梭桿菌門占1％，變形菌門占41％，放線菌門占3％，見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2:

磁珠法與測(cè)序相結(jié)合篩選并鑒定表面含b血型抗原的腸道菌，具體步驟是：

腸道菌樣品的處理和提取方法是：稱取糞便0.5g放置于15ml離心管中，加5mlpbs(磷酸鹽緩沖溶液)，漩渦振蕩10分鐘；200～500rpm離心3分鐘，把上清液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加10mlpbs后10000rpm離心10分鐘；棄掉上清液，加2mlpbs懸浮菌體，再加10mlpbs后10000rpm離心10分鐘，如此過(guò)程重復(fù)至離心后上清液無(wú)色；用1mlpbs懸浮菌體，每管加入4ml固定液，室溫放置12個(gè)小時(shí)；每管加入20mlpbs，7000rpm離心10分鐘，倒掉上清，加入1ml6％封閉液懸浮菌體，再將其吸到1.5ml離心管中，7000rpm離心10分鐘，倒掉上清，再用0.6％封閉液洗滌菌體2次，然后用pbs稀釋腸道菌，使其od600＝0.6；

含b血型抗體磁珠的制備方法是：委托北京市科學(xué)器材公司將市售b血型抗體連接到磁珠上；

利用磁珠分選表面含b血型抗原的腸道菌：用pbs將含b血型抗體的磁珠稀釋至1mg/ml，吸取100ul此磁珠溶液，加入到提取到的od600＝0.6的900ul腸道菌溶液中，共放置于1.5ml離心管中并在混勻器上振蕩混勻30分鐘，然后快速離心去除溶液層；將含有磁珠的樣品溶液放在磁力架裝置上，靜置30±10分鐘至管內(nèi)液體澄清，輕輕吸取上清液棄掉，避免吸到磁珠，如吸取的上清中含有磁珠，則放回離心管中重新放置到磁力架裝置上再進(jìn)行分選；將棄掉上清液的離心管從磁力架上取出，加入1mlpbs溶液，重懸，再放在磁力架上靜置30±10分鐘至管內(nèi)液體澄清，小心吸取上清液棄掉，如此重復(fù)以上步驟三次；最后向離心管中加入200ulpbs溶液，重懸，獲得表面含b血型抗原的腸道菌樣品；

16srdna測(cè)序分析判定腸道菌的物種種類的方法是：對(duì)獲得表面含b血型抗原的腸道菌樣品進(jìn)行dna提取，檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)，用合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和16srdna測(cè)序；用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的cleandata方可用于后期分析；通過(guò)reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；在給定的相似度下將tags聚成otu，然后通過(guò)otu與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)otu進(jìn)行物種注釋；根據(jù)otu和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度和組成分析，給出腸道菌的物種種類的判定。

結(jié)果分析：含b血型抗原的腸道菌集中在五個(gè)門，擬桿菌門占24％，厚壁菌門占52％，梭桿菌門占1％，變形菌門占20％，放線菌門占1％，見(jiàn)圖2。