本發(fā)明屬于細(xì)菌纖維素制備領(lǐng)域，具體涉及一種利用茶渣作為碳源制備細(xì)菌纖維素的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose，BC），又稱作微生物纖維素；化學(xué)式為(C₆H₁₀O)_n，是由β-D-葡萄糖單體以β-1,4糖苷鍵連接而形成的一種直鏈多糖生物質(zhì)。由于擁有超細(xì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、大量的納米級(jí)孔徑分布、很大的比表面積以及豐富的表面羥基基團(tuán)，因此被廣泛應(yīng)用在食品、工業(yè)、造紙和醫(yī)用等領(lǐng)域。

與植物纖維素相比， BC中吡喃葡萄糖的相鄰6個(gè)碳原子呈穩(wěn)定的椅式結(jié)構(gòu)，而植物纖維素分子有螺旋結(jié)構(gòu)。其三維結(jié)構(gòu)中，同一條直鏈間，同一平面不同直鏈以及上下不同直鏈間都有氫鍵緊密交聯(lián)，形成致密的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這使得BC雖然與自然界中植物或海藻產(chǎn)生的天然纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，但具有許多獨(dú)特的性質(zhì)：（1）高純度，與植物纖維素相比，BC經(jīng)過(guò)分離提純等簡(jiǎn)單工藝之后可獲得純度達(dá) 99%以上的纖維素，且不含有木質(zhì)素、半纖維素和果膠等伴生產(chǎn)物；（2）具有高結(jié)晶度，最高可達(dá)95%，而植物纖維素的結(jié)晶度一般僅有65%，且BC還有很高的聚合度；（3）BC具有超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，BC纖維是由直徑3-4 nm的微纖維通過(guò)分子內(nèi)和分子間的氧鍵作用而纏繞組合成40-60 nm粗的纖維束，并相互交織形成超精細(xì)的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；（5）很強(qiáng)的持水能力，由于BC擁有致密的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，比表面積大，表面含有豐富的親水性基團(tuán)，這使得BC具有較高的持水性能，未經(jīng)干燥的BC的WRV值高達(dá)1000% 以上，冷凍干燥后的持水能力仍超過(guò)600%；（6）生物合成具有可調(diào)控性，BC的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)在可以通過(guò)調(diào)控其生物合成的環(huán)境而改變其原有的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，從而適應(yīng)各種工業(yè)生產(chǎn)和學(xué)術(shù)研究的需求；（7）BC具有較好的適應(yīng)性和較高的生物相容性，且具有良好的生物可降解性，能在相應(yīng)的物理化學(xué)條件下降解，對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)產(chǎn)生二次污染。

鑒于細(xì)菌纖維素的優(yōu)良特性，細(xì)菌纖維素具有廣泛而特殊的用途、在醫(yī)用材料領(lǐng)域，細(xì)菌纖維素可以用于合成人造皮膚、人造血管、外科敷料、緩釋藥物的載體等；在食品工程領(lǐng)域，細(xì)菌纖維素本身就可以作為一種食品食用，如俗稱椰果或者椰纖果；另外，BC還可以作為食品工業(yè)中的增稠劑、成型劑、添加劑等；在造紙工業(yè)方面，細(xì)菌纖維素的添加可以提高紙張抗張強(qiáng)度和耐破度，降低透氣度，提高撕裂度等；在音響領(lǐng)域可作為生產(chǎn)超性能的聲音振動(dòng)膜；在材料領(lǐng)域，BC納米纖維與其它高分子、有機(jī)或者無(wú)機(jī)分子的摻雜復(fù)合，可獲得各種新的功能復(fù)合材料。

目前大規(guī)模利用細(xì)菌纖維素的障礙主要是其產(chǎn)量低，成本高，價(jià)格不敵普通纖維素，因此研究的重點(diǎn)集中在尋找新碳源上，尋找廉價(jià)合適的，既能降低生產(chǎn)成本又能提高纖維素的產(chǎn)量。

茶葉在生產(chǎn)與深加工過(guò)程中產(chǎn)生大量茶葉廢棄物，即所謂的茶渣。我國(guó)茶渣的主要來(lái)源有兩個(gè)：一是工業(yè)提取茶多酚等生化成分之后所形成的茶渣；二是茶飲料工業(yè)中形成的茶渣。因茶飲料工業(yè)所形成的茶渣中營(yíng)養(yǎng)成分比較豐富，這里著重討論茶飲料工業(yè)茶渣的開(kāi)發(fā)。我國(guó)茶飲料工業(yè)雖然起步較晚，但發(fā)展勢(shì)頭十分強(qiáng)勁，茶飲料年產(chǎn)量成倍增長(zhǎng)。從1997年起，茶飲料產(chǎn)量成倍增長(zhǎng)，2000年一舉超過(guò)果汁、果味飲料名列各類飲料的第三位。然而，目前內(nèi)地人均年飲用茶飲料僅為0.4 L，日本人均年飲用茶飲料為20～30 L，也就是說(shuō)，茶飲料在內(nèi)地市場(chǎng)還應(yīng)有30倍以上的成長(zhǎng)空間。娃哈哈引進(jìn)的4條茶飲料生產(chǎn)線，年消化干茶5000 噸，這表明將產(chǎn)生茶渣超過(guò)4000 噸；如此推算，目前生產(chǎn)茶飲料所產(chǎn)生的茶渣已超過(guò)4萬(wàn)噸，在接下的幾年里生產(chǎn)量如增長(zhǎng)30倍，茶渣將超過(guò)120萬(wàn)噸。如此多的茶渣目前基本都被當(dāng)作工業(yè)廢料拋棄，只有少量被作為肥料施用到田間，造成資源的巨大浪費(fèi)。因此，將茶渣變廢為寶，使難以處理的茶渣廢料成為一種優(yōu)質(zhì)新型飼料，有利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)；也有利于降低企業(yè)成本，提高企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

茶飲料茶渣(速溶茶渣)指茶葉提取速溶成分后的殘?jiān)?，?jīng)分析表明：粗纖維高達(dá)17%～19%，粗蛋白含量高達(dá)16%～18%，賴氨酸和蛋氨酸含量分別為1.5%～2%和0.5～0.7%，還含有一定量的維生素、茶多酚、咖啡堿及少量的茶皂素等，仍有較高的利用價(jià)值；大量茶渣常常被當(dāng)作廢料拋棄，造成了資源的極大浪費(fèi)及生態(tài)環(huán)境破壞。因此如有一種技術(shù)能充分利用這些現(xiàn)有廢棄資源，以其為碳源制備細(xì)菌纖維素，提升其附加價(jià)值，不僅為細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)提供新途徑，而且可以提高茶渣的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述細(xì)菌纖維素生產(chǎn)成本高、茶渣利用率低的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用茶渣作為碳源制備細(xì)菌纖維素的方法，該方法具有原料來(lái)源廣泛、工藝簡(jiǎn)單、能耗低、反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)；且制備的培養(yǎng)基碳源質(zhì)量好，價(jià)格低，適合于工業(yè)生產(chǎn)；在細(xì)菌纖維素的應(yīng)用領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用茶渣作為碳源制備細(xì)菌纖維素的方法，其包括如下具體步驟：

（1）利用茶渣制備發(fā)酵液：將茶渣清洗后按照固液比1:10與水混合榨汁，高速打碎得茶渣漿液，添加無(wú)機(jī)鹽，調(diào)節(jié)pH為4.0-6.0，獲得以茶渣漿為主成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，121 ℃滅菌20-30min，自然冷卻到20-30 ℃?zhèn)溆茫?/p>

（2）茶渣糖化液的制備：在步驟（1）制備的茶渣發(fā)酵培養(yǎng)基中接種纖維素降解菌，進(jìn)行纖維素糖化水解，得到茶渣糖化液；其具體工藝為：將經(jīng)活化培養(yǎng)的纖維素降解菌接入步驟（1）所述三角瓶中進(jìn)行糖化水解。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：將上述茶渣糖化液作為培養(yǎng)基碳源，補(bǔ)加氮源和磷源，調(diào)節(jié)pH為5.0-6.0，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置于三角瓶中，滅菌備用；

（4）發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素：接入細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，經(jīng)過(guò)1-3天的振蕩培養(yǎng)和3-20天靜置培養(yǎng)，制得細(xì)菌纖維素。

其中，所述步驟（1）中的茶渣為茶葉加工生產(chǎn)過(guò)程中廢棄的茶渣。

所述步驟（1）中的無(wú)機(jī)鹽為KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaCl、MgSO₄、ZnSO₄、FeCl₃中的一種或幾種。

所述步驟（2）中的纖維素降解菌為噬纖維菌屬（Cytophaga）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、熱酸菌屬（Acidothermus）、熱桿菌屬（Caldibacillus），、纖維弧菌屬（Cellvlbrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和歐文菌屬（Erwinia）中一種或幾種。

所述步驟（2）中的糖化水解條件為30-45℃，搖床轉(zhuǎn)速120~180rpm的條件下糖化水解36-120 h。

所述步驟（3）中的茶渣糖化液首先補(bǔ)加適量氮源和磷源，調(diào)節(jié)pH，置于三角瓶中，121 ℃滅菌20-30 min，冷卻至室溫后，接入細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，采用先在120-240 rpm轉(zhuǎn)速下動(dòng)態(tài)振蕩培養(yǎng)1~3天，再靜置培養(yǎng)3~20天的動(dòng)靜結(jié)合發(fā)酵形式制得細(xì)菌纖維素。

所述步驟（3）中的氮源為0.1-1.0 wt%的酵母浸膏和0.1-0.5 wt%的胰蛋白胨；或者為0.1-2.0 wt%的硫酸銨或玉米漿或麥芽汁。

所述步驟（3）中的磷源為0.1-1.0 wt%的0.1-1.0 wt%的KH₂PO₄、K₂HPO₄或NaH₂PO₄或Na₂HPO₄。

所述步驟（4）中培養(yǎng)條件為20-30 ℃，在120-240rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)1-3天，再靜置培養(yǎng)3-20天。

所述步驟（4）中的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株為醋酸菌屬、葡萄糖酸桿菌屬、葡糖酸醋桿菌屬、葡萄糖氧化桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、土壤桿菌屬、洋蔥假單胞菌屬、空腸彎曲菌、木葡糖酸醋桿菌中的一種或幾種。

所述步驟（4）中細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的接種量為 3-15%vol。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）本發(fā)明以茶渣為原料，具有價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛，預(yù)處理水解工藝具有簡(jiǎn)單、能耗低、水解液糖含量高、反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)。茶渣中還含有少量的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等元素，可以促進(jìn)BC的合成。

（2）茶渣是一種可再生能源，用于發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素不僅為其資源化利用提供一條有效的路徑，而且為細(xì)菌纖維素的工業(yè)化提供了廉價(jià)的新原料。

（3）本發(fā)明經(jīng)處理的茶渣水解液生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素的原料成本大幅度降低，在細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1 本發(fā)明實(shí)施例1對(duì)應(yīng)的細(xì)菌纖維素的SEM掃描形貌；

圖2 本發(fā)明實(shí)施例1對(duì)應(yīng)的細(xì)菌纖維素的XRD圖譜；

圖3 本發(fā)明實(shí)施例1對(duì)應(yīng)的細(xì)菌纖維素的FTIR圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種利用茶渣作為碳源制備細(xì)菌纖維素的方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1

1.利用茶渣制備發(fā)酵液：

首先選取茶渣和水按固液質(zhì)量比1:10置于榨汁機(jī)中，將其高速打碎并攪拌均勻，得到茶渣漿液，添加微量元素，使其最終濃度為： KH₂PO₄ 0.6 g/L、NaCl 1 g/L、MgSO₄ 0.1 g/L、ZnSO₄ 0.25 mg/L、FeCl₃ 0.01 g/L，調(diào)節(jié)pH至4.0，獲得以茶渣汁為主成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，在121 ℃滅菌20 min，冷卻到室溫備用。

2.茶渣糖化液的制備：

將噬纖維菌屬（Cytophaga）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、纖維弧菌屬（Cellvlbrio）作為纖維素降解菌，將經(jīng)兩級(jí)放大培養(yǎng)的纖維素降解菌接入配好料并已滅菌并冷卻的三角瓶中，于溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 rpm的發(fā)酵條件下糖化水解96 h，制得茶渣糖化液。

3.發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

將上述茶渣糖化液作為培養(yǎng)基碳源，補(bǔ)加0.5 wt%的酵母浸膏和0.3 wt%的胰蛋白胨作為氮源以及0.6 wt%的Na₂HPO₄作為磷源；調(diào)節(jié)pH至5.0，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置于三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后備用。

4．發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素：

將木葡糖酸醋桿菌、土壤桿菌屬、醋酸菌屬接入液體種子培養(yǎng)基制備細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，然后按體積百分比3%的接種量轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基，于20 ℃以180 rpm轉(zhuǎn)速下動(dòng)態(tài)振蕩培養(yǎng)3天，再靜置培養(yǎng)3天發(fā)酵制得細(xì)菌纖維素。

實(shí)施例2

1.利用茶渣制備發(fā)酵液

首先選取茶渣和水按固液質(zhì)量比1：10置于榨汁機(jī)中，將其高速打碎并攪拌均勻，得到茶渣漿液，添加微量元素，使其最終濃度為：0.4 g/L KH₂PO₄、0.8 g/L NaCl、0.2 g/L MgSO₄，調(diào)節(jié)pH至4.5，獲得以茶渣汁為主成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，在121 ℃滅菌25 min，冷卻到室溫備用。

2.茶渣糖化液的制備：

將熱酸菌屬（Acidothermus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和歐文菌屬（Erwinia）作為纖維素降解菌，將經(jīng)兩級(jí)放大培養(yǎng)的纖維素降解菌接入配好料并已滅菌并冷卻的三角瓶中，于溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm的發(fā)酵條件下糖化水解72h，制得茶渣糖化液。

3.發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

將上述茶渣糖化液作為培養(yǎng)基碳源，補(bǔ)加1.0 wt%的硫酸銨作為氮源和0.5 wt%的K₂HPO₄作為磷源；調(diào)節(jié)pH至5.5，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置于三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后備用。

4.發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素：

將醋酸菌屬、葡萄糖酸桿菌屬、葡糖酸醋桿菌屬接入液體種子培養(yǎng)基制備細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，然后按體積百分比6%的接種量轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃，150 rpm振蕩培養(yǎng)2天后，再靜置培養(yǎng)20天發(fā)酵制得細(xì)菌纖維素。

實(shí)施例3

1.利用茶渣制備發(fā)酵液

首先選取茶渣和水按固液質(zhì)量比1：10置于榨汁機(jī)中，將其高速打碎并攪拌均勻，得到茶渣漿液，添加微量元素，使其最終濃度為：0.9 g/L KH₂PO₄、1.2 g/L NaCl、0.02g/L FeCl₃調(diào)節(jié)pH至5.0，獲得以茶渣汁為主成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，在121 ℃滅菌20 min，冷卻到室溫備用。

2. 茶渣糖化液的制備：

將纖維弧菌屬（Cellvlbrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和歐文菌屬（Erwinia）作為纖維素降解菌，將經(jīng)兩級(jí)放大培養(yǎng)的纖維素降解菌接入配好料并已滅菌并冷卻的三角瓶中，于溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 rpm的發(fā)酵條件下糖化水解72 h，制得茶渣糖化液。

3. 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

將上述茶渣糖化液作為培養(yǎng)基碳源，補(bǔ)加0.8 wt%的酵母浸膏和0.5 wt%的胰蛋白胨作為氮源以及0.3 wt%的NaH₂PO₄作為磷源；調(diào)節(jié)pH至5.0，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置于三角瓶中，121 ℃滅菌25 min，冷卻至室溫后備用；將葡萄糖氧化桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬接入液體種子培養(yǎng)基制備細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，然后按體積百分比9%的接種量轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 ℃以240 rpm轉(zhuǎn)速下動(dòng)態(tài)振蕩培養(yǎng)1天，再靜置培養(yǎng)5天發(fā)酵制得細(xì)菌纖維素。

實(shí)施例4

1.利用茶渣制備發(fā)酵液：

首先選取茶渣和水按固液質(zhì)量比1：10置于榨汁機(jī)中，將其高速打碎并攪拌均勻，得到茶渣漿液，添加微量元素，使其最終濃度為：0.2 g/L KH₂PO₄、0.6 g/L NaCl、0.3 g/L MgSO₄、0.4 mg/L ZnSO₄、0.03 g/L FeCl₃調(diào)節(jié)pH至5.5，獲得以茶渣汁為主成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，在121 ℃滅菌30 min，冷卻到室溫備用。

2. 茶渣糖化液的制備：

將芽孢桿菌屬（Bacillus）、熱桿菌屬（Caldibacillus）、纖維弧菌屬（Cellvlbrio）作為纖維素降解菌，將經(jīng)兩級(jí)放大培養(yǎng)的纖維素降解菌接入配好料并已滅菌并冷卻的三角瓶中，于溫度40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm的發(fā)酵條件下糖化水解48h，制得茶渣糖化液。

3. 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

將上述茶渣糖化液作為培養(yǎng)基碳源，補(bǔ)加20 wt%的玉米漿作為氮源和0.4 wt%的KH₂PO₄作為磷源；調(diào)節(jié)pH至6.0，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置于三角瓶中，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后備用。

4.發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素：

將醋酸菌屬、木葡糖酸醋桿菌接入液體種子培養(yǎng)基制備細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，然后按體積百分比12%的接種量轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基，于22 ℃以180 rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)3天，再靜置培養(yǎng)15天發(fā)酵制得細(xì)菌纖維素。

實(shí)施例5

1.利用茶渣制備發(fā)酵液：

首先選取茶渣和水按固液質(zhì)量比1：10置于榨汁機(jī)中，將其高速打碎并攪拌均勻，得到茶渣漿液，添加微量元素，使其最終濃度為：0.9 g/L KH₂PO₄、1.2 g/L NaCl、0.6 mg/L ZnSO₄、0.05 g/L FeCl₃，調(diào)節(jié)pH至6.0，獲得以茶渣汁為主成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，在121 ℃滅菌30 min，待其滅菌完成后停止加熱，使其自然冷卻到室溫。

2.茶渣糖化液的制備：

將芽孢桿菌屬（Bacillus）、熱酸菌屬（Acidothermus）、熱桿菌屬（Caldibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和歐文菌屬（Erwinia）作為纖維素降解菌，將經(jīng)兩級(jí)放大培養(yǎng)的纖維素降解菌接入配好料并已滅菌并冷卻的三角瓶中，于溫度45 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 rpm的發(fā)酵條件下糖化水解36 h，制得茶渣糖化液。

3.發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

將上述茶渣糖化液作為培養(yǎng)基碳源，補(bǔ)加15 wt%的麥芽汁氮作為氮源和0.5 wt%的NaH₂PO₄作為磷源；調(diào)節(jié)pH至6.0，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置于三角瓶中，121℃滅菌30 min，冷卻至室溫后備用。

4.發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素：

將土壤桿菌屬、空腸彎曲菌、木葡糖酸醋桿菌接入液體種子培養(yǎng)基制備細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的種子液，然后按體積百分比15%的接種量轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃以210 rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)2天，再靜置培養(yǎng)7天發(fā)酵制得細(xì)菌纖維素。