本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種通過(guò)外施篩選劑以提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法。

背景技術(shù)：

隨著轉(zhuǎn)基因植物種類和種植面積的迅猛增加，轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基因的生物安全性已成為人們普遍關(guān)注的問(wèn)題之一。合適的標(biāo)記基因可以為獲得真正的轉(zhuǎn)化體提供有力的判斷依據(jù)，在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前在植物遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記基因有抗生素抗性基因(如nptⅱ基因、hpt基因等)和除草劑抗性基因(如pat基因、epsps基因、bar基因等)，由于選擇標(biāo)記基因一旦轉(zhuǎn)化成功便不再有用，甚至對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全存在潛在威脅，所以對(duì)生物安全性標(biāo)記基因的開(kāi)發(fā)顯得非常重要。

乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，以下稱為“als”)存在于植物生長(zhǎng)過(guò)程中，它能以高度專一性和極高的催化效率催化丙酮酸為乙酰乳酸，從而導(dǎo)致支鏈氨基酸的生物合成。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸是植物體內(nèi)3種必需的支鏈氨基酸，而als不僅是催化亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性也受產(chǎn)物纈氨酸和異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)。

als抑制劑是一類已知的除草劑，其通過(guò)抑制植物體內(nèi)的als活性而阻止植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到破壞，從而使植物細(xì)胞的有絲分裂停止于g1階段的s期(dna合成期)和g2階段的m期，干擾了dna的合成，細(xì)胞因此不能完成有絲分裂，導(dǎo)致植物組織失綠、黃化，植株生長(zhǎng)受抑，最終達(dá)到殺死生物個(gè)體的目的。因此，als抑制劑不僅具有超高活性，而且以其超高效、廣譜、低毒、低殘留、高選擇性和良好的環(huán)境相容性備受歡迎，同時(shí)由于抑制als抑制劑的靶標(biāo)不涉及人和動(dòng)物，故其對(duì)人和動(dòng)物十分安全，亦為標(biāo)記基因和除草劑耐受性狀提供了新的選擇。

als抑制劑包括磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、三唑并嘧啶類除草劑、嘧啶基硫代苯甲酸類除草劑或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類除草劑等。已報(bào)道了在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中能以磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物，但轉(zhuǎn)化效率有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法，有效克服現(xiàn)有技術(shù)將als抑制劑配置在培養(yǎng)基中存在的假陽(yáng)性植株率較高、轉(zhuǎn)化效率低等技術(shù)缺陷，為規(guī)模化遺傳轉(zhuǎn)化及培育具有耐受除草劑性狀的植物提供新的選擇。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，包括：

使用含有目標(biāo)基因和編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；

通過(guò)外施als抑制劑對(duì)上述轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇標(biāo)記物；

選擇未被殺死和/或未被抑制的植物細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞為通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)過(guò)程轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。

更進(jìn)一步地，所述植物細(xì)胞為大豆細(xì)胞。

具體地，所述外施包括滴加、噴施或涂抹。

具體地，所述als抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

更具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆1-7μg。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆3μg。

可選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-9天。

優(yōu)選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有seqidno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與seqidno:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種由農(nóng)桿菌介導(dǎo)且以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇標(biāo)記物來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中，包括：

制備至少包括能被農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的外植體；

將至少包括所述外植體中所述植物細(xì)胞的區(qū)域接觸至少包含編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的農(nóng)桿菌菌株；

通過(guò)外施als抑制劑對(duì)所述外植體進(jìn)行篩選培養(yǎng)；

選擇未被殺死和/或未被抑制的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；

所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生成植物。

進(jìn)一步地，所述植物細(xì)胞為大豆細(xì)胞。

更進(jìn)一步地，所述外植體為有子葉的外植體、半粒種子外植體或半胚胎種子外植體。

具體地，所述外施包括滴加、噴施或涂抹。

具體地，所述als抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

更具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆1-7μg。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆3μg。

可選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-9天。

優(yōu)選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生成植物具體為通過(guò)外施als抑制劑使得所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化成植物。

可選地，所述als抑制劑為苯磺隆時(shí)，每毫升分化培養(yǎng)基外施苯磺隆3-7μg。

優(yōu)選地，所述als抑制劑為苯磺隆時(shí)，每毫升分化培養(yǎng)基外施苯磺隆7μg。

可選地，外施苯磺隆前在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-20天。

優(yōu)選地，外施苯磺隆前在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18天。

進(jìn)一步地，所述農(nóng)桿菌菌株還包括賦予除草劑耐受性的基因和/或昆蟲(chóng)抗性的基因。

具體地，所述賦予除草劑耐受性的基因編碼如下除草劑耐受性蛋白質(zhì)：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還原酶、草甘膦-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)和/或原卟啉原氧化酶。

具體地，所述昆蟲(chóng)抗性的基因包括cry類基因或vip類基因。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有seqidno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與seqidno:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，其中，包括：

大豆種子萌發(fā)后去除一片子葉和第一片真葉，獲得帶有一片子葉的裸露分生組織；

所述帶有一片子葉的裸露分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理；

包含編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的農(nóng)桿菌菌株侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊；

通過(guò)外施als抑制劑對(duì)侵染后的所述分生組織塊進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇標(biāo)記物；

選擇未被殺死和/或未被抑制的植物細(xì)胞。

具體地，所述細(xì)胞分裂素為1mg/l6-芐基腺嘌呤和2mg/l玉米素的任意一種或任意組合。

進(jìn)一步地，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。

所述預(yù)處理還包括所述分生組織塊創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-4分鐘。

具體地，所述外施包括滴加、噴施或涂抹。

具體地，所述als抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

更具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆1-7μg。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆3μg。

可選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-9天。

優(yōu)選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

進(jìn)一步地，所述農(nóng)桿菌菌株還包括賦予除草劑耐受性的基因和/或昆蟲(chóng)抗性的基因。

具體地，所述賦予除草劑耐受性的基因編碼如下除草劑耐受性蛋白質(zhì)：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還原酶、草甘膦-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)和/或原卟啉原氧化酶。

具體地，所述昆蟲(chóng)抗性的基因包括cry類基因或vip類基因。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有seqidno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與seqidno:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，其中，包括：

大豆種子萌發(fā)后去除一片子葉和第一片真葉，獲得帶有一片子葉的裸露分生組織；

所述帶有一片子葉的裸露分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理；

包含編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的農(nóng)桿菌菌株侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊；

侵染后的所述分生組織塊與所述農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)；

通過(guò)外施als抑制劑對(duì)上述共培養(yǎng)后的分生組織塊進(jìn)行篩選培養(yǎng)，并以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇標(biāo)記物選擇轉(zhuǎn)化的抗性組織；

轉(zhuǎn)化的抗性組織再生為大豆植物。

具體地，所述細(xì)胞分裂素為1mg/l6-芐基腺嘌呤和2mg/l玉米素的任意一種或任意組合。

進(jìn)一步地，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。

所述預(yù)處理還包括所述分生組織塊創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-4分鐘。

具體地，所述外施包括滴加、噴施或涂抹。

具體地，所述als抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

更具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆1-7μg。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時(shí)，每毫升增殖培養(yǎng)基外施苯磺隆3μg。

可選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-9天。

優(yōu)選地，外施苯磺隆前在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

所述轉(zhuǎn)化的抗性組織再生為大豆植物具體為通過(guò)外施als抑制劑使得所述轉(zhuǎn)化的抗性組織在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化成大豆植物。

可選地，所述als抑制劑為苯磺隆時(shí)，每毫升分化培養(yǎng)基外施苯磺隆3-7μg。

優(yōu)選地，所述als抑制劑為苯磺隆時(shí)，每毫升分化培養(yǎng)基外施苯磺隆7μg。

可選地，外施苯磺隆前在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-20天。

優(yōu)選地，外施苯磺隆前在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18天。

進(jìn)一步地，所述農(nóng)桿菌菌株還包括賦予除草劑耐受性的基因和/或昆蟲(chóng)抗性的基因。

具體地，所述賦予除草劑耐受性的基因編碼如下除草劑耐受性蛋白質(zhì)：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還原酶、草甘膦-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)和/或原卟啉原氧化酶。

具體地，所述昆蟲(chóng)抗性的基因包括cry類基因或vip類基因。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有seqidno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與seqidno:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明中的克隆基因、表達(dá)盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白和蛋白片段、以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞核植物均可使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)。

本發(fā)明可用于在植物中表達(dá)任何目的基因。目的基因可以是耐除草劑基因、抗病基因或抗蟲(chóng)基因，或者是選擇或評(píng)價(jià)標(biāo)記，并含有植物可操作的啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子區(qū)。耐除草劑基因包括對(duì)咪唑啉酮或磺酰脲除草劑耐受的ahas基因、對(duì)草丁膦除草劑耐受的pat或bar基因、對(duì)草甘膦除草劑耐受的epsps基因，對(duì)2,4-d除草劑耐受的aad基因，對(duì)hppd抑制劑耐受的hppd基因等?？共』虬股睾铣擅富?，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物來(lái)源的抗性基因等?？瓜x(chóng)基因包括蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)基因。目的基因也可以編碼與生物化學(xué)途徑有關(guān)的酶，該酶的表達(dá)可改變食物、飼料、營(yíng)養(yǎng)藥和/或藥物生產(chǎn)中重要的性狀。目的基因可以位于質(zhì)粒上。適合本發(fā)明使用的質(zhì)粒可以含有一個(gè)以上目的基因和/或農(nóng)桿菌可含有帶有不同目的基因的不同質(zhì)粒。

本發(fā)明中所述植物可以為大豆，所述“大豆”是指glycinemax，所述方法是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因傳輸?shù)酱蠖辜?xì)胞，之后再生為轉(zhuǎn)化的大豆植物為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的方法獨(dú)立于栽培品種。

本發(fā)明中所述“選擇標(biāo)記物”是指這樣的基因或多核苷酸，其表達(dá)允許鑒別已經(jīng)用含有所述基因或多核苷酸dna構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇標(biāo)記物可以提供對(duì)毒性化合物的抗性，例如對(duì)抗生素、除草劑等。

本發(fā)明中“乙酰乳酸合酶或乙酰乳酸合成酶(als)”是指具有根據(jù)iubmb酶命名法ec2.2.1.6定義的活性的酶。酶催化兩個(gè)丙酮酸分子之間的反應(yīng)，產(chǎn)生2-乙酰乳酸和co2。酶需要二磷酸硫胺素，并且還可以稱為乙酰羥酸合酶(ahas)。

本發(fā)明中“als抑制劑”是指抑制野生型als蛋白質(zhì)的化合物，對(duì)含有野生型als的細(xì)胞是毒性的。此類化合物包括已知的除草劑，主要包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑并嘧啶類、嘧啶基硫代苯甲酸類或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

可以在本發(fā)明中使用的磺酰脲類化合物包括：1)苯基磺酰脲類，包括氯嘧磺隆、氟嘧磺隆、3-(4-乙基-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-1-(2,3-二氫-1,1-二氧代-2-甲基苯并[b]噻吩-7-磺酰基)-脲、3-(4-乙氧基-6-乙基-1,3,5-三嗪-2-基)-1-(2,3-二氫-1,1-二氧代-2-甲基苯并[b]噻吩-7-磺?；?-脲、苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、醚苯磺隆和甲嘧磺?。?)噻吩基磺酰脲類，如噻吩磺??；3)吡唑基磺酰脲類，包括吡嘧磺隆和甲基3-氯代-5-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基氨磺酰)-1-甲基-吡唑-4-羧酸酯；4)砜肼衍生物，包括酰嘧磺隆和結(jié)構(gòu)類似物；5)吡啶基磺酰脲基，包括煙嘧磺隆和dpx-e9636；6)苯氧基磺酰脲類。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的“植物繁殖體”包括但不限于植物有性繁殖體和植物無(wú)性繁殖體。所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無(wú)性繁殖體是指植物體的營(yíng)養(yǎng)器官或某種特殊組織，其可以在離體條件下產(chǎn)生新植株；所述營(yíng)養(yǎng)器官或某種特殊組織包括但不限于根、莖和葉，例如：以根為無(wú)性繁殖體的植物包括草莓和甘薯等；以莖為無(wú)性繁殖體的植物包括甘蔗和馬鈴薯(塊莖)等；以葉為無(wú)性繁殖體的植物包括蘆薈和秋海棠等。

本發(fā)明中所述“抗性”是可遺傳的，并允許植物在除草劑對(duì)給定植物進(jìn)行一般除草劑有效處理的情況下生長(zhǎng)和繁殖。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)可的，即使植物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認(rèn)為“抗性”。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“耐性”或“耐受性”比術(shù)語(yǔ)“抗性”更廣泛，并包括“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草劑誘導(dǎo)的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物損傷。

本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。

本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，dna典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于dna在植物中復(fù)制產(chǎn)生了dna的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對(duì)序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將dna的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mrna的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mrna實(shí)際上是從dna的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開(kāi)放閱讀框(orf)閱讀來(lái)形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的dna有相當(dāng)功能的rna。

本發(fā)明中多核苷酸或核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說(shuō)這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)诔Ｒ?guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)dna雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)處理，然后在50℃條件下用2.0×ssc洗滌，這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0×ssc、50℃到高度嚴(yán)格條件的約0.2×ssc、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴(yán)格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6×ssc、0.5％sds溶液中，在65℃下與本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶的核苷酸序列發(fā)生特異性雜交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜1次。

因此，具有除草劑耐受性活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶的核苷酸序列雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40％-50％同源，大約60％、65％或70％同源，甚至至少大約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。

本發(fā)明提供功能蛋白質(zhì)?！肮δ芑钚浴?或“活性”)在本發(fā)明中指本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)/酶(單獨(dú)或與其它蛋白質(zhì)組合)具有降解除草劑的能力。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的蛋白質(zhì)，從而在用除草劑處理植物時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)的水平足以給予植物對(duì)除草劑(若無(wú)特別說(shuō)明則為一般用量)完全或部分的抗性或耐性。可以以通常殺死靶植物的用量、正常的大田用量和濃度使用除草劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞優(yōu)選具有磺酰脲類除草劑的抗性或耐性，即轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞能在有效量的磺酰脲類除草劑存在下生長(zhǎng)。

本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的除草劑耐受性活性特征的部分和/片段(包括與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有除草劑抗性活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。所述“等價(jià)蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的除草劑耐受性的生物活性的蛋白。

本發(fā)明中所述的dna分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始dna或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長(zhǎng)度可存在變化，但長(zhǎng)度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為除草劑耐受性蛋白質(zhì)。

由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的dna序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代dna序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的dna序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響除草劑耐受性活性的序列，亦包括保留除草劑耐受性活性的片段。

本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為：小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個(gè)甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個(gè)殘基長(zhǎng)。

保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代：堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，n.neurath和r.l.hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(academicpress)出版的《protein》中進(jìn)行了描述。最常見(jiàn)的互換有ala/ser，val/ile，asp/glu，thu/ser，ala/thr，ser/asn，ala/val，ser/gly，tyr/phe，ala/pro，lys/arg，asp/asn，leu/ile，leu/val，ala/glu和asp/gly，以及它們相反的互換。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)地，這種取代可以在對(duì)分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見(jiàn)，cunningham和wells，1989，science244：1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，檢測(cè)所得突變分子的除草劑抗性活性，從而確定對(duì)該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過(guò)其三維結(jié)構(gòu)的分析來(lái)測(cè)定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測(cè)定(參見(jiàn)，如devos等，1992，science255：306-312；smith等，1992，j.mol.biol224:899-904；wlodaver等，1992，febsletters309：59-64)。

本發(fā)明中，編碼磺酰脲類除草劑水解酶的氨基酸序列包括但不限于本發(fā)明序列表中涉及的序列，與其具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60％，優(yōu)選的大于75％，更優(yōu)選的大于80％，甚至更優(yōu)選的大于90％，并且可以大于95％。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或類似性。

本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述磺酰脲類除草劑水解酶基因的調(diào)節(jié)序列。

所述啟動(dòng)子為植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子的示例包括但不限于，來(lái)源于花椰菜花葉病毒的35s啟動(dòng)子、玉米u(yù)bi啟動(dòng)子、水稻gos2基因的啟動(dòng)子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組織特異的啟動(dòng)子，即該啟動(dòng)子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過(guò)常規(guī)rna試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定)，如pep羧化酶啟動(dòng)子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動(dòng)子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲(chóng)啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長(zhǎng)條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pinⅰ和pinⅱ)和玉米蛋白酶抑制基因(mpi)的啟動(dòng)子。

所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號(hào)序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對(duì)受體蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘kdel’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的ctpp靶向液泡。

所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小rna病毒前導(dǎo)序列，如emcv前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯y病毒組前導(dǎo)序列，如mdmv(玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(bip)；苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mrna的不翻譯前導(dǎo)序列(amvrna4)；煙草花葉病毒(tmv)前導(dǎo)序列。

所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(camv)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(fmv)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(cerv)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(csvmv)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(mmv)增強(qiáng)子、夜香樹(shù)黃化曲葉病毒(cmylcv)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(clcumv)、鴨跖草黃斑駁病毒(coymv)和花生褪綠線條花葉病毒(pclsv)增強(qiáng)子。

對(duì)于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻act1內(nèi)含子。對(duì)于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，cat-1內(nèi)含子、pkannibal內(nèi)含子、piv2內(nèi)含子和“超級(jí)泛素”內(nèi)含子。

所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號(hào)序列，包括但不限于，來(lái)源于農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)胭脂堿合成酶(nos)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于蛋白酶抑制劑ⅱ(pinⅱ)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于豌豆ssrubiscoe9基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列和來(lái)源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列。

本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì)相連序列來(lái)說(shuō)需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動(dòng)子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示：?jiǎn)?dòng)子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動(dòng)子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開(kāi)放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供dna轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即t-dna邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。

本發(fā)明中所述“宿主細(xì)胞”是指在宿主細(xì)胞基因組中，或者在獨(dú)立于宿主細(xì)胞的基因組而自主復(fù)制的染色體外載體中含有目標(biāo)重組核酸的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型。

本發(fā)明中所述“轉(zhuǎn)化”是指將dna引入細(xì)胞，從而dna以染色體外元件或染色體整合體形式維持在細(xì)胞內(nèi)。

多核苷酸可以被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，或者存在于在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的載體上。

本發(fā)明中，將外源dna導(dǎo)入植物，如將編碼所述磺酰脲類除草劑水解酶的基因或表達(dá)盒或重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將dna攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的dna導(dǎo)入。

能使用不同農(nóng)桿菌菌株，包括但不限于根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌。優(yōu)選使用可轉(zhuǎn)化態(tài)菌株，合適根癌農(nóng)桿菌菌株包括菌株a208、菌株eha101、lba4404。合適毛根農(nóng)桿菌包括菌株k599?？赊D(zhuǎn)化態(tài)農(nóng)桿菌載體的構(gòu)建為本領(lǐng)域所熟知的。

在選擇劑存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。優(yōu)選地，用磺酰脲類除草劑水解酶(sule)基因轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化的基因在磺酰脲類除草劑存在的情況下培養(yǎng)。在含有磺酰脲類除草劑為選擇劑的培養(yǎng)基中，sule基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。

含有異源核酸(即含有按照本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織)的轉(zhuǎn)基因植物以及通過(guò)該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和后代是本發(fā)明所涉及的。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)成有用栽培品種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。植物組織體外培養(yǎng)技術(shù)和整個(gè)植株再生技術(shù)也是公知的。相應(yīng)的，所述“種子”包括這些轉(zhuǎn)化植物的種子以及轉(zhuǎn)化植物后代產(chǎn)生的種子。所述“植物”不僅包括轉(zhuǎn)化和再生的植物，還包括通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化和再生植物的后代。

可以從本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物中篩選成功的轉(zhuǎn)化植物。為了開(kāi)發(fā)改良的植物和種子品系，可以持續(xù)地篩選和選擇本發(fā)明再生植物的種子和子代植物以使轉(zhuǎn)基因和整合的核酸序列持續(xù)存在。因此，可以將所需要的轉(zhuǎn)基因核酸序列移入(即漸滲或交配)其它的遺傳品系如某些原種或商業(yè)上有用的品系或品種中。漸滲目的基因進(jìn)入遺傳植物品系的方法可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括通過(guò)傳統(tǒng)的育種、原生質(zhì)體融合、細(xì)胞核轉(zhuǎn)移以及染色體轉(zhuǎn)移。育種方法和技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物和自交系可用于生產(chǎn)商業(yè)上有價(jià)值的雜交植物和農(nóng)作物。

本發(fā)明提供了一種提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、與現(xiàn)有技術(shù)將選擇劑配置于培養(yǎng)基中不同，本發(fā)明首次提出在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中以外施的方式(特別是滴加)將選擇劑(如苯磺隆)加入增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中，其后代陽(yáng)性植株率和轉(zhuǎn)化效率顯著提高，為在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用選擇劑提供了新的思路。

2、優(yōu)化了篩選體系。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，不僅提供了磺酰脲類除草劑作為選擇劑時(shí)新的使用方式和篩選方式，并優(yōu)化了有效的篩選濃度范圍，從而獲得了對(duì)als抑制劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因植株。

3、轉(zhuǎn)化效率高，降低轉(zhuǎn)化成本。本發(fā)明以磺酰脲類除草劑作為選擇劑時(shí)，以優(yōu)化的篩選濃度通過(guò)外施的方式(特別是滴加)加入選擇劑進(jìn)行篩選，其后代獲得陽(yáng)性植株的比例顯著升高，轉(zhuǎn)化效率可高達(dá)20％以上，同時(shí)以外施的方式(特別是滴加)可以使選擇劑得到有效利用，降低了植物遺傳轉(zhuǎn)化的成本。

4、商業(yè)價(jià)值高?；酋ｋ孱惓輨閮?nèi)吸型除草劑，本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)磺酰脲類除草劑的耐受性較高，且其后代能穩(wěn)定遺傳，可直接開(kāi)發(fā)成耐受磺酰脲類作物用于產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法的重組克隆載體dbn01-t構(gòu)建流程圖；

圖2為本發(fā)明提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法的重組表達(dá)載體dbn100954構(gòu)建流程圖；

圖3為本發(fā)明提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法的轉(zhuǎn)化大豆組織的效果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法的技術(shù)方案。

第一實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、構(gòu)建含有目的基因的重組克隆載體

將sule核苷酸序列連入克隆載體pgem-t(promega，madison，usa，cat：a3600)上，操作步驟按promega公司產(chǎn)品pgem-t載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到重組克隆載體dbn01-t，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復(fù)制起點(diǎn)；lacz為lacz起始密碼子；sp6為sp6rna聚合酶啟動(dòng)子；t7為t7rna聚合酶啟動(dòng)子；sule為磺酰脲類除草劑水解酶基因核苷酸序列(seqidno:1)；mcs為多克隆位點(diǎn))。

然后將重組克隆載體dbn01-t用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞(transgen，beijing，china，cat：cd501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒dna(重組克隆載體dbn01-t)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))，在表面涂有iptg(異丙基硫代-β-d-半乳糖苷)和x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/l)的lb平板(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，瓊脂15g/l，用naoh調(diào)ph至7.5)上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在lb液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，氨芐青霉素100mg/l，用naoh調(diào)ph至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液i(25mmtris-hcl，10mmedta(乙二胺四乙酸)，50mm葡萄糖，ph8.0)懸浮；加入200μl新配制的溶液ii(0.2mnaoh，1％sds(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液iii(3m醋酸鉀，5m醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(v/v)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含rnase(20μg/ml)的te(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化rna；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)apai和ecorv酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體dbn01-t中插入的sule基因序列為序列表中seqidno:1所示的核苷酸序列。

2、構(gòu)建含有目的基因的重組表達(dá)載體

用限制性內(nèi)切酶spei和sali分別酶切重組克隆載體dbn01-t和表達(dá)載體dbnbc-01(載體骨架：pcambia2301(cambia機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的sule基因序列插到表達(dá)載體dbnbc-01的spei和sali位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體dbn100954，其構(gòu)建流程如圖2所示(kan：卡那霉素基因；rb：右邊界；pr35s：花椰菜花葉病毒35s基因的啟動(dòng)子(seqidno:3)；sule：磺酰脲類除草劑水解酶基因核苷酸序列(seqidno:1，其氨基酸序列如seqidno:2所示)；t35s：花椰菜花葉病毒35s基因的終止子(seqidno:4)；lb：左邊界)。

將重組表達(dá)載體dbn100954用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒dna(重組表達(dá)載體dbn100954)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))；然后在含50mg/l卡那霉素(kanamycin)的lb固體平板(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，瓊脂15g/l，用naoh調(diào)ph至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在lb液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，卡那霉素50mg/l，用naoh調(diào)ph至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶spei和sali酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體dbn100954在spei和sali位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中seqidno:1所示核苷酸序列，即sule核苷酸序列。

3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

對(duì)己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體dbn100954用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌lba4404(invitrgen，chicago，usa，cat：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌lba4404、3μl質(zhì)粒dna(重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37℃溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌lba4404接種于lb試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/l的利福平(rifampicin)和100mg/l的卡那霉素(kanamycin)的lb平板上直至長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶apali和ecorv酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體dbn100954結(jié)構(gòu)完全正確。

第二實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因大豆植株的獲得

大豆種子消毒：取完全干透的成熟大豆種子(中黃13)放在培養(yǎng)皿中，數(shù)量約占培養(yǎng)皿的1/3。將其放在通風(fēng)櫥的干燥器中，干燥器中放置250ml大燒杯，里面裝有120ml次氯酸鈉。沿著燒杯壁逐滴加入6ml濃鹽酸，關(guān)閉干燥器并密封蓋好，同時(shí)關(guān)閉通風(fēng)櫥的玻璃，使大豆種子暴露于通風(fēng)櫥內(nèi)的氯氣中滅菌3小時(shí)；蓋好培養(yǎng)皿蓋后將其拿出搖晃2-3分鐘。重復(fù)上述過(guò)程一次，并將裝有大豆種子的培養(yǎng)皿放置通風(fēng)櫥過(guò)夜滅菌。

大豆種子萌發(fā)：將消毒后的大豆種子15粒接種在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、瓊脂8g/l，ph5.6)上進(jìn)行萌發(fā)，培養(yǎng)條件為：溫度25±1℃，光周期為16/8h，大豆種子的種臍一側(cè)插入培養(yǎng)基，接種后用保鮮膜將培養(yǎng)皿包好。

在本實(shí)施例的萌發(fā)培養(yǎng)基中，b5鹽還可以為n6鹽(濃度為3.95g/l)或ms鹽(濃度為4.3g/l)，蔗糖的濃度可以為5-100g/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述萌發(fā)培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、瓊脂8g/l，ph5.6)為優(yōu)選。

預(yù)處理外植體：萌發(fā)1天后，去除1片子葉和第1片真葉，將該裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基(ms鹽4.3g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、瓊脂8g/l、2-嗎啉乙磺酸(mes)4g/l、玉米素(zt)2mg/l、6-芐基腺嘌呤(6-bap)1mg/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l，ph5.3)，在此步驟中加入了細(xì)胞分裂素，使分生組織區(qū)的細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，同時(shí)在培養(yǎng)基還加入了as以促進(jìn)外源基因的整合，預(yù)處理2-5天，優(yōu)選為3天，將預(yù)處理后的分生組織塊用解剖刀的刀背進(jìn)行創(chuàng)傷(至少3刀，優(yōu)選為5刀)，創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-5分鐘，優(yōu)選為3分鐘。

在本實(shí)施例的預(yù)處理培養(yǎng)基中，ms鹽還可以為n6鹽(濃度為3.95g/l)或b5鹽(濃度為3.1g/l)，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，mes的濃度可以為0.1-5g/l，zt的濃度可以為0.1-5mg/l，6-bap的濃度可以為0.1-5g/l，as的濃度可以為10-50mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述預(yù)處理培養(yǎng)基(ms鹽4.3g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、瓊脂8g/l、mes4g/l、zt2mg/l、6-bap1mg/l、as40mg/l，ph5.3)為優(yōu)選。

農(nóng)桿菌菌液的制備：將農(nóng)桿菌菌株從-80℃冰箱中取出，挑取含有dbn100954的農(nóng)桿菌單菌落，用槍頭在加有卡那霉素(kanamycin)的固體yp培養(yǎng)板(酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂8g、卡那霉素25mg/l，ph7.0)上劃線，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)2-3天。刮取yp培養(yǎng)板上的菌斑，在新的yp培養(yǎng)板上再培養(yǎng)1天；刮取培養(yǎng)3-4天的菌落，放入裝有30ml侵染液(即侵染培養(yǎng)基(ms鹽2.15g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、as40mg/l、mes4g/l、zt2mg/l，ph5.3))的50ml離心管中，不斷搖晃以使菌體完全稀釋在侵染液中，將稀釋好的農(nóng)桿菌菌液倒入裝有150ml侵染液的250ml玻璃瓶(滅菌)中，定容，將農(nóng)桿菌菌液的濃度調(diào)整為od660＝0.5-0.8，待用。

在本實(shí)施例的侵染培養(yǎng)基中，ms鹽還可以為n6鹽(濃度為3.95g/l)或b5鹽(濃度為3.1g/l)，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，葡萄糖的濃度可以為5-100g/l，as的濃度可以為10-50mg/l，mes的濃度可以為0.1-5g/l，zt的濃度可以為0.1-5mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述侵染培養(yǎng)基(ms鹽2.15g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、as40mg/l、mes4g/l、zt2mg/l，ph5.3)為優(yōu)選。

農(nóng)桿菌侵染大豆分生組織塊：將農(nóng)桿菌菌液(10-15ml)接觸上述超聲波處理后的大豆分生組織塊的子葉節(jié)組織一起放置至少3小時(shí)，優(yōu)選為5小時(shí)；侵染結(jié)束后將農(nóng)桿菌菌液吸出，并用濾紙將附著在大豆分生組織塊上的農(nóng)桿菌菌液徹底吸干。

農(nóng)桿菌與大豆分生組織塊共培養(yǎng)：將吸干農(nóng)桿菌菌液的分生組織塊轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(ms鹽4.3g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、mes4g/l、zt2mg/l、瓊脂8g/l，ph5.6)上，培養(yǎng)基中放置一張濾紙，并且子葉近軸面向上，每皿15粒，在22℃恒溫暗培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2-5天，優(yōu)選為3天。

在本實(shí)施例上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，葡萄糖的濃度可以為5-100g/l，mes的濃度可以為0.1-5g/l，zt的濃度可以為0.1-5mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基(ms鹽4.3g/l、b5維他命、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、mes4g/l、zt2mg/l、瓊脂8g/l，ph5.6)為優(yōu)選。

大豆分生組織塊的恢復(fù)：將共培養(yǎng)后的分生組織塊的伸長(zhǎng)的胚軸切掉，然后將切掉胚軸后的分生組織塊轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、zt2mg/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、谷氨酸100mg/l、天冬氨酸100mg/l，ph5.6)上，恢復(fù)2-5天，優(yōu)選為3天，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。

在本實(shí)施例上述恢復(fù)培養(yǎng)基中，mes的濃度可以為0.1-5g/l，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，zt的濃度可以為0.1-5mg/l，頭孢霉素100-300mg/l，谷氨酸50-200mg/l，天冬氨酸50-200mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述恢復(fù)培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、zt2mg/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、谷氨酸100mg/l、天冬氨酸100mg/l，ph5.6)為優(yōu)選。

大豆分生組織塊的篩選：恢復(fù)期結(jié)束后，將分生組織塊轉(zhuǎn)移到無(wú)選擇劑(苯磺隆)的60ml增殖培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、6-bap1mg/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、谷氨酸100mg/l、天冬氨酸100mg/l，ph5.6)上，能使大豆的分生組織塊快速的生長(zhǎng)，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下篩選培養(yǎng)5-9天，優(yōu)選為7天。上述大豆分生組織塊增殖5-9天后，分別按每毫升增殖培養(yǎng)基外施1、3、5和7μg苯磺隆除草劑(95％苯磺隆可濕性粉劑)的濃度，用移液器向所述增殖培養(yǎng)基中滴加稀釋后的苯磺隆除草劑溶液，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下篩選培養(yǎng)2周。

在本實(shí)施例所述增殖培養(yǎng)基中，b5鹽還可以為n6鹽(濃度為3.95g/l)或ms鹽(濃度為4.3g/l)，mes的濃度可以為0.1-5g/l，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，6-bap的濃度可以為0.1-5mg/l，頭孢霉素100-300mg/l，谷氨酸50-200mg/l，天冬氨酸50-200mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述增殖培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、6-bap1mg/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、谷氨酸100mg/l、天冬氨酸100mg/l，ph5.6)為優(yōu)選。

大豆抗性組織塊再生成植物：分別將上述4種濃度苯磺隆篩選處理后的抗性組織塊從含苯磺隆的所述增殖培養(yǎng)基中取出，切掉其上死去的組織和附著在上面的子葉，將抗性組織塊轉(zhuǎn)移到(斜插入)無(wú)選擇劑(苯磺隆)的b5分化培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、zt1mg/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、谷氨酸50mg/l、天冬氨酸50mg/l、赤霉素1mg/l、生長(zhǎng)素1mg/l，ph5.6)上，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下培養(yǎng)分化14-20天，優(yōu)選為18天。上述4種篩選處理后大豆抗性組織塊分化生長(zhǎng)14-20天后，分別按每毫升b5分化培養(yǎng)基外施3、5和7μg苯磺隆除草劑(95％苯磺隆可濕性粉劑)的濃度，用移液器向所述b5分化培養(yǎng)基中滴加稀釋后的苯磺隆除草劑溶液，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下繼續(xù)篩選培養(yǎng)直到抗性組織塊(轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)再生成植物或已再生的植株能夠存活。

在本實(shí)施例上述b5分化培養(yǎng)基中，mes的濃度可以為0.1-5g/l，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，zt的濃度可以為0.1-5mg/l，頭孢霉素100-300mg/l，谷氨酸50-200mg/l、天冬氨酸50-200mg/l，赤霉素0.1-5mg/l，生長(zhǎng)素0.1-5mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述b5分化培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、zt1mg/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、谷氨酸50mg/l、天冬氨酸50mg/l、赤霉素1mg/l、生長(zhǎng)素1mg/l，ph5.6)為優(yōu)選。

在本實(shí)施例上述大豆分生組織塊的篩選步驟和大豆抗性組織塊再生成植物步驟中，按每毫升增殖培養(yǎng)基或b5分化培養(yǎng)基外施苯磺隆除草劑(95％苯磺隆可濕性粉劑)的濃度，向增殖培養(yǎng)基或b5分化培養(yǎng)基中滴加稀釋后的苯磺隆除草劑溶液的示例如表1所示。對(duì)增殖后的大豆分生組織塊進(jìn)行苯磺隆除草劑耐受性篩選，12種處理的具體信息如表2所示，每個(gè)處理的篩選結(jié)果如表3所示，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

表1、外施苯磺隆除草劑的示例

注：苯磺隆除草劑滴加質(zhì)量(μg/皿)＝稀釋后苯磺隆除草劑溶液濃度(μg/ml)×稀釋后苯磺隆除草劑溶液的滴加體積(ml)；苯磺隆除草劑滴加濃度(μg/ml培養(yǎng)基)＝苯磺隆除草劑滴加質(zhì)量(μg/皿)/培養(yǎng)基體積(ml/皿)。

表2、對(duì)大豆分生組織塊進(jìn)行12種不同苯磺隆篩選處理的具體信息

將上述12種處理分化出來(lái)的小苗轉(zhuǎn)移到b5生根培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、吲哚-3-丁酸(iba)1mg/l，ph5.6)上，在25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于26℃下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20℃下培養(yǎng)8小時(shí)，可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。

在本實(shí)施例上述b5生根培養(yǎng)基中，mes的濃度可以為0.1-5g/l，蔗糖的濃度可以為5-100g/l，頭孢霉素100-300mg/l，iba的濃度可以為0.1-5mg/l；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述b5生根培養(yǎng)基(b5鹽3.1g/l、b5維他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、瓊脂8g/l、頭孢霉素150mg/l、iba1mg/l，ph5.6)為優(yōu)選。

在本實(shí)施例中，除苯磺隆外，其它均采用優(yōu)選方案。

第三實(shí)施例、用taqman驗(yàn)證轉(zhuǎn)入sule核苷酸序列的大豆植株

分別取上述12種處理后的轉(zhuǎn)入sule核苷酸序列的大豆植株的葉片約100mg作為樣品，用qiagen的dneasyplantmaxikit提取其基因組dna，通過(guò)taqman探針熒光定量pcr方法檢測(cè)sule基因的拷貝數(shù)。同時(shí)以野生型大豆植株作為對(duì)照，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

檢測(cè)sule基因拷貝數(shù)的具體方法如下：

步驟11、分別取上述12種處理后的轉(zhuǎn)入sule核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的葉片各100mg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)；

步驟12、使用qiagen的dneasyplantminikit提取上述樣品的基因組dna，具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；

步驟13、用nanodrop2000(thermoscientific)測(cè)定上述樣品的基因組dna濃度；

步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組dna濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80-100ng/μl；

步驟15、采用taqman探針熒光定量pcr方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過(guò)鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型大豆植株的樣品作為對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平均值；熒光定量pcr引物和探針序列分別是：

以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)sule核苷酸序列：

引物1：tgggagaggaaggggtaacat，如序列表中seqidno:5所示；

引物2：tatctctcacccaggcacctt，如序列表中seqidno:6所示；

探針1：acggacctttcggacagttggagga，如序列表中seqidno:7所示；

pcr反應(yīng)體系為：

所述50×引物/探針混合物包含1mm濃度的每種引物各45μl，100μm濃度的探針50μl和860μl1×te緩沖液，并且在4℃，貯藏在琥珀試管中。

pcr反應(yīng)條件為：

利用sds2.3軟件(appliedbiosystems)分析數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sule核苷酸序列整合到部分所檢測(cè)的大豆植株的染色體組(即陽(yáng)性植株)中，12種處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和圖3所示。

表3、12種處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：陽(yáng)性植株率(％)＝陽(yáng)性植株數(shù)(株)/出苗數(shù)(株)×100％；

轉(zhuǎn)化效率(％)＝陽(yáng)性植株數(shù)(株)/起始萌發(fā)大豆數(shù)量(個(gè))×100％。

由表3可得，在轉(zhuǎn)化過(guò)程的大豆分生組織塊的篩選步驟和大豆抗性組織塊再生成植物步驟中，按每毫升增殖培養(yǎng)基或b5分化培養(yǎng)基外施苯磺隆除草劑(95％苯磺隆可濕性粉劑)的濃度，通過(guò)向增殖培養(yǎng)基或b5分化培養(yǎng)基中滴加稀釋后的苯磺隆除草劑溶液的方式進(jìn)行篩選，上述12種處理均能獲得較高的陽(yáng)性植株率和轉(zhuǎn)化效率，尤以處理6為佳，轉(zhuǎn)化效率可高達(dá)20％以上。

綜上所述，與現(xiàn)有技術(shù)將選擇劑配置于培養(yǎng)基中不同，本發(fā)明首次提出在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中以外施的方式(特別是滴加)將選擇劑(如苯磺隆)加入增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中，其后代陽(yáng)性植株率和轉(zhuǎn)化效率顯著提高，為在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用選擇劑提供了新的思路；本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，不僅提供了磺酰脲類除草劑作為選擇劑時(shí)新的使用方式和篩選方式，并優(yōu)化了有效的篩選濃度范圍，從而獲得了對(duì)als抑制劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因植株；本發(fā)明以磺酰脲類除草劑作為選擇劑時(shí)，以優(yōu)化的篩選濃度通過(guò)外施的方式(特別是滴加)加入選擇劑進(jìn)行篩選，其后代獲得陽(yáng)性植株的比例顯著升高，轉(zhuǎn)化效率可高達(dá)20％以上，同時(shí)以外施的方式(特別是滴加)可以使選擇劑得到有效利用，降低了植物遺傳轉(zhuǎn)化的成本；同時(shí)本發(fā)明使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株商業(yè)價(jià)值高、抗性好且遺傳穩(wěn)定。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。

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<110>北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司

<120>提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法

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