本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種特異靶向擬南芥ilk2基因的sgrna序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

zfn、talen和crispr基因打靶技術(shù)是基因編輯的核心技術(shù)，相比于前兩種技術(shù)繁瑣的構(gòu)建程序，比如每一個位點需要構(gòu)建一對相應(yīng)的核酸酶，并且高度依賴目標(biāo)上下游序列，crispr/cas9系統(tǒng)對特異位點的識別靠小的sgrna的引導(dǎo)，sgrna區(qū)可以由一系列針對不同基因的多個sgrna組成，每個針對特異位點的sgrna只有二十個堿基，整個載體較小，criepr載體更加容易構(gòu)建，其基因編輯也更加高效。

crispr/cas9原是細(xì)菌和古細(xì)菌應(yīng)對外源病毒侵害的防御系統(tǒng)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚、水稻等進行基因改造。它由導(dǎo)向序列sgrna和核酸酶cas9兩種元件組成，sgrna可通過堿基互補識別基因組中特定序列從而引導(dǎo)核酸酶cas9對其進行切割造成雙鏈dna斷裂(double-strandbreaks，dsb)，當(dāng)宿主細(xì)胞通過非同源重組方式進行修復(fù)，發(fā)生非同源重組末端連接(non-homologousendjoining，nhej)，就可能造成移碼突變(frameshiftmutation)，導(dǎo)致基因沉默(multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science.congetal.2013)。

這一技術(shù)由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關(guān)注，但是，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)也存在一定的局限性，就是在非目標(biāo)區(qū)域會產(chǎn)生dna的突變即脫靶效應(yīng)，這在一定程度上阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用(high-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbycrispr-casnucleasesinhumancells.naturebiotechnology.fuetal，2013；high-throughputprofilingofoff-targetdnacleavagerevealsrna-programmedcas9nucleasespecificity.naturebiotechnology.pattanayaketal，2013)。麻省理工學(xué)院張峰團隊使用雙切刻技術(shù)將cas9的特異性提高了50倍以上，穩(wěn)固了cas9在基因打靶技術(shù)領(lǐng)域的地位(doublenickingbyrna-guidedcrisprcas9forenhancedgenomeeditingspecificity.cell.ranetal，2013)。借助于這一技術(shù)，動植物基因功能研究及育種等領(lǐng)域都將得到迅猛的發(fā)展。精確靶向目標(biāo)基因是crispr-cas9能否特異性沉默目標(biāo)基因的先決條件，無論是脫靶還是錯誤靶向，都會影響crispr-cas9對目標(biāo)基因的特異性沉默。因此，設(shè)計、制備出特異性靶向目標(biāo)基因序列的sgrna成為了crispr-cas9基因沉默技術(shù)的關(guān)鍵。

擬南芥基因ilk2編碼蛋白屬于整合素連接蛋白激酶家族，具有絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶活性。能與mapk、pkb、gsk3等多條信號通路和細(xì)胞骨架蛋白相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞周期g1/s/g2期，抑制細(xì)胞凋亡等過程。在擬南芥中相關(guān)家族蛋白參與多種生物與非生物逆境，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和植物免疫等方面有重要作用(theraf-likekinaseilk1andthehighaffinityk⁺transporterhak5arerequiredforinnateimmunityandabioticstressresponse.plantphysiology.elizabethetal，2016)。因此，在基因組水平上對擬南芥整合素連接蛋白激酶家族相關(guān)基因進行敲除或修飾，有助于解析相關(guān)基因的功能，為農(nóng)作物抗性育種提供理論支持和實踐參考。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異靶向擬南芥整合素連接蛋白激酶家族基因ilk2的sgrna導(dǎo)向序列及其應(yīng)用。本發(fā)明利用編碼這種sgrna序列的dna構(gòu)建植物表達載體，該表達載體能夠表達出這種sgrna，這種sgrna能夠特異性地識別擬南芥ilk2基因。本發(fā)明還利用這對sgrna引導(dǎo)cas9核酸酶(即cas9切割酶)對擬南芥ilk2基因進行準(zhǔn)確、高效地靶向修飾。

具體地，本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明的目的是提供一種敲除擬南芥ilk2基因的方法，提供了敲除擬南芥ilk2基因的sgrna，及用于敲除擬南芥ilk2基因的載體。

本發(fā)明的敲除擬南芥ilk2基因的sgrna序列，其序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的用于編碼本發(fā)明的敲除擬南芥ilk2基因的sgrna的dna序列，所述dna序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明的用于敲除擬南芥ilk2基因的載體，所述載體為含有能表達特異性靶向ilk2基因第一外顯子的sgrna的dna序列(序列如seqidno.2所示)和cas9蛋白dna序列的植物表達載體。

優(yōu)選的，sgrna的dna序列上游為擬南芥u6啟動子，cas9蛋白dna序列上游為擬南芥u1啟動子，篩選標(biāo)記為潮霉素抗性。

本發(fā)明的靶向敲除擬南芥ilk2基因的載體構(gòu)建方法，按以下步驟進行：

(1)確定ilk2基因的合適的靶標(biāo)序列，所述靶標(biāo)序列如seqidno.3所示；

(2)將靶標(biāo)序列去除末端agg獲得sgrna編碼序列，其dna序列見seqidno.2所示；將seqidno.2序列反向互補獲得sgrna的反向互補序列，其dna序列見seqidno.4所示；

(3)在sgrna編碼序列的5端引入4個額外的堿基gatt，獲得seqidno.5序列；在sgrna編碼序列的反向互補序列的5端引入4個額外的堿基aaac，獲得seqidno.6序列；人工合成seqidno.5和seqidno.6的序列后并將其制備成oligo二聚體；

(4)將制備好的oligo二聚體連接至載體cas9的u6啟動子下游，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α獲得cas9-ilk2ko載體。

本發(fā)明還涉及一對用于鑒定所述sgrna序列敲除效果的引物對，所述引物對的序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)敲除載體cas9-ilk2ko轉(zhuǎn)化擬南芥后，即可實現(xiàn)高效、快速、特異對擬南芥ilk2基因進行敲除。

2)可直接用此做研究材料來探討ilk2基因的功能和作用機理。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為sgrna靶點設(shè)計結(jié)果示意圖，其中箭頭處代表cas9酶切位點。

圖2為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化得到的t1代植株抽提dna后進行pcr擴增，將pcr產(chǎn)物克隆后的部分測序結(jié)果(突變序列)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

cas9載體構(gòu)建方法：patubq-cas9-tubq(applicationofthecrispr-cassystemforefficientgenomeengineeringinplants.maoyeta1，2013)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通過雙酶切(ecori，hindiii)，連接(t4dna連接酶)到載體pcambia1300上，命名為cas9。bbsi內(nèi)切酶購自neb公司，貨號r0539s。dna寡核苷酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

實施例1、擬南芥ilk2基因目標(biāo)靶序列的獲得

在phytozome網(wǎng)站(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲取ilk2基因第一外顯子的編碼區(qū)序列，根據(jù)設(shè)計用于敲除的sgrna原則，確定出目標(biāo)靶序列，位于第一外顯子，見圖1，序列如下：

seqidno.3∶5’-cggcgagattcaagctaggtagg-3’

靶向編輯此dna序列的sgrna序列如下所示：

seqidno.1：5’-cggcgagauucaagcuaggu-3’

sgrna設(shè)計原則如下：

1.sgrna的長度，一般應(yīng)為20nt左右

2.gc％含量最佳為40％～60％，

3.sgrna靶向基因的結(jié)合位置需盡量靠近基因編碼區(qū)的atg下游，一般位于第一或第二外顯子。

4.sgrna的序列與脫靶位點的匹配數(shù)盡可能低。

5.如采用cas9單切口酶，設(shè)計paired-grna需考慮成對sgrna的間距。

6.如果構(gòu)建u6或t7啟動子驅(qū)動sgrna的表達載體，需考慮sgrna的5′堿基為g或gg，以提高其轉(zhuǎn)錄效率。

實施例2、擬南芥cas9-ilk2ko載體的構(gòu)建

(1)sgrna序列：目標(biāo)靶序列去除3端pam序列agg得到sgrna的編碼序列seqidno.2：5’-cggcgagattcaagctaggt-3’。

(2)sgrna編碼序列的反向互補序列：將sgrna序列反向互補獲得反向互補序列seqidno.4：5’-acctagcttgaatctcgccg-3’。

(3)合成單鏈dna寡核苷酸：根據(jù)所選擇的cas9載體的bbsi酶切位點，在sgrna序列的3端引入4個額外的堿基gatt，獲得seqidno.5序列；在sgrna反向互補序列的5端引入4個額外的堿基aaac，獲得seqidno.6序列。將seqidno.5和seqidno.6的序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成進行人工合成分別得到單鏈dna寡核苷酸forwardoligo與reverseoligo。

(4)oligo二聚體的制備：

將合成的oligo加水溶解至10μm，按下列反應(yīng)體系混合后，95℃加熱3分鐘，然后以約0.2℃/秒緩慢降至20℃，反應(yīng)在pcr儀上進行。

反應(yīng)體系為：

ddh2o：8ul

forwardoligo：1μl

reverseoligo：1μl

(5)酶切cas9載體：

載體cas9有bbsi酶切位點，用bbsi酶切。

酶切體系：

bbsi：1μl

10×nebuffer：2μl

質(zhì)粒：1μl

ddh2o：16μl

酶切條件為：37℃酶切1h

(6)構(gòu)建cas9-ilk2ko載體：

將酶切后的cas9載體與步驟(4)制得的oligo二聚體利用t4連接酶進行連接。

連接體系為：

oligo二聚體：2μl

cas9載體：2μl

10×nebt4dnaligasebuffer：1μl

t4dnaligase：1μl

ddh2o：4μl

連接條件為：16℃連接過夜

(7)轉(zhuǎn)化大腸桿菌：

將50μl感受態(tài)大腸桿菌dh5α加入(6)中的連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42℃熱刺激90s后，冰浴10min；加入800μllb液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)90min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫3000rpm離心1min收集菌體；在超凈臺上吸去上清，剩余約0.1ml時，使用移液槍混勻，接入帶有kan抗性的lb固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37℃過夜培養(yǎng)；挑取菌落接種于lb液體+kan的培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒。通過pcr檢測獲得的重組質(zhì)粒，并將pcr檢驗正確的重組質(zhì)粒送至上海博尚生物技術(shù)有限公司測序進行序列驗證，最后獲得目標(biāo)載體cas9-ilk2ko。

實施例3、cas9-ilk2ko轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌eha105

(1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備：

挑取農(nóng)桿菌eha105單菌落接種于5mlyeb培養(yǎng)基中，28℃、200rpm搖床培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例接種于50mlyeb培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)約6-7h至od600＝0.4-0.6。將菌液置于冰上30min；5000rpm，4℃離心5min，棄上清，將菌體懸于10ml0.15mcacl2中；5000rpm，4℃離心5min，棄上清，菌體用1ml20mmcacl2輕輕懸浮，每管50μl分裝，加入終濃度為20％的無菌甘油，-70℃保存。

(2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定：

將2μl載體cas9-ilk2kodna加入50μl農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混勻，冰浴30min，液氮冷凍4min，37℃水浴6min，加入1mlyeb培養(yǎng)基，28℃、200rpm搖床培養(yǎng)4h使菌體復(fù)蘇。培養(yǎng)結(jié)束后，常溫3000rpm離心1min收集菌體；在超凈臺上吸去上清，剩余約0.1ml時，使用移液槍混勻，接入帶有kan抗性的yeb固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；28℃過夜培養(yǎng)；2天后，挑取單菌落接種于yeb液體+kan的培養(yǎng)基，28℃、200rpm培養(yǎng)12h后，進行pcr鑒定。

實施例4、含cas9-ilk2ko載體的農(nóng)桿菌eha105轉(zhuǎn)化擬南芥

(1)擬南芥前處理(可選步驟)：

當(dāng)擬南芥主花序長至5cm長左右的時候，將其剪掉，一周后花序再次長出，此時花序較多并且生長狀態(tài)基本相同。

(2)農(nóng)桿菌擴大培養(yǎng)：

將含cas9-ilk2ko載體的農(nóng)桿菌eha105接種到100mlyeb培養(yǎng)基中，28℃、200rpm搖床培養(yǎng)18h。

(3)富集并重懸農(nóng)桿菌菌體：

將(2)中的農(nóng)桿菌菌液常溫3000rpm離心10min收集菌體，去上清，用5％蔗糖溶液重懸菌體，od600＝0.8-1.0。加入silwetl-77至終濃度為0.05％。

(4)侵染擬南芥：

擬南芥前一天澆水促進其生長。將擬南芥主花序浸入農(nóng)桿菌菌液中30s，并輕柔攪動，使整個花序覆蓋一層農(nóng)桿菌菌液。

(5)暗處理：

用保鮮膜包裹整個擬南芥植株，保持花序濕潤。用黑塑料袋包裹整盆擬南芥，放在暗處遮光生長24h。

(6)結(jié)束侵染：

去除遮蓋物之后，放在長日照下正常培養(yǎng)生長。當(dāng)角果變黃時候，可以收種，用含有潮霉素的固體ms培養(yǎng)基篩選陽性苗。

實施例5、擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

(1)擬南芥dna的提取

將適量的經(jīng)潮霉素篩選的擬南芥植株葉片放入1.5ml的離心管中，加入400μl的ctab抽提緩沖液，用藍色小棒研磨成漿狀，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，猛烈搖勻，12000rpm，離心10min。取上清至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3m醋酸鈉(ph5.2)，劇烈混勻使dna成團，放入-20℃沉淀2h以上。隨后12000rpm，離心10min。棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌一次后室溫晾干，加適量的te或超純水溶解。

(2)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

以抽提的擬南芥dna為模板，使用序列分別如seqidno.7和seqidno.8所示的引物checkf和checkr進行pcr擴增。

pcr反應(yīng)體系為：

pcrbuffer：2.5μl

taq：0.5μl

dna：2μl

dntp：2μl

checkf：1μl

checkr：1μl

ddh2o：16μl

pcr反應(yīng)條件為：

1.94℃5min

2.94℃變性30s

52℃退火30s

72℃延伸60s

35個循環(huán)

3.72℃10min

將pcr產(chǎn)物送至上海博尚生物技術(shù)有限公司進行序列測定并進行序列分析，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)靶序列出現(xiàn)了插入和缺失，將會產(chǎn)生移碼突變，產(chǎn)生不具有功能的蛋白，達到敲除基因的目的；見圖2。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。

sequencelisting

<110>上海交通大學(xué)

<120>特異靶向擬南芥ilk2基因的sgrna序列及其應(yīng)用

<130>dag29521

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>rna

<213>arabidopsisthaliana(l.)heynh.

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<220>

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<213>arabidopsisthaliana(l.)heynh.

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<223>artificialsequence

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cgagaagtcaagtcaggcaa20