基于AllGlo探針的rs3909184檢測分型試劑盒及其分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性(SNP),尤其是涉及一種基于AllGlo探針的rs3909184 檢測分型試劑盒及其分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。SNPs在人類基因組中廣泛存在,平均每500~1000個堿基對中就有1個,估計其總數(shù)可達 300萬個甚至更多。作為第三代遺傳標志,SNP與人體許多表型差異、藥物易感性與疾病易感 性密切相關(guān)。SNP在基因組中的大量存在,使其成為一個強有力的工具,在疾病定位與克隆、 藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中起了非常重要的作用。
[0003] 個體化診斷治療是未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的大方向。將個體化的靶點定位于某個基因,甚 至是單個核苷酸,發(fā)現(xiàn)疾病的遺傳標志物,將有助于根據(jù)每個患者的不同遺傳背景來開展 疾病預(yù)防、診斷和治療?;虻腟NP是形成個體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ),通過SNP與疾病和 藥物治療的關(guān)聯(lián)性分析,使得醫(yī)生不僅可以通過所檢測出的SNP預(yù)測、確定與疾病有關(guān)的基 因,同時也將能夠事先把握患者個體對于某種藥物的反應(yīng)特點,并根據(jù)這一特點選擇治療 效果最好,不良反應(yīng)等危險性最小的藥物對患者進行精準治療。
[0004] SNP在疾病的預(yù)防、診斷、治療及個體化醫(yī)學(xué)發(fā)展中扮演著重要的角色,因此準確 快速的進行SNP檢測分型具有重大的意義。目前,SNP分型的方法主要有直接測序技術(shù)法、限 制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)、Tagman熒光探針法、擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)、高分辨熔 解曲線分析法(HRM)等。其中,直接測序法是目前最直觀,準確性相對而言最高的SNP分型方 法,但其步驟多而分散,成本較高,工作量大,周期長,價格昂貴,不適合大樣本多位點檢測; 限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)作為一種最早的DNA標記技術(shù),對儀器要求低,只需要一 臺PCR儀以及電泳儀器即可進行實驗,但其實驗操作繁瑣,檢測周期長,不適合大樣本檢測; Tagman熒光探針法準確度較好,但其設(shè)計合成程序復(fù)雜,并且不適合多位點少量樣本的分 型,尤其是頻率偏低的位點;擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS法)快速、簡便,但是不能閉管操作,對 基因多態(tài)性分析難以實現(xiàn)高通量、自動化;高分辨熔解曲線分析法(HRM)具有簡單、快速等 優(yōu)點,但該方法特異性不足,儀器選擇少。
[0005] AllGlo探針作為新一代的熒光探針,在具備TaqMan-MGB探針優(yōu)點的基礎(chǔ)上,大大 提高信噪比,減少背景熒光信號。目前,AllGlo探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測皰疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突變(Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta,2011,412( 11-12) :1018-1021 )、侵襲性曲霉菌?。╓u,D.S.Shen,J. Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.ffu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0006] 藥物方面的研究發(fā)現(xiàn),人類白細胞抗原HLA-B*15 :02會顯著地增加卡馬西平藥物 不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險,導(dǎo)致致命的皮膚反應(yīng),例如史蒂文斯一約翰遜綜合征(SJS)和中毒性 表皮壞死松解癥(TEN) (Grover S,Kukreti R(2014)HLA alleles and hypersensitivity to carbamazepine: an updated systematic review with m e t a -analysis·Pharmacogenet Genomics 24:94-112·doi:10·1097/FPC.0000000000000021)〇 研究表明:HLA_B*15:02幾乎僅存在于亞洲人群(Caudle KE,RettieAE,Whirl_CarrilloM, Smith LH,Mintzer S,Le e MT,Klein TE, Callaghan JT(20 1 4)C1inica1 Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for CYP2C9and HLA-B genotypes and phenytoin dosing.Clin Pharmacol Ther 96:542-548·doi:10·1038/ clpt.2014.159),在中國、泰國、臺灣等部分區(qū)域10%-15%或更多的患者可能攜帶HLA-B* 15:02。他?1&1?顯示,在中國漢族人群中單核苷酸多態(tài)性位點^3909184可以作為!11^-8*15 : 02的一個標簽SNP,利用rs3909184的檢測分型能有效鑒別HLA-B*15:02,用藥前檢測患者 HLA-B*15:02,鑒別出藥物不良反應(yīng)個體,避免嚴重藥物毒副反應(yīng),為臨床治療用藥提供重 要的參考依據(jù)。在個體化診斷與治療快速發(fā)展的背景下,rs3909184作為HLA-B*15:02的標 簽SNP,與卡馬西平藥物不良反應(yīng)的密切聯(lián)系使其成為了一個極具醫(yī)學(xué)潛力的SNP位點,因 此急需一種更快速高效的SNP分型方法來滿足精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有檢測SNP方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的 上述缺陷,提供基于AllGlo探針的rs3909184檢測分型試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供基于AllGlo探針的rs3909184檢測分型方法。
[0009] 所述基于AllGlo探針rs3909184檢測分型試劑盒,包括實時熒光定量PCR試劑、陽 性對照及陰性對照;
[0010]所述rs3909184為美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)所提供的SNP位點編號。
[0011 ] 所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10 X Taq緩沖液、10m mol的MgCl2、5ιι/μ L的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、10μ mol/L rs3909184的特異正向引物、ΙΟμ mol/L rs3909184的特異反向引物和AllGlo探針;所 述lOXTaq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0012] 所述rs3909184的特異正向引物的核苷酸序列為:
[0013] SEQ ID N0·1:5'-CTCTGATGAGCCCCCGTTT-3,;
[0014] 所述rs3909184的特異反向引物的核苷酸序列為:
[0015] SEQ ID NO^^^ATGTGCTCAGTGCCCTCAAG-S^
[0016] 所述AllGlo探針為rs3909184的特異探針,其核苷酸序列為:
[0017] SEQ ID N0.3:rs3909184-C:MAR-CCACCTGTGCCC-MAR;
[0018] SEQ ID N0.4:rs3909184-G:JUP-CCACGTGTGCCC-JUP。
[0019] 所述陽性對照包括:陽性純合對照品1、陽性純合對照品2、陽性雜合對照品;所述 陽性純合對照品1為rs3909184分型為GG的DNA樣品,所述陽性純合對照品2為rs3909184分 型為CC的DNA樣品,所述陽性雜合對照品為rs3909184分型為GC的DNA樣品。
[0020] 所述陰性對照為lmL的無核酶水。
[0021] 所述基于AllGlo探針的rs3909184檢測分型方法,其步驟如下:
[0022] 1)采用常規(guī)方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA;
[0023] 2)采用所述基于AllGlo探針的rs3909184檢測分型試劑盒提供的實時熒光定量 PCR試劑將DNA進行實時熒光定量PCR擴增;
[0024] 3)根據(jù)檢測到的熒光信號對rs3909184SNP位點進行分型。
[0025] 所述AllGlo探針可米用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定 量探針,AllGlo探針擁有普通Taqman,Taqman_MGB及分子信標(molecular beacon)探針所 有優(yōu)點,克服了目前這幾種探針的最大弊端,它打破了傳統(tǒng)Taqman-端報告基團一端淬滅 基團的限制,利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長 的特制熒光染料,標記在寡核苷酸上面互為報告基團和粹滅基團,而且上面含有特殊的可 以提高Tm值(退火溫度)的化學(xué)基團,提高探針特異性,雜交特異性大大提高,在雜交水解之 后兩端標記的染料又全部變?yōu)閳蟾婊鶊F,提高熒光增量。
[0026]所述AllGlo探針具有以下優(yōu)勢:①提高Tm值(可達10°C以上),探針更短可以達到 15~16個堿基,可以適用A,T含量比較高的序列設(shè)計探針;②加大了多重?zé)晒舛康倪x擇, 因為每種染料即是報告基團又是淬滅基團,打破傳統(tǒng)Taqman探針因波長原因標記選擇困 難,不受淬滅基團波長限制;③大大提高信噪比,無背景信號,空間距離近,更好的淬滅效 果;④成本較低,價格僅相當(dāng)于Taqman-MGB探針的一半,具有MGB探針所有優(yōu)勢。
[0027]本發(fā)明采用了 AllGlo探針技術(shù),設(shè)計了特異性引物和相應(yīng)的AllGlo探針,探針分 別標記2種特殊熒光基團(MAR、JUP),并對該技術(shù)反應(yīng)條件進行優(yōu)化,建立了一種AllGlo