本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記引物分型領(lǐng)域，尤其是一種MAOAμ-VNTR熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法。

背景技術(shù)：

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于MAOAμ-VNTR多態(tài)性研究多集中在酒精依賴、精神分裂癥、抑郁癥、暴力攻擊行為等方面，探討兩者的相關(guān)性，闡明其發(fā)生的遺傳機(jī)制，為疾病或者暴力預(yù)防與控制，風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)以及針對(duì)酒精依賴、暴力攻擊行為的相關(guān)藥物設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)，具有重要社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。但是目前針對(duì)MAOAμ-VNTR多態(tài)性的研究報(bào)道中，大多采用PCR擴(kuò)增結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳，基因分型依賴人工判讀，準(zhǔn)確性依賴個(gè)體經(jīng)驗(yàn)，存在一定的誤差；而且電泳時(shí)間長(zhǎng)。

因此，對(duì)于上述問(wèn)題有必要提出一種MAOAμ-VNTR熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種MAOAμ-VNTR熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種MAOAμ-VNTR熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法，其方法步驟為：(1)樣本及DNA提??；(2)PCR擴(kuò)增；(4)3130型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳；(4)GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)行VNTR分型。

優(yōu)選地，所述樣本及DNA提取還包括720份云南漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的指尖血,一部分取自于本實(shí)驗(yàn)室日常檢案,另一部分取自紅河州看守所羈押人員，使用FTA卡或中速濾紙采集,用chelex-100法進(jìn)行DNA提取。

優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增包括用BIO-RAD T100^TM梯度PCR儀優(yōu)化選擇PCR反應(yīng)條件,最終確定擴(kuò)增反應(yīng)體積為10μL,內(nèi)含1～10ngDNA模板,PCR混合物(天根)5μL,0.8μmol/L PCR引物,正向引物:5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3'，反向引物:5'-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3'，且正向引物5'端用FAM熒光標(biāo)記；所述擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為:95℃5min預(yù)變性,94℃30s,60℃30s,72℃40s,循環(huán)30次,最后延伸為72℃5min。

優(yōu)選地，所述3130型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳包括取Hi-Di甲酰胺1000μL加入1.5mlEP管，再加入GS-500LIZ分子量標(biāo)記60μL，反復(fù)混勻，每孔加兩者的混合物9μL。加樣后打開(kāi)3130型遺傳分析儀，將樣品板放入儀器內(nèi)的托盤內(nèi)。

優(yōu)選地，其使用方法為(1)點(diǎn)擊打開(kāi)3130Foundation Data Collection3.0軟件；(2)在Plate manager窗口編寫樣品表；(3)然后切換到Run Scheduler的plate view窗口，找到待電泳的樣品表并與放樣品的樣品盤鏈接：(4)點(diǎn)擊上方的三角形進(jìn)行電泳。

優(yōu)選地，所述GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)行VNTR分型包括新建Panel、新建GeneMapper Manager、新建Size Standards和點(diǎn)擊打開(kāi)GeneMapper IDv3.2軟件。

優(yōu)選地，所述新建Panel其使用方法為點(diǎn)擊Tools在下拉菜單中選中Panel Manager,在跳出的窗口的File下拉菜單中點(diǎn)擊New Kit，編輯、分析方法名如MAOA,選中MAOA，新建New Marker編輯片段名、大小區(qū)域。

優(yōu)選地，所述新建GeneMapper Manager其使用方法為點(diǎn)擊Tools在下拉菜單中選中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中點(diǎn)擊analysis method點(diǎn)擊New命名如MAOA，選中編好的Panel,點(diǎn)OK。

優(yōu)選地，所述新建Size Standards其使用方法為點(diǎn)擊Tools在下拉菜單中選中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中點(diǎn)擊Size Standards點(diǎn)擊New命名如MAOA-liz,根據(jù)PP試劑盒的LIZ進(jìn)行編寫，點(diǎn)擊OK。

優(yōu)選地，所述點(diǎn)擊打開(kāi)GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)一步包括在跳出的窗口的File下拉菜單中點(diǎn)擊Add Samples to Project,在新跳出的窗口中找到待分析的文件名并點(diǎn)擊，這時(shí)左下角Add to List按鈕變藍(lán)，點(diǎn)擊，Samples To Add欄出現(xiàn)待分析的文件名，點(diǎn)擊右下角變藍(lán)的Add按鈕，待分析的樣品就出現(xiàn)在新跳出的窗口中；在Panel列選擇所應(yīng)用的擴(kuò)增系統(tǒng)，在Size Standard列選擇所應(yīng)用的電泳程序，在Analysis Method列選擇分析的條件，然后點(diǎn)擊分析，得到數(shù)字化的VNTR基因分型。

本發(fā)明的有益效果是：建立的MAOAμ-VNTR多態(tài)性熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法分型效率高，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳能更準(zhǔn)確的進(jìn)行MAOAμ-VNTR基因分型，且具有樣品處理簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì),結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，在針對(duì)MAOAμ-VNTR多態(tài)性的相關(guān)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的方法流程示意圖；

圖2是本發(fā)明GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)行VNTR分型使用流程圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明可以有權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。

如圖1所示,一種MAOAμ-VNTR熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法，其方法步驟為：(1)樣本及DNA提??；(2)PCR擴(kuò)增；(4)3130型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳；(4)GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)行VNTR分型。

進(jìn)一步的，所述樣本及DNA提取還包括720份云南漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的指尖血,一部分取自于本實(shí)驗(yàn)室日常檢案,另一部分取自紅河州看守所羈押人員，使用FTA卡或中速濾紙采集,用chelex-100法進(jìn)行DNA提取。

進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增包括用BIO-RAD T100^TM梯度PCR儀優(yōu)化選擇PCR反應(yīng)條件,最終確定擴(kuò)增反應(yīng)體積為10μL,內(nèi)含1～10ngDNA模板,PCR混合物(天根)5μL,0.8μmol/L PCR引物,正向引物:5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3'，反向引物:5'-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3'，且正向引物5'端用FAM熒光標(biāo)記；所述擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為:95℃5min預(yù)變性,94℃30s,60℃30s,72℃40s,循環(huán)30次,最后延伸為72℃5min。

進(jìn)一步的，所述3130型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳包括取Hi-Di甲酰胺1000μL加入1.5mlEP管，再加入GS-500LIZ分子量標(biāo)記60μL，反復(fù)混勻，每孔加兩者的混合物9μL。加樣后打開(kāi)3130型遺傳分析儀，將樣品板放入儀器內(nèi)的托盤內(nèi)。

進(jìn)一步的，其使用方法為(1)點(diǎn)擊打開(kāi)3130Foundation Data Col lection3.0軟件；(2)在Plate manager窗口編寫樣品表；(3)然后切換到Run Scheduler的plate view窗口，找到待電泳的樣品表并與放樣品的樣品盤鏈接：(4)點(diǎn)擊上方的三角形進(jìn)行電泳。

實(shí)施案例一，所述GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)行VNTR分型包括新建Panel、新建GeneMapper Manager、新建Size Standards和點(diǎn)擊打開(kāi)GeneMapper IDv3.2軟件。所述新建Panel其使用方法為點(diǎn)擊Tools在下拉菜單中選中Panel Manager,在跳出的窗口的File下拉菜單中點(diǎn)擊New Kit，編輯、分析方法名如MAOA,選中MAOA，新建New Marker編輯片段名、大小區(qū)域。所述新建GeneMapper Manager其使用方法為點(diǎn)擊Tools在下拉菜單中選中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中點(diǎn)擊analysis method點(diǎn)擊New命名如MAOA，選中編好的Panel,點(diǎn)OK。所述新建Size Standards其使用方法為點(diǎn)擊Tools在下拉菜單中選中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中點(diǎn)擊Size Standards點(diǎn)擊New命名如MAOA-liz,根據(jù)PP試劑盒的LIZ進(jìn)行編寫，點(diǎn)擊OK。所述點(diǎn)擊打開(kāi)GeneMapper IDv3.2軟件進(jìn)一步包括在跳出的窗口的File下拉菜單中點(diǎn)擊Add Samples to Project,在新跳出的窗口中找到待分析的文件名并點(diǎn)擊，這時(shí)左下角Add to List按鈕變藍(lán)，點(diǎn)擊，Samples To Add欄出現(xiàn)待分析的文件名，點(diǎn)擊右下角變藍(lán)的Add按鈕，待分析的樣品就出現(xiàn)在新跳出的窗口中；在Panel列選擇所應(yīng)用的擴(kuò)增系統(tǒng)，在Size Standard列選擇所應(yīng)用的電泳程序，在Analysis Method列選擇分析的條件，然后點(diǎn)擊分析，得到數(shù)字化的VNTR基因分型。

全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法不需要進(jìn)行標(biāo)本預(yù)處理,省卻了洗滌紅細(xì)胞的過(guò)程,且自動(dòng)化程度高,操作過(guò)程最大程度的減少了人為誤差。全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法與瓊脂糖凝膠電泳法相比,具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)瓊脂糖凝膠電泳需要EB染色,在紫外燈下顯示橘黃色條帶，基因分型依賴人工判讀，準(zhǔn)確性依賴個(gè)體經(jīng)驗(yàn)，而全自動(dòng)毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記引物，通過(guò)GeneMapper IDv3.2軟件自動(dòng)分型。(2)本研究發(fā)現(xiàn)全自動(dòng)毛細(xì)管電泳可以一次性檢測(cè)96個(gè)樣本，而瓊脂糖凝膠電泳最多可檢測(cè)30個(gè)樣本，具有檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn),節(jié)省了大量的人力物力。(3)瓊脂糖凝膠電泳需要制膠、點(diǎn)樣、電泳、染色等過(guò)程，操作繁瑣，點(diǎn)樣技術(shù)要求熟練準(zhǔn)確，電泳耗時(shí)長(zhǎng)，耗時(shí)耗力，而全自動(dòng)毛細(xì)管電泳省去制膠、染色過(guò)程，操作簡(jiǎn)便。

本發(fā)明的有益效果是：建立的MAOAμ-VNTR多態(tài)性熒光標(biāo)記自動(dòng)分型方法分型效率高，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳能更準(zhǔn)確的進(jìn)行MAOAμ-VNTR基因分型，且具有樣品處理簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì),結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，在針對(duì)MAOAμ-VNTR多態(tài)性的相關(guān)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。