本發(fā)明涉及生物制劑的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法。

背景技術(shù)：

泡葉藻(ascophyllumnodosum)，又稱巖衣藻，是一種大型的海洋褐藻,主要在北大西洋沿岸生長(zhǎng)繁殖。和其他褐藻(比如海帶)相似。泡葉藻含有豐富的褐藻膠(alginateacid)(約占藻體所含總糖質(zhì)的79％)，是工業(yè)生產(chǎn)褐藻膠、碘和甘露醇的主要原料之一。除褐藻膠外，泡葉藻還含有約占藻體總糖質(zhì)的13％的泡葉藻聚糖(ascophyllan)和8％的巖藻聚糖(fucoidan)。在我國(guó)，泡葉藻在工業(yè)上主要被用作提取褐藻膠的原料；農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上用來制作化肥、飼料等；在食品行業(yè)中主要用來制作海藻粉。

泡葉藻聚糖，又稱泡葉藻糖膠。早在20世紀(jì)60年代，挪威科學(xué)家larsen指出泡葉藻中存在一種區(qū)別于褐藻膠和巖藻聚糖的多糖硫酸酯，并將其命名為泡葉藻聚糖(ascophyllan)。由于很長(zhǎng)一段時(shí)間沒有從結(jié)構(gòu)及生物活性方面將泡葉藻聚糖與巖藻聚糖相區(qū)分，從而忽視了對(duì)其進(jìn)行深入研究。近年來，研究指出泡葉藻聚糖具有多種優(yōu)良的生物活性，如免疫刺激、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥活性等，但傳統(tǒng)的泡葉藻多糖提取法提取率只有6％左右且顏色較深對(duì)其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用有很大的限制作用。多糖的提取方法有水提法、酸堿提法、微波提取、超聲提取、生物酶法等與其他方法相比，酶法輔助提取多糖具有條件溫和，操作方便，經(jīng)濟(jì)節(jié)約等優(yōu)點(diǎn)。多糖的脫色方法有活性炭吸附、有機(jī)溶劑萃取、大孔樹脂吸附、h2o2氧化脫色等，不同的脫色方法在不同的多糖脫色過程中呈現(xiàn)不同的效果。

有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法，旨在提高其提取率的同時(shí)對(duì)其顏色進(jìn)行有效脫除，使其在食品領(lǐng)域和生物醫(yī)藥領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值和良好的開發(fā)前景。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于10-50倍體積的水中，再添加100iu/ml-300iu/ml的纖維素酶制劑，并在40℃-60℃溫浴1h-3h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調(diào)上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經(jīng)冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調(diào)至中性后，于4℃下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復(fù)2次，并合并沉淀物，經(jīng)3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。

優(yōu)選地，還包括步驟六、脫色：取泡葉藻多糖溶液于脫色釜中，加入雙氧水至終濃度體積分?jǐn)?shù)為1.4％-8.6％，置于電熱恒溫水槽中，ph7.0，脫色溫度20℃-80℃，脫色時(shí)間0.5h-4.0h后，取出，經(jīng)3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥得成品。

優(yōu)選地，所述步驟二中，水與泡葉藻粉的質(zhì)量比為30。

優(yōu)選地，所述步驟二中，酶制劑的添加量為200iu/ml。

優(yōu)選地，所述步驟二中，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為2h。

優(yōu)選地，所述步驟六中，加入雙氧水至終濃度為8.6％。

優(yōu)選地，所述步驟六中，脫色溫度60℃。

優(yōu)選地，所述步驟六中，脫色時(shí)間4.0h。

本發(fā)明的技術(shù)效果是加入纖維素酶制劑可以提高泡葉藻多糖的提取率，可使多糖的提取率與不加酶處理的最高提高50％。同時(shí)經(jīng)雙氧水脫色后多糖白度值和多糖保留率分別可達(dá)到61.1％、90.0％，此條件下，泡葉藻聚糖白度值、保留率以及免疫刺激活性均處于較優(yōu)的水平，脫色成本和設(shè)備要求較低，有利于泡葉藻多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為正交實(shí)驗(yàn)組多糖誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞放出no的測(cè)定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于10-50倍體積的水中，再添加100iu/ml-300iu/ml的纖維素酶制劑，并在40℃-60℃溫浴1h-3h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調(diào)上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經(jīng)冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調(diào)至中性后，于4℃下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復(fù)2次，并合并沉淀物，經(jīng)3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。

實(shí)施例2

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于30倍體積的水中，再添加300iu/ml的纖維素酶制劑，并在50℃溫浴3h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調(diào)上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經(jīng)冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調(diào)至中性后，于4℃下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復(fù)2次，并合并沉淀物，經(jīng)3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。根據(jù)稱量得到泡葉藻聚糖質(zhì)量得到提取率為11.43％。

實(shí)施例3

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于30倍體積的水中，再添加200iu/ml的纖維素酶制劑，并在60℃溫浴1h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調(diào)上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經(jīng)冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調(diào)至中性后，于4℃下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復(fù)2次，并合并沉淀物，經(jīng)3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。根據(jù)稱量得到泡葉藻聚糖質(zhì)量得到提取率為14.39％。

實(shí)施例4泡葉藻聚糖酶輔助提取響應(yīng)面試驗(yàn)

以酶濃度，酶解時(shí)間，酶解溫度為三因素對(duì)纖維素酶提取泡葉藻聚糖進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示，結(jié)果如表2所示。

表1box‐behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平編碼值表

表2中心組合試驗(yàn)方案及泡葉藻聚糖提取率結(jié)果

實(shí)施例5不同脫色方法對(duì)泡葉藻聚糖脫色效果的影響

將泡葉藻多糖通過活性炭吸附法脫色：取15.0ml泡葉藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，按質(zhì)量體積比加入3.0％的活性炭，室溫脫色12h，離心(5000×g，5min)，上清液冷凍干燥至恒重備用；

有機(jī)溶劑萃取法脫色：取60.0mg泡葉藻聚糖粉末5份，分別加入15.0ml甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮和四氫呋喃試劑沉淀聚糖，室溫脫色12h后，離心(5000×g，5min)棄上清，取出沉淀，烘干至恒重后備用；

大孔樹脂吸附法脫色：將大孔樹脂(d101、d101-1和dm130)活化后，填入層析柱(2.6cmi.d.×20cm)，取5.0ml泡葉藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，上樣進(jìn)入大孔樹脂的層析柱，室溫孵育12h，蒸餾水洗至洗脫液無色，收集洗脫液溶液，冷凍干燥至恒重備用；

h2o2氧化法脫色：15.0ml泡葉藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，分別加入1.4、3.0、7.5ml的體積分?jǐn)?shù)為30％的h2o2溶液，至h2o2溶液終濃度的體積分?jǐn)?shù)分別為2.5、5.0、10.0％，室溫孵育12h，經(jīng)純水透析(3500dacut-off)后冷凍干燥至恒重，備用。

分別以干燥后泡葉藻聚糖保留率和白度為指標(biāo)比較不同脫色方法對(duì)泡葉藻聚糖脫色效果的影響。以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，各脫色劑脫色效果見表3，確定雙氧水為理想脫色劑。

表3不同脫色方法對(duì)泡葉藻聚糖脫色效果的影響

對(duì)泡葉藻聚糖的h2o2氧化脫色法進(jìn)行因素水平正交試驗(yàn)，如表4所示，結(jié)果如表5所示。

表4泡葉藻聚糖脫色正交試驗(yàn)因素及水平

表5泡葉藻聚糖的h2o2氧化脫色法因素水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)上述正交實(shí)驗(yàn)組(如表5所示的實(shí)驗(yàn)組號(hào)1-9)及未脫色處理(as)的多糖誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞放出no的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組號(hào)1-9分別對(duì)應(yīng)d1-as、d2-as、d3-as、d4-as、d5-as、d6-as、d7-as、d8-as、d9-as，結(jié)果如圖1所示。

其中，取15.0ml泡葉藻聚糖溶液(20.0mg/ml)，ph調(diào)至7.0，加入8.0ml的30％h2o2至h2o2終濃度為8.6％、置于60℃的電熱恒溫水槽脫色4.0h，脫色后泡葉藻聚糖樣品經(jīng)純水透析(3500dacut-off)后冷凍干燥至恒重，計(jì)算泡葉藻聚糖保留率為90.0％，并用白度儀測(cè)定泡葉藻聚糖的藍(lán)光白度值為61.1％，再對(duì)脫色后的泡葉藻聚糖誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞放出no進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明脫色后的泡葉藻聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生的no可達(dá)到原多糖的76.7％。

其中，取15.0ml泡葉藻聚糖溶液(20.0mg/ml)，ph調(diào)至7.0，加入8.0ml的30％h2o2至h2o2終濃度為8.6％、置于60℃的電熱恒溫水槽脫色2.0h，脫色后泡葉藻聚糖樣品經(jīng)純水透析(3500dacut-off)后冷凍干燥至恒重，計(jì)算泡葉藻聚糖保留率為93.4％，并用白度儀測(cè)定泡葉藻聚糖的藍(lán)光白度值為32.8％，再對(duì)脫色后的泡葉藻聚糖誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞放出no進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明脫色后的泡葉藻聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生的no可達(dá)到原多糖的126.7％。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。