本發(fā)明涉及一種預測中國人個體運動性能的方法，適用于中國人人群預測，屬生物檢測技術(shù)領域。

背景技術(shù)：

人體運動能力的能量供應、神經(jīng)肌肉控制能力及體形特征等存在著明顯的種族和個體差異，上述因素均受到基因的影響。突出的運動能力很大程度上取決于運動基因遺傳優(yōu)勢。隨著分子遺傳學的進展及其在運動醫(yī)學領域的應用，科學家發(fā)現(xiàn)一些重要的身體運動素質(zhì)如力量、速度和耐力及其發(fā)展?jié)摿哂邢喈敻叩倪z傳度，運動員對訓練的敏感度也受到遺傳因素很大的影響。遺傳因素作為內(nèi)因，影響發(fā)展的空間及極限，決定人的運動天賦和發(fā)展?jié)摿?。對大量?yōu)秀運動員的研究表明,先天遺傳因素優(yōu)勢占2/3，后天訓練作用占1/3。因此，發(fā)現(xiàn)與了解個人的運動遺傳優(yōu)勢成為人們有目的的規(guī)劃成長道路的重要參考依據(jù)。

優(yōu)秀運動員之所以能更容易取得輝煌的運動成就，目前認為，主要與以下因素有關：

1、人種的差異

國際人類基因組的正版圖譜(2001年)研究表明：人與人之間的基因密碼的相似程度高達99.99％，僅0.01％的差異。但正是這0.01％的差異，使得個體在生理和體能上有了不同的表達，使得遺傳存在個體、種族間、運動能力差異。運動醫(yī)學長期研究的結(jié)果表明，黑人的心血管直徑較其他人種粗，耐高溫，腳部和小腿之間的(專業(yè)語言，腳部與小腿哪塊肌肉)有一個出色的力矩，臀大肌發(fā)達等體能特點。另外，心肺功能、肌肉類型、力量、速度和耐力及其發(fā)展?jié)摿哂邢喈敻叩倪z傳度，運動員對訓練的敏感度也在很大程度上受遺傳因素的影響。

2、運動相關基因與運動關鍵基因

目前與運動相關的基因有206個，起關鍵性作用的運動基因18個，但具體哪些運動基因與中國人的體能指標密切相關還有待進一步研究。

歐美國家機構(gòu)開展了運動基因檢測服務并已應用于運動員選材過程，同時在健康基因也開始向商業(yè)化發(fā)展，但由于人種不同，目前還沒有針對中國人群開發(fā)的檢測試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，制備得到一種針對中國人(特別是漢族群體)的運動優(yōu)勢相關基因的檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種預測中國人個體運動性能的方法，包括：

選擇以下a或b中的一種或兩種，

a.篩選所述個體在ace基因第16內(nèi)含子是否存在與運動性能有關的遺傳學變異；

根據(jù)存在的一種或多種遺傳學變異預測運動性能，其中：i)所述個體的ace基因分型為ii基因型與耐力性能正相關；ii)所述個體的ace基因分型為ii基因型與耐力性能負相關；

b.篩選actn3基因編碼577位氨基酸的密碼子中是否存在與運動性能有關的遺傳學變異；

根據(jù)存在的一種或多種遺傳學變異預測運動性能，其中：i)所述個體的基因分型為577xx基因型與耐力性能正相關；ii)所述個體的基因分型為577rr基因型與耐力性能負相關。

優(yōu)選的，所述個體為女性。

進一步，所述篩選采用pcr方法，pcr篩選ace基因中采用的引物為：

正向：5’-ctggagaccactcccatcctttct-3’

反向：5’-gatgtggccatcacattcgtcagat-3’。

進一步，所述篩選采用pcr方法，pcr篩選actn3基因中采用的引物為：

正向：5’-ctgttgcctgtggtaagtggg-3’

反向：5’-tggtcacagtatgcaggaggg-3’。

本發(fā)明還提供一種中國人個體運動優(yōu)勢相關基因的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取待測對象的外周靜脈血基因組dna；

(2)采用pcr擴增ace基因第16內(nèi)含子片段；

(3)步驟(2)pcr產(chǎn)物分析待測對象的基因型，ii型僅有490bp擴增片段，為插入純合型；dd型僅有190bp，為缺失純合型；id型既有190bp片段，又有490bp片段，為雜合型；

(4)采用pcr擴增actn3基因的片段；

(5)步驟(4)pcr產(chǎn)物分析：采用內(nèi)切酶ddei酶切pcr擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物得到待測對象的基因型，rr型有205bp和86bp兩條帶；xx型有108bp、97bp和86bp三條帶，為純合子突變；rx型既有205bp，又有108bp、97bp和86bp條帶，為雜合子突變。

進一步，本發(fā)明提供一種為中國人個體選擇運動或運動項目的方法，選擇以下a或b中的一種或兩種，

a.篩選所述個體在ace基因第16內(nèi)含子是否存在與運動性能有關的遺傳學變異；

根據(jù)存在的一種或多種遺傳學變異選擇短距離賽跑/力量運動或耐力運動，

其中：

i)所述個體的ace基因分型為ii基因型與耐力性能正相關；ii)所述個體的ace基因分型為ii基因型與耐力性能負相關；

b.篩選actn3基因編碼577位氨基酸的密碼子中是否存在與運動性能有關的遺傳學變異；

根據(jù)存在的一種或多種遺傳學變異選擇短距離賽跑/力量運動或耐力運動，其中：

i)所述個體的基因分型為577xx基因型與耐力性能正相關；ii)所述個體的基因分型為577rr基因型與耐力性能負相關。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的顯著技術(shù)效果：

該檢測法檢測到的中國人(中國人)的運動優(yōu)勢基因，可用于為個體選擇或匹配一種運動或運動項目(例如短距離賽跑/力量運動或耐力運動)以及用于評價和預測運動性能、優(yōu)化設計訓練計劃的新方法，其包括評價多個基因或基因型，所描述的方法可用于通過遺傳學評估、生理測試、體能測定和/或心理學評估發(fā)展出更適合于運動員的訓練計劃，本發(fā)明的試劑盒還可以用于檢測幼兒、兒童和青少年的12個與運動優(yōu)勢和潛能相關的基因，預測其運動天賦，為其未來從事的體育運動項目提供合理化建議。

具體實施方式

在下面的部分中,例如描述了發(fā)明的一些實施方案以舉例說明本發(fā)明的不同的實施方案、對本領域人員顯而易見的是實踐不同的實施方案并不需要采用在此所概述的所有的或甚至一些具體細節(jié)。在一些情況中,那些熟知的方法或成分并沒有被寫入本說明書中。

本發(fā)明公開了篩選個體的運動員潛能的方法。若未特別說明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

核酸

本發(fā)明不同的實施方案包括分離并分析核酸分子,例如dna、mrna或cdna。相關核酸可以編碼靶蛋白的一部分或全部(例如,actn3、ace等)?！昂怂帷痹诖税▎捂満碗p鏈分子,以及dna、rna、化學修飾的核酸以及核酸類似物。預計在本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸可以是長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約3-50、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000、約2250、約2500個或更長核苷酸殘基的核酸,以及最長到包括全長的染色體dna。

從復雜的混合物中部分或完全純化dna和/或rna的方法在本領域是熟知的,例如細胞勻漿或提取。(見例如guidetomolecularcloningtechniques,eds.bergerandkimmel,academicpress,newyork,ny,1987；molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,eds.sambrook,fritschandmaniatis,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny,1989)。一般地,首先將細胞、組織或其他來源的材料勻漿化,例如通過在液氮中冷凍,隨后用研缽和研棒碾磨。用韋林攪切器、virtis勻漿器、dounce勻漿器或其他勻漿器都可以將特定的組織勻漿化。用去污劑例如十二烷基硫酸鈉(sds)、tritonx-100、chaps(3-(3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸鹽(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate))、辛基葡糖苷或其他本領域已知的去污劑提取粗勻漿液。熟知的是,可以加入例如核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶抑制劑的核酶抑制劑預防靶核酸的降解。

用例如異硫氰酸胍的離液劑(chaotrophic)或例如苯酚的有機溶劑也可以進行提取。在一些實施方案中,例如用蛋白酶k的蛋白酶處理可以被用于降解細胞蛋白。離心或超速離心可以去除顆粒污染?？捎玫碗x子強度的水緩沖液的透析去除鹽或其他的可溶性污染物。通過在-20℃加入乙醇或加入乙酸鈉(ph6.5,約0.3m)以及0.8體積的2-丙醇可以沉淀核酸。離心收集所沉淀的核酸,或?qū)θ旧wdna,可用玻璃吸液管或其他探針卷出所沉淀的dna。訓練有素的本領域人員將認識到上面所列舉的方法僅僅是舉例說明的,并且根據(jù)所分析的特殊類型的核酸,可以進行多種變更。

在特定的實施方案中,所分析的核酸可以是天然存在的dna或rna分子。事實上,所闡述的方法可以分析任何天然存在的核酸,包括不限定于染色體、線粒體或葉綠體dna或核糖體rna、轉(zhuǎn)運rna、核不均一rna或信使rna。用本領域已知的標準方法可以從原核或真核細胞中獲得核酸。同樣的,例如用pcrtm或其他已知的擴增方法或通過制備含有相關核酸的文庫例如bac、yac、粘粒、質(zhì)?；蚴删w文庫可以人工制備相關核酸。(見例如bergerandkimmel,1987；sambrooketal.,1989.)。對于分析而言,核酸的來源并不重要的,預計在本發(fā)明的范圍內(nèi),事實上可以分析任何來源的核酸。

核酸擴增

在特殊的實施方案中,可以首先擴增被分析的用于篩選的核酸-增加信號強度。根據(jù)標準的方法學,可以從生物學標本所含的細胞內(nèi)分離到用作為擴增模板的核酸序列(例如骨骼肌的dna或mrna)。核酸可以是基因組dna或被分段的或完整的細胞rna。如果所用的是rna,需要將rna轉(zhuǎn)化為互補的cdna。在一個實施方案中,rna是完整的細胞rna并被直接用作為擴增的模板。在一個實例中,通過擴增(例如通過pcr)actn3的多核苷酸序列或更優(yōu)選的它的包括1747c>tsnp的片段(例如外顯子16),并測序擴增產(chǎn)物或測定在擴增產(chǎn)物中是否存在1747c>tsnp。在另一個實例中,已知577x等位基因含有ddei限制性位點,通過ddei消化擴增產(chǎn)物以及對消化產(chǎn)物的大小分級(例如通過凝膠電泳)可容易測定到該基因。產(chǎn)物的大小可用于基因分型個體的actn3位點。各種形式的擴增在本領域是熟知的,并且可以使用任何一種已知的方法。一般地,擴增包括使用一種或多種與所擴增的靶核酸序列選擇性或特異性雜交的引物。

引物

在此所定義的術(shù)語引物意思是包括任何一種在模板依賴過程中能引導新核酸合成的核酸。引物通常是長度從10到20個堿基對的寡核苷酸,但是可以采用更長的序列。引物可以是雙鏈或單鏈形式,盡管單鏈形式是優(yōu)選的。引物設計的方法在本領域是熟知的,依據(jù)從標準的沃森-克里克堿基配對中所得到的互補序列進行設計(即腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶結(jié)合,以及鳥嘌呤與胞嘧啶結(jié)合)。從本領域人員熟知的商業(yè)和/或公共渠道可得到選擇和設計擴增引物的計算機程序。在下面的實施例中提供了用于測定運動性能的遺傳學變異的預測物例如actn的1747c>tsnp的特殊引物序列。本領域人員將認識到所提供的特殊序列只是舉例說明的以及在實踐權(quán)利要求的方法中可以使用其他的引物和/或探針序列。

擴增方法

有多種模板依賴性方法可以擴增在給定的標本中所存在的標記序列。其中一個最熟知的擴增方法是聚合酶鏈反應(稱為pcr),美國專利nos.4,683,195、4,683,202和4,800,159對此有詳細描述。

本發(fā)明的一個實施方案可以包括從一個個體中得到適合的標本并測定特異的信使rna,例如actn3mrna。本發(fā)明所用的示例性標本是肌肉組織標本(例如,肌肉組織活檢,例如打孔活檢)。一旦得到組織標本,可以制備標本用于用標準技術(shù)(例如單細胞分離、外膜消化、mrna的寡dt分離等)分離核酸。也可以用本領域已知的試劑盒進行mrna的分離(pierce,apbiotech等)。為了定量所擴增的mrna的量,可以進行逆轉(zhuǎn)錄酶pcr擴增方法。將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna的方法是熟知的并被描述于sambrooketal.,1989。其他的用于逆轉(zhuǎn)錄的方法利用了熱穩(wěn)定的dna聚合酶。在1990年12月21日提交的wo90/07641中描述了這些方法。

用于擴增核酸的另一個方法是連接酶鏈反應(“l(fā)cr”),歐洲申請no.320308公開了該方法。在lcr中,制備兩個互補的探針對,當存在靶序列時,每對都將與靶序列的反向互補鏈結(jié)合,使得它們被連接。當存在連接酶時,兩個探針對會連接形成單一單元。和pcr一樣,通過溫度循環(huán),從靶序列中脫離出結(jié)合連接的單元,然后作用為連接過多探針對的“靶序列”。美國專利4,883,750描述了一種與lcr相似的將探針對與靶序列結(jié)合的方法。

在pct申請no.pct/us87/00880中所描述的qbeta復制酶也可被用作為本發(fā)明的另一種擴增方法。在該方法中,當存在rna聚合酶時,將具有靶序列的互補區(qū)域的rna的可復制序列加入到標本中。聚合酶將復制可被測定的可復制序列。

等溫擴增方法也可用于擴增本發(fā)明的核酸,其中用限制性內(nèi)切酶和連接酶實現(xiàn)在限制性位點的一條鏈上含有5′-[α-硫]-三磷酸核苷的靶分子的擴增。(walkeretal.,proc.natlacad.sci.usa89:392-396,1992)。

鏈置換擴增(sda)是另一種進行核酸等溫擴增的方法,它包括多輪的鏈取代和合成,即缺口轉(zhuǎn)譯。一種與之相似的方法是修復鏈反應(rcr),包括將在整個靶向擴增的區(qū)域內(nèi)的一些探針退火,緊接著是修復反應,其中只存在四種堿基中的兩種堿基,所添加的其他的兩種堿基可以是容易檢測到的生物素化的衍生物。在sda中使用了相似的方法。也可用循環(huán)探針反應(cpr)檢測靶向特異序列。在cpr中,具有非特異dna的3’和5’序列以及特異rna的中間序列的探針與標本中所具有的dna雜交。雜交后,緊接著rna酶h處理反應物,所鑒定的探針產(chǎn)物是消化后所釋放出的特征性產(chǎn)物。原始模板退火為另一個循環(huán)探針并重復反應。

在本發(fā)明中可用在gb申請no.2202328和pct申請no.pct/us89/01025中所描述的其他擴增方法。在前一個申請中,“修飾的”引物被用于pcr樣、模板和酶依賴性合成?？梢杂貌东@基團(例如生物素)和/或檢測基團(例如酶)標記修飾引物。在后一個申請中,將過量的標記探針加入到標本中。當存在靶序列時,探針結(jié)合靶序列并被催化降解。在降解后,靶序列被完整地釋放并被過量探針結(jié)合。標記探針的降解表示著靶序列的存在。其他核酸擴增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴增體系(tas),包括核酸序列依賴的擴增(nasba)和3sr。kwohetal.,proc.nat7acad.sci.usa86:1173(1989)；gingerasetal.,pct申請wo88/10315。在nasba中,用標準的苯酚/氯仿提取、臨床標本的熱變性、裂解緩沖液的處理以及用于分離dna和rna的minispin柱或rna的鹽酸胍提取可以制備核酸。這些擴增技術(shù)包括退火具有靶向特異序列的引物。聚合后,用rna酶h消化dna/rna雜合體,同時將雙鏈dna分子再次熱變性。在每種情況中,通過加入第二種靶向特異引物將單鏈dna完全雙鏈化,隨后聚合。然后用例如t7或sp6的聚合酶多次轉(zhuǎn)錄雙鏈dna分子。在等溫循環(huán)反應中,rna被逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈dna,用例如t7或sp6的聚合酶再次轉(zhuǎn)錄。所形成的無論是被截斷或完整的產(chǎn)物都提示靶向特異序列。

davey等歐洲申請no.329822公開了一種核酸擴增方法包括循環(huán)合成單鏈rna(“ssrna”)、ssdna和雙鏈dna(dsdna),本發(fā)明可使用此方法。ssrna是第一個引物寡核苷酸的第一個模板,用逆轉(zhuǎn)錄酶(rna依賴性dna聚合酶)將其延伸。然后,通過核糖核酸酶h(rna酶h,一種特異于dna或rna雙鏈體中的rna的rna酶)的活性從所得到的dna:rna雙鏈體中去除rna。所形成的ssdna是第二個引物的第二個模板,引物也包括rna聚合酶啟動子的序列(例如是t7rna聚合酶)以及5’端與模板同源。用dna聚合酶(例如是大腸桿菌dna聚合酶1的大“klenow”片段)延伸引物,生成具有與引物之間的原始rna序列相同的序列以及在另一末端具有附加的啟動子序列的雙鏈dna(“dsdna”)分子。該啟動子序列可被合適的rna聚合酶用于生產(chǎn)dna的多個rna拷貝。然后這些拷貝重新進入引起極快速擴增的循環(huán)。在正確選擇酶后,可以等溫地進行該擴增而在每個循環(huán)中都不需添加酶。因為該方法的循環(huán)性能,所選的起始序列可以是dna或rna形式。

miller等pct申請wo89/06700公開了一種核酸序列擴增方案,它根據(jù)啟動子/引物序列與靶向單鏈dna(“ssdna”)的雜交,緊接著是序列的多個rna拷貝的轉(zhuǎn)錄。這個方案不是循環(huán)的,即所形成的rna轉(zhuǎn)錄物不能生成新的模板。其他擴增方法包括“競爭”和“單側(cè)pcr”frohman,m.a.,in:pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress,n.y.(1990)和oharaetal.,proc.natzacad.sciusa,86:5673-5677(1989)。

在本發(fā)明的擴增步驟中也可以使用方法,方法根據(jù)存在具有所形成的“雙寡核苷酸”序列的核酸時的兩個(或多個)寡核苷酸的連接,并籍此擴增雙寡核苷酸。(例如wuetal.,genomics4:5601989)。

分離方法

在擴增之后,為了確定是否發(fā)生了特異性擴增的目的,可能需要將擴增產(chǎn)物從模板和過量引物中分離出來。在一個實施方案中,利用標準方法通過瓊糖脂、瓊糖脂-丙稀酰胺、或聚丙稀酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。(例如sambrooketal.,1989)。另外,可以采用色譜技術(shù)實現(xiàn)分離。本發(fā)明可以使用多種類型的色譜(freifelder,1982))。

鑒定方法

各種檢測核酸序列變異體的方法在本領域是已知的,并且可以使用任何一種已知的方法。在一個實施方案中,檢測可以是通過southern印跡和標記探針的雜交。在southern印跡中所涉及的技術(shù)對于本領域人員是熟知的(例如,sambrooketal.,1989)。簡言之,用凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。然后將凝膠與膜接觸,例如硝酸纖維素膜,使得核酸轉(zhuǎn)移并非共價結(jié)合到膜上。隨后,將膜與能與靶向擴增產(chǎn)物雜交的結(jié)合有發(fā)光團的探針孵育。通過將膜暴露于x射線平片或離子發(fā)射檢測裝置完成檢測。在美國專利no.5,279,721中描述了上述的一個實例,它顯示了一種用于自動化電泳和核酸轉(zhuǎn)移的設備和方法。設備可以在不外處理凝膠下進行電泳和印跡,并適合于進行本發(fā)明的方法。

從不同的渠道例如thirdwave、pyrosequencing、appliedbiosystems、affymetrix、sequenom、nanogen等可以商業(yè)化獲得檢測核酸序列的方法和設備，任何一種商業(yè)體系都可以被用于檢測actn3或其他性能相關的基因中的序列變異。

下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明詳細描述。

實施例1：篩選出運動員組ace基因型分布特征

材料和方法

通過在triton-x100的細胞裂解和蛋白酶k的消化之后的苯酚:氯仿的提取從總共218名運動員[}浙江省田徑隊、游泳隊和皮劃艇隊，其中田徑運動員69名(包括2名國家級健將和2名國際級健將)，游泳運動員34名，皮劃艇運動員115名(包括8名國家級健將和5名國際級健將)]試驗組，288名健康獻血者對照組(男性149人，女性139人)dna，進行pcr擴增。根據(jù)研究需要我們將試驗組分成了耐力運動員組和速度/爆發(fā)型運動員組，耐力運動員組總共129人包括8名田徑運動員(≥800m)、6名游泳運動員(≥400m)和115名皮劃艇運動員，速度/爆發(fā)型運動員組總共89人包括61名田徑運動員(≤400m、鉛球、標槍、鐵餅、跳高、跳遠)和28名游泳運動員(<400m)，其中耐力運動員組男性75人，女性54人；速度/爆發(fā)型運動員組男性43人，女性46人。

pcr擴增ace基因第16內(nèi)含子片段，pcr引物序列如下:

正向：5’-ctggagaccactcccatcctttct-3’(seqno:1)

反向：5’-gatgtggccatcacattcgtcagat-3’(seqno:2)

pcr循環(huán)條件：反應混合物經(jīng)94℃預變性5分鐘后，以94℃變性60秒，58℃退火120秒，72℃延伸90秒，共35個循環(huán)后，最后72℃延伸5分鐘終止擴增，pcr擴增采用朗基mg96g型pcr儀。

結(jié)果與分析

序列比較分析以genebank[www.nibc.nlm.nih.gov]中人actn3基因(基因登錄號nm_001104)序列為正常標準，所得序列用dnatool(ver.5.1)或pcgene(ver3.0)軟件進行序列對比，確定突變的位置和性質(zhì)。采用spss13.0統(tǒng)計軟件，等位基因和基因型頻率分布經(jīng)基因平衡定律。具體結(jié)果如表1和表2所示。

表1耐力運動員組與爆發(fā)型運動員組ace基因型男女分組比較

表2爆發(fā)型運動員組actn3基因型分布

如表1位于ace基因第16號內(nèi)含子的插入或缺失(i/d)多態(tài)性經(jīng)pcr方法檢測可以擴增出兩種dna片段，一種是490bp長的dna片段，稱之為插入型(i型)，另一種是190bp長的dna片段，稱之為缺失型(d型)，因此在群體中可有ii、id及dd3種基因型，ii型僅有490bp片段，為插入型純合子；dd型僅有190bp片段，為缺失型純合子；id型則既有490bp片段，又有190bp片段，為雜合型。如表2，女性耐力運動員ii基因型頻率較對照高，dd基因型頻率較對照低，即中國女性耐力運動員ace基因多態(tài)頻率分布特征。另外，對照人群ace基因i/d多態(tài)頻率分布與歐美人群有非常顯著差異，即在中國普通人群高比例的i等位基因和ii基因型頻率的基礎上，歐美研究結(jié)論中得出的杰出耐力運動員的獨特特征或許不可能出現(xiàn)在中國群體中，或許是另外的表現(xiàn)形式。

實施例2：篩選出不同類型運動員組actn3基因型分布特征

材料和方法

通過在triton-x100的細胞裂解和蛋白酶k的消化之后的苯酚:氯仿的提取從對131例對照人群中和89名爆發(fā)性運動組dna進行pcr擴增。

pcr擴增actn3基因的片段，pcr引物序列如下：

正向：5’-ctgttgcctgtggtaagtggg-3’(seqno:3)

反向：5’-tggtcacagtatgcaggaggg-3’(seqno:4)

pcr循環(huán)條件：反應混合物經(jīng)94℃預變性5分鐘后，以94℃變性30秒，58.2℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35個循環(huán)后，最后72℃延伸5分鐘終止擴增，pcr擴增采用朗基mg96g型pcr儀。

結(jié)果與分析

pcr擴增出長290bp的dna片段，如表2，由于人類actn3基因r577x多態(tài)性，從測序結(jié)果可以判斷actn3基因第16號外顯子的1747核苷酸是否有一c到t位點突變，如果無突變發(fā)生，則為rr純合野生型，若該位點變?yōu)閠，則為xx突變純合型，若既有c又有t則為rx雜合型。如果為rr型，擴增出來的片段只有一個ddei酶切位點，若帶有1747c到t突變，則會產(chǎn)生一個新的ddei酶切位點，3種actn3基因型pcr擴增片段經(jīng)ddei限制性內(nèi)切酶消化后可見，純合子突變xx型經(jīng)酶切后能產(chǎn)生3種長度片段，分別為86bp、97bp和108bp，rr型只有86bp和205bp兩種片段，rx型既有86bp和205bp片段，又有97bp和108bp片段，為雜合型。具體結(jié)果如表3所示。

表3爆發(fā)型運動員組actn3基因型男女分組比較

如表3，女性耐力運動員xx基因型所占比例和x等位基因頻率均顯著高于對照組，由此可見，actn3基因的x等位基因?qū)ε阅土\動員的耐力表現(xiàn)有促進作用。131例對照人群中actn3基因型分布為rr型36.6％(48/131)，rx型為48.9％(64/131)，xx型為14.5％(19/131)；等位基因頻率r型為61.1％，x型為38.9％。89名爆發(fā)型運動員actn3基因型分布為rr型34.8％(31/89)，rx型為49.4％(44/89)，xx型為15.8％(14/89)；等位基因頻率r型為59.6％，x型為40.4％。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>杭州勢必健生物科技有限公司

<120>預測中國人個體運動性能和選擇運動項目的方法

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