本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氯霉素類抗生素主要是通過抑制細菌70s核糖體與50s亞基結(jié)合，干擾細菌蛋白質(zhì)的合成，對g+和g-菌均有抑制作用，是一種廣譜抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素和弗苯尼考。氯霉素是第一代氯霉素類抗生素，由于此藥會導(dǎo)致再生障礙性貧血，美國及歐盟于1996年，我國于2002年3月，已經(jīng)禁止使用于食用動物。現(xiàn)主要作為外用藥使用，如氯霉素滴眼液、氯霉素搽劑等。甲砜霉素抗菌作用比氯霉素強2～5倍，從上世紀90年代開始在我國大量用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，但隨著應(yīng)用的廣泛，耐藥菌逐漸增多，治療效果較差。目前在養(yǎng)殖業(yè)中已經(jīng)很少使用，僅與其他藥物配合使用治療人支原體、衣原體和淋球菌感染。取而代之的是氯霉素類新一代抗生素弗苯尼考，其抗菌譜與抗菌活性均優(yōu)于氯霉素與甲砜霉素，對多種革蘭氏陽性菌和格蘭仕陰性菌及支原體等均有作用，且毒副作用小，是一種新型獸用抗生素。主要用于治療畜禽的細菌性疾病和霉形體病和魚類的細菌性疾病，尤以對呼吸系統(tǒng)感染和消化道感染療效顯著，在畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。細菌耐藥性已經(jīng)對全世界人類和動物的健康造成了巨大的威脅，引起了各國的高度關(guān)注。目前雖然檢測細菌耐藥性方法很多，但還沒有能夠快速、敏感、特異的檢測細菌耐藥基因的試劑盒。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，為氯霉素耐藥性檢測提供快速、敏感、特異性強的手段，彌補國內(nèi)外在細菌氯霉素類藥物耐藥基因pcr快速檢測的空缺，本發(fā)明提供了一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。表1分子標(biāo)記序列名稱序列(5’-3’)seqidno.p1-fnh2-t(10)tgccagcagtgccgtccat1p1-rcaccgcccaagcagaagta2p2-fnh2-t(10)ggctttcgtcattgcgtctc3p2-ratcggtaggatgaaggtgagga4p3-fnh2-t(10)gaccagaccgttcagctggat5p3-rcctgccactcatcgcagtac6所述分子標(biāo)記在制備檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的巴氏桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋20～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記為氯霉素耐藥性檢測提供快速、敏感、特異性強的手段；(2)所述分子標(biāo)記彌補國內(nèi)外在細菌氯霉素類藥物耐藥基因pcr快速檢測的空缺，為調(diào)查我國氯霉素類耐藥基因的流行情況提供參考數(shù)據(jù)。附圖說明圖1是實施例1～3檢測結(jié)果圖；其中，m為分子量為1500bp的maker；1為實施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實施方式實施例1一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的巴氏桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實施例2一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的巴氏桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋300倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實施例3一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的巴氏桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司<120>一種用于檢測巴氏桿菌氯霉素類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tgccagcagtgccgtccat19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2caccgcccaagcagaag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