本發(fā)明涉及凍干領(lǐng)域，特別是蛋白酶k的凍干工藝。

背景技術(shù)：

蛋白酶k是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。從林伯氏白色念球菌（tritirachiumalbumlimber）中純化得到。據(jù)資料顯示：該酶有兩個(gè)ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。

蛋白酶k作為一種蛋白酶可以起到消化和降解其他蛋白的作用，但同時(shí)其本身也是一種蛋白質(zhì)。和大部分的蛋白質(zhì)一樣，其活性和穩(wěn)定性也受到溫度、ph值、保存時(shí)間等因素的影響，因此，通常蛋白酶k凍干的干粉在0～4℃保存，或溶液狀態(tài)下于-20℃保存。而現(xiàn)有的蛋白酶k凍干工藝仍有不足，需要花費(fèi)的時(shí)間太長，影響其蛋白酶k凍干產(chǎn)品的生產(chǎn)。為了解決蛋白酶k的運(yùn)輸和應(yīng)用不便，縮短凍干的時(shí)間，加強(qiáng)蛋白酶k干粉的穩(wěn)定性、延長其保存期等問題，非常有必要需要一種新的凍干工藝流程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種蛋白酶k的凍干工藝。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種蛋白酶k的凍干工藝，包括以下步驟：

a.預(yù)處理待凍干蛋白酶k；

b.再將蛋白酶k溶液樣品放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，溫度調(diào)節(jié)至第一溫度-50℃以下并保持溫度在-50℃以下，對(duì)蛋白酶k進(jìn)行冷凍，再升溫至溫度-15±5℃，保持1-2h，再降溫至-50℃以下，保持1-2h對(duì)蛋白酶k進(jìn)行預(yù)凍；

c.當(dāng)真空度低于20pa后，將預(yù)凍之后的蛋白酶k溶液樣品升溫至第二溫度，所述第二溫度處于-40±5℃，使樣品在-40±5℃且真空條件下保持1~2小時(shí)；

d.冷凝器的溫度降低至-40℃，蛋白酶k樣品溶液的溫度由第二溫度升至第三溫度，所述第三溫度處于-15±5℃，使樣品在-15±5℃且真空條件下保持1~2小時(shí)；

e.當(dāng)真空度低于5pa后，樣品溶液的溫度由第三溫度降至第二溫度，并在真空條件下保持2~3h，溫度再由第二溫度升溫至第三溫度，使樣品在真空條件下保持2~3h；

f.再將蛋白酶k樣品溶液的溫度由第三溫度升至第四溫度，所述第四溫度處于0±5℃，使樣品在0℃且真空條件下保持2~3小時(shí)；

g.再將蛋白酶k樣品溶液的溫度由第四溫度升至第五溫度，所述第五溫度處于35±5℃，維持冷凍干燥室溫度在35±5℃左右，真空條件下，并保持2~3小時(shí)。

優(yōu)選的，所述的預(yù)處理蛋白酶k樣品溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4~5%。

優(yōu)選的，所述的預(yù)凍時(shí)間為1~2h。

優(yōu)選的，所述的預(yù)凍真空度為50~80pa。

優(yōu)選的，所述的由第三溫度升溫至第四溫度，每小時(shí)的回溫速率在5~6℃。

優(yōu)選的，所述的由第四溫度升溫至第五溫度，每小時(shí)的回溫速率在5~7.5℃。

優(yōu)選的，所述的由第三溫度升溫至第四溫度的時(shí)間為2~5h。

優(yōu)選的，所述的由第四溫度升溫至第五溫度的時(shí)間為4~6.5h。

根據(jù)本發(fā)明所得的蛋白酶k凍干產(chǎn)品，其外觀形狀為成型的是白色圓餅狀，無冒泡，無萎縮現(xiàn)象發(fā)生，能有效保障產(chǎn)品的質(zhì)量以及保存。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的蛋白酶k的凍干工藝，利用蛋白酶k的理化性質(zhì)，通過預(yù)凍之后，進(jìn)行快速一次干燥，和解析干燥再降壓進(jìn)行一次干燥和解析干燥之后的特殊工藝，結(jié)合冷凝器的低溫，加速固態(tài)水的升華，將其凍干時(shí)間縮短至20-26個(gè)小時(shí)，比常規(guī)的凍干工藝時(shí)間（一般約40h）縮短了將近一半，大大提高了凍干的效率，而且讓蛋白酶k的儲(chǔ)存受溫度的影響降低，可以在室溫下進(jìn)行儲(chǔ)存，使其在生產(chǎn)以及運(yùn)輸過程的條件更為寬泛，在室溫條件下存儲(chǔ)長達(dá)數(shù)年之后，凍干蛋白酶k的穩(wěn)定性仍然很好，復(fù)溶之后的蛋白酶k的活性高，并且凍干樣品的復(fù)溶速度只需2秒。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1蛋白酶k的凍干工藝操作方法：

a.預(yù)處理：將50g蛋白酶k溶解在1l的純化水中，按照1ml/瓶分裝在5ml西林瓶中，作為待凍干樣品；

b.開啟冷凍干燥機(jī)，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第一溫度-50℃以下，將經(jīng)過預(yù)處理的蛋白酶k放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)快速冷凍；調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至-10℃，保持冷凍干燥室溫度-10℃，在60pa的壓強(qiáng)下產(chǎn)品保持2小時(shí)，再降溫至-50℃以下，保持2小時(shí)對(duì)蛋白酶k進(jìn)行預(yù)凍；

c.調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第二溫度-40℃，并在10pa的壓強(qiáng)下，使樣品在-40℃條件下保持2小時(shí)；

d.冷凝器的溫度降低至-40℃，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第三溫度-15℃，并在10pa的壓強(qiáng)下，使樣品在-15℃條件并保持2小時(shí)；

e.當(dāng)真空度低于5pa后，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第二溫度-40℃，使樣品在-40℃且真空條件下，保持2小時(shí)。再將冷凍干燥室內(nèi)溫度至第三溫度-15℃，并在5pa的壓強(qiáng)下，使樣品在-15℃條件并保持2小時(shí)；

f.調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度逐漸升溫至第四溫度0℃，每小時(shí)回溫不超過5℃，并在5pa的壓強(qiáng)下，使樣品在0℃條件下保持2小時(shí)；

g.調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度至第五溫度30℃，每小時(shí)回溫不超過7.5℃，維持冷凍干燥室溫度在30℃左右，在5pa的壓強(qiáng)下，使樣品在30℃條件下保持2小時(shí)；

h.關(guān)閉冷凍干燥機(jī)，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)環(huán)境至常壓、常溫后，取出蛋白酶k凍干品。

實(shí)施例2：允許范圍內(nèi)，改變凍干溫度、時(shí)間等參數(shù)下的蛋白酶k的凍干工藝操作方法：

a.預(yù)處理：將50g蛋白酶k溶解在1l的純化水中，按照1ml/瓶分裝在5ml西林瓶中，作為待凍干樣品；

b.開啟冷凍干燥機(jī)，再將蛋白酶k溶液樣品放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，溫度調(diào)節(jié)至第一溫度-50℃以下并保持溫度在-50℃以下，對(duì)蛋白酶k進(jìn)行冷凍，再升溫至溫度-15℃，保持1小時(shí)，再降溫至-50℃以下，保持1小時(shí)對(duì)蛋白酶k進(jìn)行預(yù)凍；

c.調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第二溫度-45℃，并在20pa的壓強(qiáng)下，使樣品在-45℃條件下保持1小時(shí)；

d.冷凝器的溫度降低至-40℃，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第三溫度-10℃，并在20pa的壓強(qiáng)下，使樣品在-15℃條件并保持1小時(shí)；

e.當(dāng)真空度低于5pa后，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)溫度至第二溫度-45℃，使樣品在-45℃且真空條件下，保持3小時(shí)。再將冷凍干燥室內(nèi)溫度至第三溫度-10℃，并在5pa的壓強(qiáng)下，使樣品在-10℃條件并保持3小時(shí)；

f.調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度逐漸升溫至第四溫度5℃，每小時(shí)回溫不超過6℃，并在5pa的壓強(qiáng)下，使樣品在5℃條件下保持3小時(shí)；

g.調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度至第五溫度40℃，每小時(shí)回溫不超過5℃，維持冷凍干燥室溫度在40℃左右，在5pa的壓強(qiáng)下，使樣品在40℃條件下保持3小時(shí)；

h.關(guān)閉冷凍干燥機(jī)，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)環(huán)境至常壓、常溫后，取出蛋白酶k凍干品。

實(shí)施例1以及實(shí)施例2，所制得的凍干蛋白酶k，外觀形狀皆為成型的白色圓餅狀，無冒泡，無萎縮現(xiàn)象發(fā)生，能有效保障產(chǎn)品的質(zhì)量以及保存。

實(shí)施例3：本發(fā)明的凍干工藝凍干的蛋白酶k在核酸提取操作中的應(yīng)用。

1.病毒樣品核酸提取

實(shí)驗(yàn)分為兩組，兩組都是采用本發(fā)明的凍干工藝所獲得的凍干蛋白酶k，一組是在37℃條件下放置2年的蛋白酶k凍干品，另一組是新制備的蛋白酶k凍干品。兩組凍干品用于病毒樣品的核酸提取實(shí)驗(yàn)過程中，以進(jìn)一步測試新的蛋白酶k的凍干工藝。測試實(shí)驗(yàn)使用廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

1.在1.5ml的無菌離心管內(nèi)加入50μl的蛋白酶k，20μl的磁珠，取200μl樣本加入離心管中，并計(jì)算蛋白酶k所需的復(fù)溶時(shí)間；

2.再加入300μl的磁珠結(jié)合液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15秒以充分混勻。56℃溫育10分鐘，期間不時(shí)振蕩混勻（同時(shí)可將洗脫液置于56℃預(yù)熱）；

3.將離心管放入磁力架上，吸磁1分鐘，然后用移液器將所有上清小心吸棄；

4.將500μl的磁珠洗滌液1加入離心管，移液器反復(fù)吹打10次以重懸磁珠；

5.將離心管放入磁力架上，吸磁1分鐘，然后用移液器將所有上清小心吸棄；

6.將500μl的磁珠洗滌液2加入離心管，移液器反復(fù)吹打10次以重懸磁珠；

7.將離心管放入磁力架上，吸磁1分鐘，然后用移液器將所有上清小心吸棄；

8.將500μl的磁珠洗滌液2加入離心管，移液器反復(fù)吹打10次以重懸磁珠；

9.將離心管放入磁力架上，吸磁1分鐘，然后用移液器將所有上清小心吸棄，不剩余殘余液體；

10.將離心管移離磁力架，打開管蓋，室溫靜置10分鐘；

11.往離心管內(nèi)加入56℃預(yù)熱的洗脫液60μl，移液器反復(fù)吹打10次，充分懸浮磁珠；

12.蓋緊管蓋，56℃靜置2分鐘后，將離心管放入磁力架上，吸磁1分鐘。將上清吸至一個(gè)新的離心管中。離心管內(nèi)即為核酸溶液。

2.紫外分光光度計(jì)檢測所抽提的dna濃度與純度

用紫外分光光度計(jì)檢測dna在260nm和280nm下的吸光值。計(jì)算od260與od280的比值，獲得的基因組dna的od260/od280。新制備的蛋白酶k凍干的od260/od280在1.96，放置兩年的蛋白酶k凍干的od260/od280在1.93。

該結(jié)果表明，使用本發(fā)明的方法所凍干的蛋白酶k復(fù)溶所需的時(shí)間不超過兩秒，在室溫下放置2年后仍然可以用于核酸提取等實(shí)驗(yàn)，蛋白酶k的活性與效果不受影響。

當(dāng)然，本發(fā)明創(chuàng)造并不局限于上述實(shí)施方式，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明精神的前提下還可做出等同變形或替換，這些等同的變形或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。