本發(fā)明涉及酶或微生物的測定或檢驗(yàn)方法，具體是一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法。
背景技術(shù)：
苯扎氯銨溶液為氯化二甲基芐基氫胺的混合物，無色或淡黃色的澄清液體，氣芳香，味極苦，振搖時能產(chǎn)生大量泡沫，用于手術(shù)前皮膚消毒，粘膜和傷口消毒。
苯扎氯銨為陽離子表面活性劑，廣譜殺菌劑，對革蘭氏陽性細(xì)菌作用較強(qiáng)，在制藥工程中作為防腐劑使用。由于苯扎氯銨原料抑菌作用大，在設(shè)計(jì)微生物限度檢查方法上存在極大的困難。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明就是為了解決苯扎氯銨原料抑菌作用大，微生物限度檢查困難的問題，所提出的一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法。
本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法，包括以下步驟：
ⅰ.取苯扎氯銨溶液，加入稀釋液，制成1:10供試液；
ⅱ.用無菌吸頭吸取1份供試液，加入到50份稀釋液中，混勻；
ⅲ.先用少量沖洗液潤洗低吸附性濾膜，再采用薄膜過濾法將稀釋后供試液全量過濾，用沖洗液分次沖洗濾膜，每次的沖洗量為總沖洗量的1/16；
ⅳ.同法制備兩張濾膜，分別貼于兩種不同的培養(yǎng)基上，適宜條件培養(yǎng)后，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)；
ⅴ.陰性對照：采用薄膜過濾法將稀釋液進(jìn)行過濾，菌面朝上貼于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
所述稀釋液和沖洗液的成分為蛋白胨干粉和吐溫-80，二者的質(zhì)量份數(shù)比為1:1。
所述稀釋液和沖洗液的制備方法為：稱蛋白胨干粉5份、吐溫-805份，溶于1000份水中，調(diào)ph使滅菌后的ph值為7.1±0.2，115-121℃高壓滅菌15-30分鐘。
所述總沖洗量為800ml。
所述培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于30-35℃培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于20-25℃培養(yǎng)5天。
所述陰性對照稀釋液過濾后，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30-35℃培養(yǎng)3天。
本發(fā)明獲得了如下的有益效果。
本發(fā)明有效的解決了苯扎氯銨原料抑菌作用大，微生物限度檢查困難的問題。本發(fā)明通過前期大量計(jì)數(shù)方法適用性初篩試驗(yàn)，確定了稀釋液、沖洗液以及稀釋液、沖洗液的量，且試驗(yàn)結(jié)果以“cfu/ml”計(jì)算，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的試驗(yàn)方法科學(xué)，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，填補(bǔ)了苯扎氯銨原料微生物限度檢查方法的空白，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
一、試驗(yàn)準(zhǔn)備：
1．供試品：苯扎氯銨溶液（10%）
2.菌種：
金黃色葡萄球菌（cmcc（b）26003）
銅綠假單胞菌（cmcc（b）10104）
枯草芽孢桿菌（cmcc（b）63501）
白色念珠菌（cmcc（f）98001）
黑曲霉菌（cmcc（f）98003）
以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自中國藥品生物制品檢定所或天津市藥品檢驗(yàn)所。
3．培養(yǎng)基（詳見表1）
4．培養(yǎng)基、沖洗液、中和劑配制方法（詳見表2）
5．試驗(yàn)儀器（詳見表3）
6.菌懸液的制備：
a.增菌：分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30-35℃恒溫箱培養(yǎng)18-24小時；接種白色念珠菌、黑曲霉菌于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，20-25℃恒溫箱培養(yǎng)，白色念珠菌培養(yǎng)24-48小時，黑曲霉菌5-7天，用3-5ml含0.05%吐溫80的0.9%無菌nacl溶液將黑曲霉孢子洗脫，用管口帶有無菌脫脂棉的毛細(xì)管收集孢子懸液于無菌試管中保存，備用。
b.菌液稀釋：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌nacl溶液按10倍稀釋，制成試驗(yàn)菌液；試驗(yàn)菌液每毫升含菌量小于100cfu。
c.新制備的菌懸液在室溫條件下應(yīng)在2小時內(nèi)使用，2-8℃冷藏可保存24小時。
二、試驗(yàn)方法的建立
《中國藥典》規(guī)定：供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。
方法適用性試驗(yàn)需要證明稀釋液、沖洗液本身對試驗(yàn)菌的生長無影響，并且能夠明顯降低抑菌成分，故需要考察稀釋液、沖洗液的毒性和效力。由于季銨鹽類的苯扎氯銨溶液對革蘭氏陽性菌的殺菌效果明顯，對革蘭氏陰性菌殺傷力較差，且不能殺滅細(xì)菌芽孢和真菌孢子，因此選擇金黃色葡萄球菌作為供試液對照組試驗(yàn)菌株。
1.供試液制備
取苯扎氯銨溶液（10%）10ml，用含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液作為稀釋劑，制成1:10供試液。
2.試驗(yàn)操作
2.1試驗(yàn)組
取制備好的供試液10ml加入到500ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液中，混勻，加入小于100cfu的菌液。用含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液潤洗濾膜后，將加入菌液的供試液全量過濾，用800ml同一沖洗液分次沖洗，每次50ml/膜。每一試驗(yàn)菌同法操作。
取下濾膜。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的膜分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30-35℃培養(yǎng)3天；白色念珠菌、黑曲霉菌的膜各制備2份，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30-35℃培養(yǎng)5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20-25℃培養(yǎng)5天（以下培養(yǎng)條件相同）。
2.2供試液對照組
以制備菌液用的稀釋液代替試驗(yàn)菌液，同試驗(yàn)組操作，制備兩膜，分別貼于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tsa）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sda）上，相應(yīng)溫度培養(yǎng)，測定其本底菌數(shù)。
2.3菌液對照組
取10ml不含吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液代替供試液，加到500ml稀釋液中，加入小于100cfu試驗(yàn)菌液，全量過濾，以測定所加菌懸液生菌數(shù)。每一試驗(yàn)菌同法操作。
2.4中和劑組
取10ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液代替供試液，同試驗(yàn)組操作，每一試驗(yàn)菌同法操作，以確認(rèn)其有效性和對微生物的無毒性。
3.方法適用性試驗(yàn)結(jié)果（詳見表4）
4.結(jié)論
以上適用性試驗(yàn)結(jié)果表明:各試驗(yàn)組菌落數(shù)回收率（即（試驗(yàn)組-供試品對照組）菌落數(shù)/菌液組菌落數(shù)）在0.5-2范圍內(nèi)；中和劑對照組菌數(shù)回收率（中和劑對照組菌落數(shù)/菌液組菌落數(shù)）在0.5-2范圍內(nèi)。所以該試驗(yàn)方法可以用于該供試品的微生物限度檢查。
5.日常微生物限度檢查方法確立
取苯扎氯銨溶液（10%）10ml，加入含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液，制成1:10供試液。用無菌吸頭吸取10ml（相當(dāng)于供試品1ml苯扎氯銨溶液），加入到500ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液中，混勻。先用少量含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液沖洗液潤洗濾膜，再采用薄膜過濾法將供試液全量過濾，用800ml沖洗液分次沖洗，每次50ml。同法制備兩張濾膜，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，胰酪大豆胨瓊脂皿30-35℃3天培養(yǎng)；沙氏葡萄糖瓊脂皿20-25℃5天培養(yǎng)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。
陰性對照：取稀釋液50ml，過濾，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)皿上，30-35℃培養(yǎng)3天，不得有菌生長。