本發(fā)明涉及微生物學(xué)和植物病害生防技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一株貝萊斯芽孢桿菌js25r及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起麥類赤霉病(fusariumheadblight，fhb)，禾谷鐮刀菌為限制小麥產(chǎn)量的一個(gè)主要因素(dubin,1997)。我國(guó)氣候條件十分有利于麥類赤霉病的發(fā)生，長(zhǎng)江中下游地區(qū)常年病害造成產(chǎn)量損失10％-15％，大流行年份減產(chǎn)近50％。由于全球氣候變暖以及秸稈還田、免耕栽培等耕作制度改變的影響，我國(guó)麥類赤霉病的發(fā)生區(qū)域由長(zhǎng)江流域迅速向西北、華北擴(kuò)展，特別是在2008、2010和2012年，全國(guó)麥類赤霉病發(fā)生十分嚴(yán)重，造成了嚴(yán)重的產(chǎn)糧損失和不良的社會(huì)影響，嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食安全。

禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don，3,7,15三羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮)是存在于赤霉病菌感染麥粒中的主要天然毒素之一。don已被認(rèn)定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物之一，被列入國(guó)際研究的優(yōu)先地位。don可致人免疫力下降、貧血、頭痛、腹痛、惡心；致動(dòng)物拒食、生長(zhǎng)延滯和流產(chǎn)(rochaetal.,2005；sobrovaetal.,2010；pestka,2010)。don廣泛存在并大量污染小麥及其制品，對(duì)人畜構(gòu)成很大危害，嚴(yán)重威脅我國(guó)食品安全。因此，加強(qiáng)禾谷鐮刀菌防控研究已成為保障我國(guó)糧食安全和食品安全的迫切需求。

多年來(lái)對(duì)麥類赤霉病防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但隨著化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題，加之多年用藥已導(dǎo)致病原菌抗藥性禾谷鐮刀菌菌株的出現(xiàn)，使防治難度加大。雖然在赤霉病抗性品質(zhì)方面國(guó)內(nèi)外投入大量的精力開(kāi)展相關(guān)研究，但至今尚無(wú)理想的高抗小麥品種(李正輝等，2007)。

生物防治不僅可降低對(duì)環(huán)境的影響，還不易產(chǎn)生抗藥性，相關(guān)理論和技術(shù)的研究日益為人們所關(guān)注。貝萊斯芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，在自然界中廣泛存在,對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害,不污染環(huán)境,能產(chǎn)生多種抗菌素和酶,具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，較其他微生物更具有開(kāi)發(fā)為生物防控菌劑的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株貝萊斯芽孢桿菌js25r及其在生物防治由鐮刀菌引起的植物病害中的應(yīng)用。

本發(fā)明從江蘇采集的小麥病穗中分離純化出對(duì)禾谷鐮刀菌拮抗能力強(qiáng)的一株菌命名為js25r，根據(jù)其菌落和菌體形態(tài)特征，生理生化特性以及16srdna序列分析，鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌(bacillusvelezensis)。菌株js25r現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)cgmccno.14240，保藏日期2017年6月13日。

本發(fā)明還提供所述的貝萊斯芽孢桿菌js25r在生物防治由鐮刀菌引起的植物病害中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述鐮刀菌為禾谷鐮刀菌(f.graminearum)。所述病害為赤霉病或穗腐病或根腐病。所述植物為谷物，所述谷物為小麥或玉米，優(yōu)選小麥。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，驗(yàn)證了貝萊斯芽孢桿菌js25r在減輕由禾谷鐮刀菌(f.graminearum)j07引起的小麥品種‘石新828’赤霉病病害中的作用。

本發(fā)明還提供含有所述貝萊斯芽孢桿菌js25r的微生物菌劑。

本發(fā)明還提供所述貝萊斯芽孢桿菌js25r或所述菌劑在制備防治由鐮刀菌引起的植物病害的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種含有所述貝萊斯芽孢桿菌js25r或所述菌劑的用于防治由鐮刀菌引起的植物病害的藥物。

所述藥物可按如下方法制備得到：

通過(guò)常規(guī)的液體后固體培養(yǎng)，獲得包括細(xì)菌菌體培養(yǎng)物，通過(guò)常規(guī)的液體發(fā)酵生產(chǎn)，加入表面活性劑如分散劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、粘結(jié)劑、消泡劑、崩解劑、抗凍劑等中的一種或幾種，或吸附載體按一定比例混合后，制備成可濕性粉劑、水分散粒劑、懸浮劑、懸乳劑、水乳劑或微乳劑。

本發(fā)明還提供所述貝萊斯芽孢桿菌js25r或所述菌劑在制備農(nóng)用復(fù)混肥中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種農(nóng)用復(fù)混肥，其由含有所述貝萊斯芽孢桿菌js25r的微生物菌劑，與氮肥、磷肥、鉀肥或復(fù)合肥組成。

利用本發(fā)明的貝萊斯芽孢桿菌s25r防治鐮刀菌引起的植物病害的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法是在植物生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行噴霧處理。噴霧制劑為該貝萊斯芽孢桿菌的菌懸液或發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物或制備的農(nóng)藥制劑。

本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明提供的貝萊斯芽孢桿菌js25r不僅在平板培養(yǎng)時(shí)可高效抑制禾谷鐮刀菌，而且在溫室實(shí)驗(yàn)中其防治效果高達(dá)77.4％。作為小麥和玉米赤霉病的生物防治材料，無(wú)論開(kāi)發(fā)新的生物農(nóng)藥或者生物防治菌劑，該菌都都具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a為以僅接種禾谷鐮刀菌菌盤(pán)的pda平板對(duì)照組，b為在距pda平板中心25mm處四點(diǎn)劃線接種相同體積和濃度的js25r。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中js25r產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a為接種禾谷鐮刀菌菌盤(pán)的pda平板的對(duì)照組，b為在na平板中心接種js25r，倒扣于接有禾谷鐮刀菌的平板。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

以下實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

nb液體培養(yǎng)基：由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏和nacl，溶劑為水；蛋白胨在nb液體培養(yǎng)基中的濃度為1％，牛肉膏在nb液體培養(yǎng)基中的濃度為0.3％，nacl在nb液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5％，所述％均為質(zhì)量體積百分比(g/100ml)。

na固體培養(yǎng)基：在nb液體培養(yǎng)基中加入瓊脂(瓊脂與液體培養(yǎng)基的比例為1.5g：100ml)，得到na固體培養(yǎng)基。

pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g,加入少量水煮20min，三層紗布過(guò)濾，取濾液用水定容至1l，加入20g葡萄糖，15g瓊脂，121℃高壓滅菌20min。

磷酸鹽緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為磷酸二氫鉀和氯化鎂，溶劑為水；磷酸二氫鉀的濃度為0.004％,氯化鎂的濃度為0.019％，所述％均為質(zhì)量體積百分比(g/100ml)。

禾谷鐮刀菌(f.graminearum)j07已在文獻(xiàn)“王瑤、趙月菊、邢福國(guó)、王龑、劉陽(yáng).禾谷鐮刀菌拮抗菌株的篩選及鑒定.核農(nóng)學(xué)報(bào)2017，31(6):1128-1136.”中公開(kāi)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得。

小麥?zhǔn)?28品種已在文獻(xiàn)“孫志軍，楊曉麗，張輝，張廣輝.小麥新品種石新828選育過(guò)程及高產(chǎn)栽培技術(shù).現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011(09)，96-97.”中公開(kāi)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得。

實(shí)施例1菌株js25r的分離與鑒定

一、菌的分離

(一)在超凈工作臺(tái)中，將30穗江蘇采集(2012年6月)的小麥病穗放在100ml無(wú)菌蒸餾水中震蕩15分鐘制備菌懸液，然后80℃水浴處理10分鐘。

(二)將菌懸液用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行濃度梯度稀釋后涂布在na培養(yǎng)基平板上，30℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)，菌落布滿整個(gè)平板，用接種環(huán)挑取平板上形態(tài)、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，點(diǎn)接純化后的菌株應(yīng)用于禾谷鐮刀菌對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將得到的對(duì)禾谷鐮刀菌拮抗能力強(qiáng)的一株菌命名為js25r。

二、鑒定

(一)按照“伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)”(第八版)和“常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京：科學(xué)出版社，2001.2)中描述的方法，對(duì)菌株js25r進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下：

菌體的形態(tài)和生理生化特性：

在na培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)1天，菌體桿狀，直徑約為0.6μm×2.0-2.5μm；菌落奶白色，圓形，微凸，邊緣整齊。

生理生化特征：

氧化酶：+；精氨酸雙水解酶：-；明膠水解：+；淀粉水解：+；過(guò)氧化氫酶：+；三丁酸甘油脂水解：+；硝酸鹽還原：+；七葉靈水解：+；酪素水解：+；tween80水解：-；吲哚實(shí)驗(yàn)：-；脲酶：-；檸檬酸利用：+；h2s生成：-；vp實(shí)驗(yàn)：+；厭氧生長(zhǎng)：-；4％nacl：-；ph4.0：+；50℃：-；20℃：+。

可利用甘油、d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、l-木糖、阿東醇、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、l-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、n-乙酰葡糖胺、七葉靈、水楊苷、d-纖維二糖、d-麥芽糖、d-乳糖、d-蜜二糖、d-蔗糖、d-棉籽糖、淀粉、糖原、d-來(lái)蘇糖、d-塔格糖、d-巖藻糖和l-巖藻糖產(chǎn)酸。

(二)16srdna序列測(cè)定

提取js25r的總dna，以其為模板，利用細(xì)菌16srdna通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1.4kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列如seqidno.1所示。

根據(jù)genbank序列同源性比較，菌株js25r與bacillusmethylotrophicusstrainlk6(genbank登錄號(hào)kc790234.1)同源性為99％，與bacillussp.ap-1(2015)(genbank登錄號(hào)km974803.1)同源性為99％，初步判定該菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌(bacillussp.)。

基于以上特征，將菌株js25r鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(bacillusvelezensis)。

實(shí)施例2貝萊斯芽孢桿菌js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用

采用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)貝萊斯芽孢桿菌js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗。

一、用直徑為5mm的打孔器在培養(yǎng)好的病原真菌禾谷鐮刀菌(f.graminearum)j07菌落邊緣打取菌盤(pán)，用滅菌的牙簽將菌盤(pán)挑入pda平板中心。

二、在距pda平板中心25mm處四點(diǎn)劃線接種相同體積和濃度的js25r，以僅接種禾谷鐮刀菌菌盤(pán)的pda平板為對(duì)照組，28℃培養(yǎng)4-5天，觀察有無(wú)抑菌帶形成。每個(gè)組做三個(gè)平行。結(jié)果如表1和圖1所示：

表1培養(yǎng)5天后js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用

如圖1和表1可知，貝萊斯芽孢桿菌js25r對(duì)禾谷鐮刀菌有很強(qiáng)的抑制效果。

實(shí)施例3貝萊斯芽孢桿菌js25r發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果

采用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)貝萊斯芽孢桿菌js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗。

一、用直徑為5mm的打孔器在培養(yǎng)好的病原真菌禾谷鐮刀菌(f.graminearum)j07菌落邊緣打取菌盤(pán)，用滅菌的牙簽將菌盤(pán)挑入pda平板中心。

二、在距pda平板中心25mm處四點(diǎn)打孔接種相同體積和濃度的js25r，以僅接種禾谷鐮刀菌菌盤(pán)的pda平板為對(duì)照組，28℃培養(yǎng)4-5天，觀察有無(wú)抑菌帶形成。每個(gè)組做三個(gè)平行。結(jié)果如表2所示，表明js25r對(duì)禾谷鐮刀菌有很強(qiáng)的抑制效果。

表2培養(yǎng)5天后js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用

實(shí)施例4貝萊斯芽孢桿菌js25r揮發(fā)性氣體對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果

采用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)貝萊斯芽孢桿菌js25r產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗。

一、用直徑為5mm的打孔器在培養(yǎng)好的病原真菌禾谷鐮刀菌(f.graminearum)j07菌落邊緣打取菌盤(pán)，用滅菌的牙簽將菌盤(pán)挑入pda平板中心。

二、在na平板中心接種js25r，倒扣于接有禾谷鐮刀菌的平板，以僅接種禾谷鐮刀菌菌盤(pán)的pda平板為對(duì)照組，28℃培養(yǎng)4-5天，觀察有無(wú)抑菌效果。每個(gè)組做三個(gè)平行。結(jié)果如圖2所示。表明js25r可產(chǎn)生抑制禾谷鐮刀菌的揮發(fā)性氣體。

進(jìn)一步對(duì)揮發(fā)性氣體的成分進(jìn)行了分析，gc-ms檢測(cè)結(jié)果顯示，共檢測(cè)到36種物質(zhì)(表3)。

表3通過(guò)gc-ms分析鑒定js25r的vocs

實(shí)施例5貝萊斯芽孢桿菌js25r對(duì)禾谷鐮刀菌抑制效果的溫室實(shí)驗(yàn)

一、將js25r在nb培養(yǎng)基中28℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，采用磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為2×10⁸cfu/ml。

二、將禾谷鐮刀菌j07用綠豆湯培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)(28℃，5天)，得到菌懸液，采用磷酸鹽緩沖液稀釋菌液濃度為2×10⁵cfu/ml。

三、將稀釋后的js25r與禾谷鐮刀菌j07按照1:1的體積比混合，終濃度分別為10⁸cfu/ml和10⁵cfu/ml。

四、在石新828品種的揚(yáng)花早期進(jìn)行麥穗中部接種，接菌體積為10μl，作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)以僅含有禾谷鐮刀菌的磷酸鹽緩沖液作為陽(yáng)性對(duì)照組，以僅接種磷酸緩沖液的作為陰性對(duì)照。每組設(shè)10個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

禾谷鐮刀菌菌懸液接種16天后，觀察麥穗的發(fā)病，有麥穗干枯發(fā)白或發(fā)紅，內(nèi)部籽粒不飽滿、重量減輕表現(xiàn)的麥穗為發(fā)病麥穗。其中赤霉病指數(shù)＝發(fā)病率×發(fā)病指數(shù)/100。

表4js25r對(duì)禾谷鐮刀菌的田間防治效果

結(jié)果如表4所示，貝萊斯芽孢桿菌js25r在溫室條件下能很好防治禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

參考文獻(xiàn)

1.dubinhj.fusariumheadscab:globalstatusandfutureprospects:proceedingsofaworkshopheldatcimmyt,elbatan,mexico,13-17october,1996.cimmyt；1997.

2.rochao,ansarik,doohanfm.effectsoftrichothecenemycotoxinsoneukaryoticcells:areview.foodadditivesandcontaminants:parta:chemistry,analysis,control,exposureandriskassessment,2005,22:369-378.

3.sobrovap,adamv,vasatkovaa,beklovam,zemanl,kizekr.deoxynivalenolanditstoxicity.interdisciplinarytoxicology,2010,3:94–99.

4.pestkajj.deoxynivalenol:mechanismsofaction,humanexposure,andtoxicologicalrelevance.archivesoftoxicology,2010,84:663-679.

5.李正輝,向晶晶,陳婧鴻,葛翠風(fēng),葛紹榮.小麥赤霉病拮抗菌的分離與鑒定.麥類作物學(xué)報(bào),2007:149-152.

6.王瑤、趙月菊、邢福國(guó)、王龑、劉陽(yáng).禾谷鐮刀菌拮抗菌株的篩選及鑒定.核農(nóng)學(xué)報(bào)2017，31(6):1128-1136.

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所

<120>貝萊斯芽孢桿菌js25r及其應(yīng)用

<130>khp171113873.2

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1448

<212>貝萊斯芽孢桿菌(bacillusvelezensis)

<213>人工序列

<400>1

taattcggcggctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagc60

ggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaa120

ccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcg180

gctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacca240

aggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggc300

ccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgga360

gcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaac420

aagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaact480

acgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgta540

aagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggaggg600

tcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggt660

gaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactg720

acgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccg780

taaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcatt840

aagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcc900

cgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtct960

tgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtgg1020

tgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaa1080

cccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactttaaggtgactgccggtgacaaac1140

cggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgt1200

gctacaatgggcagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatct1260

gttctcagttcggatcgcagtttgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatc1320

gcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacc1380

acgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccgaagtg1440

atccggat1448