本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合溶磷菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磷是植物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，對于植物生長至關(guān)重要，但是土壤中的大部分有機(jī)磷和無機(jī)磷卻不能直接被植物吸收利用。我國74％的耕地土壤缺磷，且土壤中95％以上的磷為無效磷，造成有效磷資源的極度匱乏。施用磷肥可給植物提供磷素養(yǎng)分，但植物對磷肥的當(dāng)季利用率一般只有5％～25％，由于耕地長期施用磷肥，大部分磷肥作為無效態(tài)在耕地土壤中積累，對生態(tài)環(huán)境造成影響。

土壤溶磷微生物不但能夠促進(jìn)植物對各種營養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)植株根系的生長，提高植物對磷的利用率，改善植物營養(yǎng)條件，提高作物產(chǎn)量，增加植株抗病能力，還可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高有機(jī)質(zhì)含量，改良鹽堿地，對培育和充分發(fā)揮土壤生態(tài)肥力、保持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有重要作用。因此，土壤溶磷微生物的研究具有良好的發(fā)展前景和應(yīng)用意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合溶磷菌劑，可以高效的將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)換為可供小麥直接吸收的優(yōu)質(zhì)磷。

本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明的復(fù)合溶磷菌劑，由溶磷菌ws32與溶磷菌p1616混合發(fā)酵制成，所述溶磷菌ws32的分類命名為假單胞菌(pseudomonassp.)，2017年6月9日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2017319，保藏單位地址為武漢大學(xué)，所述溶磷菌p1616的分類命名為芽孢桿菌(bacillussp.)，2017年6月2日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2017298，保藏單位地址為武漢大學(xué)。

本發(fā)明菌株形態(tài)特征：溶磷菌ws32菌株為革蘭氏陰性菌，菌落整齊，呈淡黃色，接觸酶試驗顯示陰性，淀粉酶試驗顯示陽性；溶磷菌p1616為革蘭氏陽性菌，菌落不整齊，呈白色，有芽孢，接觸酶試驗顯示陽性，淀粉酶試驗顯示陽性。

本發(fā)明復(fù)合溶磷菌劑為液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑或者固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑。

本發(fā)明液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑的制備方法如下，

將溶磷菌ws32和溶磷菌p1616的菌液按1：0.5～2的體積比混合，其中兩種菌液中的菌數(shù)均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi)，然后將混合的菌液以2～5％的接種量接入80～120ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在25～30℃、120～180r/min的條件下，震蕩培養(yǎng)18～48h，即制得液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑。

本發(fā)明固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑的制備方法如下，

在上述液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑中加入干燥的泥炭60～180g混勻，即制得固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑。

本發(fā)明的液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑中溶磷菌ws32和溶磷菌p1616的總菌數(shù)為1×10⁸～9×10⁸cfu/ml。

本發(fā)明復(fù)合溶磷菌劑在促進(jìn)小麥的生長、促進(jìn)小麥對磷素吸收以及降低化肥使用量的應(yīng)用。

本發(fā)明復(fù)合溶磷菌劑用于小麥的拌種或包衣或澆根或蘸根。

本發(fā)明液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑每畝小麥田施用量為1～4l，固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑每畝小麥田施用量為1～4kg。

ws32的16srrna如seqidno.1所示，p1616的16srrna如seqidno.2所示。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的ws32和p1616與小麥具有親和性，可與小麥凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)，可在小麥根部長期定居存活，發(fā)揮促進(jìn)小麥生長的作用。

2、本發(fā)明的復(fù)合菌劑具有強(qiáng)的產(chǎn)有機(jī)酸和磷酸酶能力，保證高效溶磷、解磷效果。

3、采用本發(fā)明的ws32和p1616制備的液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑或固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑具有顯著的溶磷效果，既能溶解難溶態(tài)無機(jī)磷，又能降解難溶態(tài)有機(jī)磷，利用ws32和p1616自身的代謝能力將不溶態(tài)的無機(jī)磷素和有機(jī)磷素釋放出來，大幅度提高菌液中或土壤中速效性磷的含量。

4、本發(fā)明的復(fù)合溶磷菌劑使用方法簡單，可采用拌種、包衣、澆根、蘸根等方法進(jìn)行接種。

5、本發(fā)明的液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑或固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑的施用劑量低，液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑每畝小麥田施用量僅為1～4l，固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑每畝小麥田施用量僅為1～4kg，與其它每畝小麥田施用量為30～50kg的大劑量的生物肥料產(chǎn)品相比較，本發(fā)明可大幅度降低生產(chǎn)成本，節(jié)能環(huán)保。

附圖說明

圖1是難溶性無機(jī)磷磷酸三鈣培養(yǎng)基發(fā)酵液中可溶性磷濃度；

圖2是難溶性有機(jī)磷植酸鈣培養(yǎng)基發(fā)酵液中溶磷菌產(chǎn)酸性磷酸酶活性

圖3是ws32的菌落圖；

圖4是p1616的菌落圖；

圖5是ws32與p1616菌液體積比為1:1的菌落圖；

圖6是ws32與p1616菌液體積比為1:2的菌落圖；

圖7是ws32與p1616菌液體積比為2:1的菌落圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做具體說明。

實施例1ws32菌株與p1616菌株的篩選

采用選擇培養(yǎng)基結(jié)合凝集素篩選法從小麥根際篩選出與小麥具有特異親和作用的小麥根際溶磷菌29株；選用不同的溶磷培養(yǎng)基，分別添加ca3(po4)2、fepo4、alpo4、cahpo4·2h2o等難溶性無機(jī)磷，以及卵磷脂、植酸鈣等難溶性有機(jī)磷；采用鉬銻抗比色法測定各菌株發(fā)酵液中可溶性磷的濃度，測定29株菌株對不同形態(tài)難溶磷的溶解能力，確定其中5株菌溶磷效果較好。將這5株小麥高效溶磷菌分別以不同比例兩兩混合培養(yǎng)，測定其溶磷能力，發(fā)現(xiàn)其中ws32菌株與p1616菌株溶磷效果最佳，將兩株菌經(jīng)16srrna分子測序確定ws32為假單胞菌屬，p1616為芽孢桿菌屬。

實施例2復(fù)合溶磷菌劑的溶磷能力

將ws32和p1616菌液分別按體積比1：0、0：1、2：1、1：1、1：2混合，其中兩種菌液中的菌數(shù)均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi)，以3％的接種量接入磷酸三鈣培養(yǎng)基，三角瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為160r/min、28℃、培養(yǎng)9天；采用鉬銻抗比色法每天定時測定發(fā)酵液中可溶性磷的濃度，結(jié)果如圖1所示，圖1中，w:p表示ws32：p1616，復(fù)合溶磷菌較單菌株的溶磷效果大大提高。

實施例3復(fù)合溶磷菌劑分泌有機(jī)酸和磷酸酶能力

(1)溶磷菌解無機(jī)磷原理為分泌有機(jī)酸，溶解土壤中難溶態(tài)無機(jī)磷為可溶態(tài)磷，供植物吸收利用。

采用磷酸三鈣培養(yǎng)基，高效液相色譜法測有機(jī)酸種類和濃度。液體搖瓶培養(yǎng)7d，取菌液1ml，離心，再經(jīng)0.22μm濾膜真空抽濾后上液相色譜。分離條件：色譜柱為hypersilc18(250nm×4.6mmid，5μm)，流動相為0.02mol/l的kh2po4緩沖溶液-甲醇溶液(99％:1％)，用1mol/l磷酸調(diào)節(jié)ph至2.60，紫外檢測波長210nm，進(jìn)樣量10μl，流速0.5ml/min，柱溫30℃，得到表1。

由表1可見，復(fù)合溶磷菌在磷酸三鈣培養(yǎng)基中產(chǎn)生的有機(jī)酸種類更多，濃度更大，有利于對難溶態(tài)無機(jī)磷的溶解。

表1高效液相色譜法對菌株分泌有機(jī)酸種類和濃度的測定

(2)溶磷菌解有機(jī)磷原理為產(chǎn)生磷酸酶，通過磷酸酶的酶降解作用，將土壤中的難溶性有機(jī)磷降解為有效磷。

對菌液中磷酸酶活性的測定采用植酸鈣培養(yǎng)基，磷酸苯二鈉法測定。結(jié)果如圖2所示。圖2中，w:p表示ws32：p1616，復(fù)合溶磷菌酸性磷酸酶活性最高，這加速了植酸鈣的分解，促進(jìn)磷素釋放，從而提高小麥磷素營養(yǎng)。

實施例4液態(tài)溶磷菌劑的制備以及用于小麥的盆栽實驗

液態(tài)溶磷菌劑包括液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑、液態(tài)ws32溶磷菌劑和液態(tài)p1616溶磷菌劑。

液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑的制備

將ws32和p1616菌液分別按體積比2：1、1：1、1：2混合，其中兩種菌液中的菌數(shù)均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi)，并以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養(yǎng)30h，即制得液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑。

液態(tài)ws32溶磷菌劑的制備

將ws32(菌液中的菌數(shù)在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi))以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養(yǎng)30h，即制得液態(tài)ws32溶磷菌劑。

液態(tài)p1616溶磷菌劑的制備

將p1616(菌液中的菌數(shù)在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi))以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養(yǎng)30h，即制得液態(tài)p1616溶磷菌劑。

液態(tài)溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

小麥種子催芽，取適量小麥種子用水沖洗一次，然后用70％酒精浸泡3min消毒并去除干癟種子，再用無菌水沖洗5次，最后用適量的水浸泡，放于25℃培養(yǎng)箱中催芽，待種子露白即可播種。小麥盆栽設(shè)3個處理組和1個對照組：即施液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑處理組(ws32和p1616菌液體積比分別為2:1，1:1，1:2)、施液態(tài)ws32溶磷菌劑處理組、施液態(tài)p1616溶磷菌劑處理組和施空白培養(yǎng)基對照組。每個處理組三個重復(fù)樣。處理組每盆接種液態(tài)溶磷菌劑5ml，對照組只接進(jìn)5ml空白培養(yǎng)基，待苗出齊后每盆定苗5株，日常管理水肥，于125d采收，測定小麥株高、鮮重、干重、地上部分葉片磷含量及盆栽后土壤的磷含量。

試驗結(jié)果如表2所示：

液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑接種的小麥株高、鮮重、干重、土壤速效磷含量、葉片全磷含量分別較未接液態(tài)菌劑的對照增加6.1％～25.6％、6.9％～8.9％、15.1％～19.3％、8.3％～14.8％、37.8％～49.7％，各參數(shù)較單菌劑接種的小麥也有較大幅度提高。證明了施用液態(tài)復(fù)合溶磷菌劑能夠提高小麥對磷的吸收，促進(jìn)小麥生長。

表2液態(tài)溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

實施例5固態(tài)溶磷菌劑的制備以及用于小麥的盆栽實驗

固態(tài)溶磷菌劑包括固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑、固態(tài)ws32溶磷菌劑和固態(tài)p1616溶磷菌劑。

固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑的制備

將ws32和p1616菌液分別按體積比2：1、1：1、1：2混合，其中兩種菌液中的菌數(shù)均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi)，并以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養(yǎng)30h，加入干燥的泥炭150g混勻，即制得固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑。

固態(tài)ws32溶磷菌劑的制備

將ws32(菌液中的菌數(shù)在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi))以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養(yǎng)30h，加入干燥的泥炭150g混勻，即制得固態(tài)ws32溶磷菌劑。

固態(tài)p1616溶磷菌劑的制備

將p1616(菌液中的菌數(shù)在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內(nèi))以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養(yǎng)30h，加入干燥的泥炭150g混勻，即制得固態(tài)p1616溶磷菌劑。

固態(tài)溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

本實施例的小麥的盆栽實驗與實施例4的小麥的盆栽實驗不同之處在于，實施例4的小麥的盆栽實驗“處理組每盆接種液態(tài)溶磷菌劑5ml，對照組只接進(jìn)5ml空白培養(yǎng)基”，本實施例的小麥的盆栽實驗“每盆接種固態(tài)溶磷菌劑5g，對照組接入經(jīng)121℃、20min滅活處理的固態(tài)溶磷菌劑5g”。

試驗結(jié)果如表3所示

固態(tài)復(fù)合菌劑接種的小麥株高、鮮重、干重、葉片全磷含量分別較未接菌劑的對照增加6.3％～12.7％、7.6％～9.3％、13.1％～16.7％、42.5％～52.9％，各參數(shù)較單菌劑接種的小麥也有較大幅度提高。證明了施用固態(tài)復(fù)合溶磷菌劑能夠提高小麥對磷的吸收，促進(jìn)小麥生長。

表3固態(tài)溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種復(fù)合溶磷菌劑及其制備方法和應(yīng)用

<130>2

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1406

<212>dna

<213>假單胞菌（pseudomonassp.）

<400>1

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<213>芽孢桿菌（bacillussp.）

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