本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種新型新生兒敗血檢快速檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

新生兒敗血癥是新生兒常見疾病之一，指新生兒期致病菌經(jīng)各種途徑侵入其血循環(huán)系統(tǒng)，并在其中生長繁殖、產(chǎn)生毒素，最終造成全身性的炎癥反應(yīng)。該病的病因較復(fù)雜，常見致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷白桿菌及b組鏈球菌等，主要通過宮內(nèi)感染、產(chǎn)時(shí)感染及產(chǎn)后感染。新生兒敗血癥是新生兒常見的全身性疑團(tuán)莫釋感染疾病。

新生兒時(shí)期該病的發(fā)生率和病死率均較高，常常會(huì)危及到新生兒的生命，嚴(yán)重者可并發(fā)化膿性腦膜炎并遺留中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，但因缺乏典型的臨床表現(xiàn)和體征，往往病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重威脅新生兒的生命。由新生兒敗血癥引起的指新生兒期病原菌進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并進(jìn)行繁殖釋放毒素進(jìn)而導(dǎo)致全身性感染，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因之一，其發(fā)生率為0。1％至1.0％，在早產(chǎn)兒中發(fā)生率更高，病死率高達(dá)10％至50％，因此做好早期診斷具有重要意義。

目前，臨床上的血培養(yǎng)檢測細(xì)菌常用方法由于檢測時(shí)間長，且陽性率較低，難以達(dá)到早期診斷的目的。例如，作為目前新生兒敗血癥有主要診斷手?jǐn)嗟募?xì)菌培養(yǎng)，受細(xì)菌培養(yǎng)周期的影響，其相關(guān)診斷結(jié)果需要在培養(yǎng)后72小時(shí)以后才可以獲得。即便如此，由于一些相關(guān)細(xì)菌分離存在一定的困難，使得結(jié)果出現(xiàn)一定概率的假陰性，相關(guān)報(bào)告表明在確診的新生兒中有30％-40％的患兒血液培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)了假陰性情況。而臨床常用的其它非特異性指標(biāo)也存在著一定的問題，例如crp在感染后24小時(shí)左右才會(huì)出現(xiàn)升高的情況，而出生體重較低的嬰兒反應(yīng)更慢，白細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)在診斷新生兒敗癥明缺乏敏感性與特異性。

對(duì)于新生兒敗血癥的檢測與診斷，傳統(tǒng)的診斷方法存在的固有的缺點(diǎn)，例如操作周期長，靈敏度低等。因此有必要建立一個(gè)快速、準(zhǔn)確的診斷方法，確保新生兒敗血癥檢測與診斷進(jìn)行快速診斷

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新型新生兒敗血癥快速檢測試劑盒，其目的在于對(duì)新生兒敗血癥進(jìn)行快速檢測，起到早其診斷的目的，可用于臨床可疑感染患者的病原鑒別與診斷。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：通過一種熒光pcr引物、探針及試劑盒的制備對(duì)疑似患有新生兒敗血癥的患兒的血樣進(jìn)行分析、檢測，進(jìn)而起到快速診斷新生兒敗血癥的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測用引物及探針對(duì)新生兒敗血癥進(jìn)行檢測。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供的用于檢測新生兒敗血癥的引物序列為seqidno.1～seqidno.2

進(jìn)一步，本發(fā)明提供的用于檢測新生兒敗血癥的所述探革蘭陽性菌及陰性菌探針，所述序列分別為seqidno.3和seqidno.4，探針的5’端分別連接不同的報(bào)告基團(tuán)，3’端連接非發(fā)光的猝滅基團(tuán)：

優(yōu)選的，所述報(bào)告基團(tuán)為fam,tet,joe或hex其中一種，淬滅基團(tuán)為tamra或bhq1其中一種，所述檢測體系中還加有rt-pcrmix及超純水。所述試劑盒還含有rt-pcr酶及陽性對(duì)照品。

優(yōu)選的，所述陽性對(duì)照品以革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的目的基因片斷進(jìn)行pcr擴(kuò)增并將擴(kuò)增的目的電泳條帶回收，連接到克隆質(zhì)粒載體，測序篩選陽性克隆，并以陽性重組質(zhì)粒做為陽性對(duì)照品，革蘭陽性菌上下游引物引物序列分別為seqidno.5和seqidno.6，革蘭陰性菌的上下游引物序列分別為seqidno.7和seqidno.8。

優(yōu)選的，本發(fā)明，通過紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，并將其最終稀釋到10⁸copies/μl。

優(yōu)選的，本發(fā)明，陰性對(duì)照管包含高溫壓滅的焦碳酸二乙脂處理水。

優(yōu)選的，本發(fā)明，試劑盒檢測體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，待測樣品5μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為100-1000nm，探針濃度為50-500nm。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述待測樣品為樣本核酸提取液體及陽性對(duì)照品。

本發(fā)明的pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃15s；60℃1min,40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明樣本核酸提取液來自新生兒血液。

本發(fā)明提供的熒光宣試劑盒需保存于-20℃條件下，熒光檢測體系混合液需避光保存。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于快速檢測新生兒敗血癥。本試劑盒法靈敏度高、特異性好，能夠檢測到最低濃度為10copies/μl數(shù)量級(jí)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，能夠特異性識(shí)別新生兒敗血癥并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。

附圖說明

附圖1為本試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖2為陽性革蘭菌及陰性革蘭菌的特異性擴(kuò)增結(jié)果。

附圖3為本試劑盒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果。

附圖4為本試劑盒的檢測范圍測試，從左到右依次為10⁶、10⁵、10³、10²、10copies/μl。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)方案容易理解，結(jié)合下面實(shí)施案例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施案例進(jìn)行解釋，當(dāng)不限定本發(fā)明的具體使用范圍。

實(shí)施例1：陽性標(biāo)準(zhǔn)品的獲得及檢測分析

參見圖1，一種新型新生兒敗血癥快速檢測試劑盒，由1、熒光檢測反應(yīng)板，2、rt-pcr酶混合液管，3、陰性對(duì)照管，4、陽性對(duì)照管(革蘭陽性)，5、陽性對(duì)照管(革蘭陰性)及6、盒體組成。其中反應(yīng)板裝有熒光檢測體系混合液，陽性對(duì)照管中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品按如下步驟制備：

以革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌及革蘭陰性菌大腸埃希菌為模板進(jìn)行普通rt-pcr擴(kuò)增。如圖2所示，3株金黃色葡萄球菌擴(kuò)增后，均獲得920bp產(chǎn)物。另外3株菌大腸埃希菌擴(kuò)增后，均獲得353bp產(chǎn)物。

將目的電泳條帶回收，連接到克隆質(zhì)粒載體，并以陽性重組質(zhì)粒做為陽性對(duì)照品。通過紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，并將其最終稀釋到10⁸copies/μl。

建立擴(kuò)增體系，具體擴(kuò)增體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，陽性重組質(zhì)粒2μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為400nm，探針濃度為250nm。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃15s；60℃1min,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，擴(kuò)增片段在預(yù)期范圍內(nèi)，且引物的特異性良好。

實(shí)施例2：試劑盒的檢測范圍檢測

分別以1-10⁶copies/μl濃度梯度的質(zhì)粒為模板做多重?zé)晒鈘t-pcr，測試所建立體系的可行性，試劑盒檢測體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，陽性重組質(zhì)粒2μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為400nm，探針濃度為250nm。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃15s；60℃1min,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出,試劑盒的最低檢測濃度為10copies/μl,檢測的的靈敏度高，體系表現(xiàn)良好。

實(shí)施例3：試劑盒重復(fù)性及敏感性分析

選取經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的稀釋品分別為100cfu、50cfu、10cfu、5cfu、1cfu和0cfu的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌進(jìn)行雙重?zé)晒舛縫cr檢測，每個(gè)濃度檢測6個(gè)平行樣，3次重復(fù)，分析檢測結(jié)果的重復(fù)性(cv值)。試劑盒檢測體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，待測樣品為2μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為400nm，探針濃度為250nm。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃15s；60℃1min,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如下表所示。

由上表可知，雙重實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測濃度100cfu、50cfu、10cfu、5cfu、1cfu和0cfu的樣品，組內(nèi)、組間變異系數(shù)均不到1.5％，可這說明本試劑盒對(duì)具有良好的重復(fù)性。

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