本發(fā)明屬于海洋化工工程技術(shù)，具體涉及一種海洋生物多糖銅復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅制劑由于其價(jià)格低廉、使用方法簡單、不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于農(nóng)用殺菌劑方面。其主要分為無機(jī)和有機(jī)兩種類型。依靠釋放出銅離子與病菌體內(nèi)蛋白質(zhì)中的-sh、-nh2、-cooh、-oh等基團(tuán)起作用，導(dǎo)致病菌死亡。但傳統(tǒng)銅制劑使用不當(dāng)極易產(chǎn)生藥害并誘發(fā)螨類的爆發(fā)。因此，銅離子的含量和釋放能力是決定銅制劑殺菌防病效果的主要因素，同時(shí)也是決定其對(duì)作物安全性高低的重要因素。

殼聚糖是一種可再生、無毒、生物相容性和降解性良好的海洋氨基多糖。殼聚糖對(duì)多種植物病原真菌均有抑制作用，在農(nóng)業(yè)中可以作為土壤改良劑防治土傳病害，用作種衣劑防治種傳病害、果蔬保鮮控制采后病害等，將其開發(fā)為新型海洋生物源農(nóng)藥，無疑具有廣闊的應(yīng)用前景。然而殼聚糖作為單一活性組分直接使用存在藥效較差、用量大、成本高等問題，因而推廣困難。

氨基吡啶類席夫堿作為天然氨基酸的類似物,其合成方法和生物活性受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注,而其多變的結(jié)構(gòu)類型又為不斷合成新化合物奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問題，提供了一種海洋生物多糖銅復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為：1.一種海洋生物多糖銅復(fù)合物，其特征在于：復(fù)合物如式i所示，

式i中，r為氫、甲基、氯或三氟甲基；n＝4-4000。

一種海洋生物多糖銅復(fù)合物的制備方法：

1)將氨基吡啶溶于過量的溶劑中，而后再加入乙酰丙酮在加熱回流下進(jìn)行反應(yīng)生成單季胺配體；其中，氨基吡啶與乙酰丙酮的摩爾比為1:1-3；

2)全脫乙酰殼聚糖溶于過量的溶劑中，而后再加入步驟1)的單季胺配體在酸催化的條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)物與氯乙酸反應(yīng)生成o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物；

3)將上述獲得o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物溶于過量溶劑中，再加入一水乙酸銅在60-80℃攪拌下反應(yīng)即得式i所示復(fù)合物o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿銅復(fù)合物；其中，o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物與一水乙酸銅的質(zhì)量比為1:3-5。

所述步驟1)氨基吡啶溶于溶劑中，而后再加入乙酰丙酮在60-80℃回流下反應(yīng)6-12小時(shí)生成單季胺配體；其中，溶劑的體積與氨基吡啶質(zhì)量比為10-100:1；所述氨基吡啶為2-氨基吡啶、2-氨基-5-甲基吡啶、2-氨基-5-氯吡啶或2-氨基-5-三氟甲基吡啶；溶劑為甲醇和/或乙醇。

所述步驟2)全脫乙酰殼聚糖溶于過量的溶劑中，而后再加入步驟1)的單季胺配體在60-80℃、酸催化的條件下反應(yīng)12-18小時(shí)生成殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物，反應(yīng)物與氯乙酸在60-80℃6-12小時(shí)反應(yīng)，產(chǎn)物加入乙醇沉淀，過濾，濾餅用溶劑洗滌，在50-60℃下進(jìn)行干燥，即得o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物；其中，溶劑的體積與全脫乙酰殼聚糖質(zhì)量比為50-300:1；全脫乙酰殼聚糖的質(zhì)量與單季胺配體的質(zhì)量比為1:4-10；全脫乙酰殼聚糖的質(zhì)量與氯乙酸的質(zhì)量比為1:5-10；所述的酸催化劑為甲酸、乙酸、丙酸中的一種或幾種；溶劑為甲醇、乙醇、水中的一種或幾種。

所述步驟3)將上述獲得o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物溶于過量溶劑中，再加入一水乙酸銅在60-80℃攪拌下反應(yīng)6-12小時(shí)反應(yīng)后過濾，濾餅用溶劑洗滌，在50-60℃下進(jìn)行干燥，即得式i所示復(fù)合物o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿銅復(fù)合物衍生物；其中，溶劑的體積與o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物質(zhì)量比為100-300:1。

所述殼聚糖分子量為130萬。用于洗滌溶劑為乙醇或甲醇。

一種海洋生物多糖銅復(fù)合物的應(yīng)用，所述式i所示復(fù)合物用于制備農(nóng)用殺菌劑中的應(yīng)用。

所述式i所示復(fù)合物用于制備農(nóng)用真菌殺菌劑中的應(yīng)用。

原理：殼聚糖結(jié)構(gòu)中含有-nh2，可與單季胺配體發(fā)生席夫堿反應(yīng)在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入氨基吡啶，再用席夫堿中電子密度高的碳原子配位銅離子，進(jìn)而與殼聚糖產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高衍生物的生物活性。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明復(fù)合物殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入氨基吡啶基團(tuán)與銅離子，當(dāng)只引入氨基吡啶的話抑菌活性遠(yuǎn)不及復(fù)合物，同時(shí)只引入銅離子的產(chǎn)物不溶解于水，無法使用；只有同時(shí)引入三者才產(chǎn)生協(xié)同增效作用，顯著提高了殼聚糖的抑菌活性。

2.本發(fā)明制備的o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿銅復(fù)合物具有良好的溶解性，可溶于多種溶劑，在提高抑菌效果的同時(shí)還避免了重金屬離子在土壤中殘留，擴(kuò)大了其應(yīng)用領(lǐng)域，在農(nóng)藥領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為全脫乙酰殼聚糖的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1588,1069。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物1的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3324,2934,1732,1576,1397,1053。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物2的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3311,2934,1732,1568,1398,1053。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物3的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3244,2934,1732,1576,1397,1053。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物4的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3244,2934,1733,1577,1396,1050。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例。

本發(fā)明中氨基吡啶與乙酰丙酮發(fā)生反應(yīng)生成單季胺配體，單季胺配體與全脫乙酰殼聚糖c2位上的-nh2發(fā)生反應(yīng)生成殼聚糖席夫堿，之后與氯乙酸發(fā)生反應(yīng)生成o-羧甲基殼聚糖衍生物，該殼聚糖衍生物上共軛體系中的碳與乙酸銅的銅離子配位生成o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物，所得的衍生物經(jīng)紅外光譜分析確定其結(jié)構(gòu)，殼聚糖與接入的基團(tuán)有效地結(jié)合生成o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶類席夫堿銅復(fù)合物衍生物。

本發(fā)明采用活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理，將氨基吡啶類席夫堿衍生物的生物活性基團(tuán)引入到天然產(chǎn)物殼聚糖骨架中，利用分子中的氨基絡(luò)合銅離子，制備出抑菌和誘導(dǎo)抗病活性均提高的新型殼聚糖衍生物，為開發(fā)新型生物農(nóng)藥的開辟了新途徑。

實(shí)施例1衍生物1的制備

將4.7克2-氨基吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬的殼聚糖加入到60ml無水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；2.5克單季胺配體加入到50ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.06克cu(oac)2·h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸銅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，離心，無水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深綠色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物1，結(jié)構(gòu)見通式i(r為氫；n＝4-4000)。殼聚糖席夫堿的制備可參考以下文獻(xiàn)：

zhanyongguo,r.x.,songliu,zhimeizhong,xiaji,linwang,pengchengli(2007)."antifungalpropertiesofschiffbasesofchitosan,n-substitutedchitosanandquaternizedchitosan."carbohydrateresearch342(10):1329-1332.

紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物1的紅外譜圖(圖2)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1396cm^-1為c-n的特征吸收峰；1576cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物1合成成功。

實(shí)施例2衍生物2的制備

將5.4克2-氨基-5-甲基吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬的殼聚糖加入到60ml無水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；2.7克單季胺配體加入到50ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.06克cu(oac)2·h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸銅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，離心，無水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深綠色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物2，結(jié)構(gòu)見通式i(r為甲基；n＝4-4000)。紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物2的紅外譜圖(圖3)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1398cm^-1c-n的特征吸收峰；1568cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物2合成成功。

實(shí)施例3衍生物3的制備

將6.4克2-氨基-5-氯吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬的殼聚糖加入到60ml無水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；2.9克單季胺配體加入到50ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.06克cu(oac)2·h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸銅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，離心，無水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深綠色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物3，結(jié)構(gòu)見通式i(r為氯；n＝4-4000)。紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物3的紅外譜圖(圖4)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1397cm^-1c-n的特征吸收峰；1576cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物3合成成功。

實(shí)施例4衍生物4的制備

將8.1克2-氨基-5-三氟甲基吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬的殼聚糖加入到60ml無水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；3.4克單季胺配體加入到50ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.06克cu(oac)2·h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸銅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無水乙醇沉淀，離心，無水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深綠色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物4，結(jié)構(gòu)見通式i(r為三氟甲基；n＝4-4000)。紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖銅復(fù)合物衍生物4的紅外譜圖(圖5)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1396cm^-1c-n的特征吸收峰；1577cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物4合成成功。

抑菌活性測(cè)定

采用生長速率法測(cè)定樣品對(duì)辣椒疫霉病原菌、黑白輪枝孢病原菌以及立枯絲核病原菌的抑菌活性。測(cè)試在2個(gè)樣品濃度下即：200μg/ml，400μg/ml對(duì)辣椒疫霉、黑白輪枝孢及立枯絲核菌的抑制效果。

實(shí)驗(yàn)以相同濃度的噻菌銅藥劑(市售為20％的懸浮劑)為陽性對(duì)照，以蒸餾水為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)基均勻倒入1個(gè)直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為5mm的菌餅。在27℃下培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算樣品的抑菌率。每次處理設(shè)置1個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種3個(gè)菌落，對(duì)每個(gè)菌落測(cè)定最大直徑(dmax)和最小直徑(dmin)，取平均值為樣品抑菌圈直徑d樣品，全部試驗(yàn)重復(fù)一次。根據(jù)下式計(jì)算抑菌率(參見表1)。

抑菌率(％)＝(d空白－d樣品)/(d空白－5)×100

表1部分通式1殼聚糖衍生物對(duì)辣椒疫霉、黑白輪枝孢及立枯絲核菌的抑制活性

由上述表1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶類席夫堿銅復(fù)合物衍生物高濃度下對(duì)辣椒疫霉、黑白輪枝孢及立枯絲核菌普遍具有良好的抑菌效果，好于現(xiàn)在已有的堿式硫酸銅產(chǎn)品，與喹啉銅產(chǎn)品相仿。