本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術領域，特別涉及一種中性蛋白酶從牛跟腱中提取膠原的方法。

背景技術：

膠原種類較多，常見類型為ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和?型，膠原因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，而廣泛應用于食品、保健品、醫(yī)用生物材料、組織工程、化妝品等領域。在醫(yī)學領域中，膠原由于具有低免疫原性、纖維的再形成性、機械性能高和生物可降解性等優(yōu)點，先后制成了醫(yī)用膠原海綿、膜性生物補片、人工皮膚等。膠原中的ⅰ型膠原是普遍存在于生物體內的，約占生物體膠原總量的90%，占總蛋白質量的20%，廣泛分布在肌腱、韌帶、角膜、骨、皮膚等組織中，對維持這些結締組織的機械強度和生物學功能起關鍵作用。

在空間結構上，膠原顯示出特殊的三螺旋結構，三條相互獨立的肽鏈依靠甘氨酸之間形成的氫鍵維系三股螺旋相互纏繞的結構。膠原這種特殊的三股螺旋結構保證了它的機械強度。膠原纖維是膠原行使生理作用的基本形態(tài)，在生物體內膠原纖維交織成富有機械強度和彈性的網(wǎng)狀結構成為結締組織最基本的組成成分。

目前膠原提取方法主要為機械破碎待提取原料，蛋白酶在酸環(huán)境下酶解得到目的膠原，此類方法在制備過程多數(shù)三螺旋被打斷成單鏈，并且在酶解過程容易出現(xiàn)酶切位點無選擇性從而不受控的現(xiàn)象。因此需要一種能在不破壞膠原固有三螺旋結構的情況下，有效去除膠原纖維非螺旋結構的末端肽的制備提取方法。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種中性蛋白酶提取膠原的方法，能夠保證完整的三股螺旋結構的情況下去除末端肽，且通過此方法制備的膠原能配制多種使用要求的膠原液。技術方案如下：

本發(fā)明提供了一種中性蛋白酶提取膠原的方法，包括以下步驟，

先對牛跟腱進行切片；

再將切片清洗浸泡在0.1%~40%的鹽溶液中，浸泡0.5~24h。瀝去多余水分。

浸泡在中性蛋白酶酶解液中，酶解液為中性蛋白酶：磷酸鹽緩沖液按1:5~1:20000（w/v）配制而成，酶解液ph在2~8之間。4~50℃環(huán)境下反應1~72h；

將酶解后的反應物離心，取上清液，用摩爾濃度為0.01~5.0mol/l堿溶液調ph至7~12，在2~8℃環(huán)境下保持2~48h，最后用摩爾濃度為0.01~5.0mol/l的酸溶液調節(jié)ph值至4~7，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述中性蛋白酶為半胱氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶的質量分數(shù)為0.05%~0.2%。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述磷酸鹽緩沖溶液的ph值為2~8，磷酸根的摩爾濃度為0.001~0.5mol/l。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述鹽溶液的總質量，所述鹽的質量分數(shù)為0.1%~40%。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述鹽溶液中的鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀中的至少一種。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述堿溶液的溶質摩爾濃度為0.01~5.0mol/l。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述堿溶液中的溶質為氫氧化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉中的一種或幾種。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述酸溶液的溶質摩爾濃度為0.01~5.0mol/l。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述酸溶液中的溶質為鹽酸、硫酸、冰醋酸、檸檬酸中的一種或幾種。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，在對牛跟腱進行膠原提取之前，先對所述牛跟腱進行預處理；所述預處理為用水對牛跟腱進行反復沖洗，之后切片，再用質量分數(shù)為0.05%~20%醋酸氯己定溶液浸泡0.5~24h，再用水反復沖洗。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述切片為冷凍切片。

附圖說明

圖1為本實施例1所提取膠原蛋白的紅外圖譜。

具體實施方式

需要說明的是，本發(fā)明所使用的水均為醫(yī)藥行業(yè)所用的純化水或注射用水，滿足藥典標準。

試劑和儀器

試劑均市售可得。

實施例1

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.9%的氯化鈉溶液中，浸泡2h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:150稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為4。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，4℃環(huán)境下反應72h。

用摩爾濃度為2.0mol/l氫氧化鈉溶液調ph至10±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持10h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至5±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例2

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡16min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在15%的硫酸鈉溶液中，浸泡4h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:100稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為4。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，37℃環(huán)境下反應1h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速5000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為1.0mol/l氫氧化鈉溶液調ph至9±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持24h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至6±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例3

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡2h，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在15%的硫酸鈉溶液中，浸泡4h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:200稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.002mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為3。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，40℃環(huán)境下反應0.5h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速4000rp/min,時間30min。取上清液。

用摩爾濃度為0.5mol/l碳酸鈉溶液調ph至8±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持24h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至4±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例4

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.7%的氯化鈉溶液中，浸泡2h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:150稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為2.5。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，4℃環(huán)境下反應48h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速6000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為0.5mol/l氫氧化鈉溶液調ph至8±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持2h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至6±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例5

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.7%的氯化鉀溶液中，浸泡2h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:150稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為6.0。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，25℃環(huán)境下反應24h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速8000rp/min,時間15min。取沉淀，鹽溶液分散。

用摩爾濃度為0.5mol/l氫氧化鈉溶液調ph至10±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持2h。

最后用摩爾濃度為0.01mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至5±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例6

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.7%的氯化鈉溶液中，浸泡2h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:150稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為5。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，30℃環(huán)境下反應72h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速6000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為0.5mol/l氫氧化鈉溶液調ph至8±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持2h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的硫酸溶液調節(jié)ph值至6±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例7

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡6h，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.85%的氯化鈉溶液中，浸泡15h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:160稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為6。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，4℃環(huán)境下反應72h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速6000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為0.5mol/l碳酸氫鈉溶液調ph至10±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持12h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至4.5±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例8

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.9%的氯化鈣溶液中，浸泡2h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:150稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為2.5。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，4℃環(huán)境下反應48h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速6000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為0.5mol/l氫氧化鈉溶液調ph至9±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持12h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至7±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例9

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在20%的氯化鈉溶液中，浸泡2h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:50稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為3.5。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，15℃環(huán)境下反應48h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速6000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為0.05mol/l檸檬酸鈉溶液調ph至8±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持24h。

最后用摩爾濃度為0.01mol/l的硫酸溶液調節(jié)ph值至5±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

實施例10

選取新鮮的牛跟腱組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除筋膜、脂肪等非牛跟腱纖維組織，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；

稱取100g牛跟腱切片，浸泡在0.1%的醋酸氯己定溶液中浸泡5h，純化水浸泡清洗5次，清洗至纖維全部外露，瀝去多余水分備用。清洗后的牛跟腱切片，浸泡在0.85%的氯化鈉溶液中，浸泡5h。瀝去多余水分。

配制酶解液，按1:200稱取半胱氨酸蛋白酶，溶解到摩爾濃度為0.05mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液ph為2.5。

將侵泡好的牛跟腱纖維倒入酶解液中，攪拌分散，4℃環(huán)境下反應48h。

將酶解結束后的反應物離心，轉速6000rp/min,時間15min。取上清液。

用摩爾濃度為2mol/l氫氧化鈉溶液調ph至8±0.2，在2~8℃環(huán)境下保持2h。

最后用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調節(jié)ph值至6±0.2，收集產(chǎn)物，清潔水浸泡清洗至鹽的酸根離子滿足標準要求，脫水處理，獲得膠原。

以上所述僅是為了便于本領域的技術人員理解本發(fā)明的技術方案，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。