本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體來說是一種用于檢測tnf-a基因snp位點rs1799724基因型的擴增引物、試劑盒、方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,as)是一種常見的慢性炎癥性風(fēng)濕性疾病，主要侵犯人體中軸骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)以及外周大關(guān)節(jié)，特征性病理改變是肌腱和韌帶附著點的慢性炎癥，多見于10～40歲的青壯年，20-30歲為發(fā)病高峰。一般男性發(fā)病較早，病情較重，是導(dǎo)致青壯年致殘和喪失勞動力的重要病因之一。

研究表明tnf-α基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于基因上游-863位點至-857位點之間，在此區(qū)域單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)差異可能與tnf-α基本表達相關(guān)，而tnf-α基因表達可能與tnf-α拮抗劑的治療的有效性相關(guān)。已有研究表明rs1799724(-857c/t)單核苷酸多態(tài)性與as有顯著關(guān)聯(lián),-857t是中國南方人群as發(fā)病的危險因素，-857tt純合子較ct雜合子對tnf-a拮抗劑6周治療后的as病人的炎癥指標、basfi改善更顯著，因此，有效的確定tnf-a基因snp位點rs1799724基因型很有必要。

近年來，隨著tnf–α拮抗劑在臨床上的應(yīng)用，可使臨床癥得到as狀迅速緩解，然而此類制劑費用昂貴，部分患者初次治療，臨床療效不佳甚至無反應(yīng)，而且接受治療的患者有出現(xiàn)結(jié)核、真菌、細菌感染等并發(fā)癥的風(fēng)險。因此，尋找能預(yù)測as患者對tnf-α拮抗劑治療有效性的標志物顯得十分重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述提出問題，本發(fā)明提供一種如下的技術(shù)方案：

一種用于檢測tnf-a基因snp位點rs1799724基因型的擴增引物，所述的擴增引物的序列為：

正向引物primer-f：cagcaatgggtaggaga；

反向引物primer-r：cttctcagggccccag。

一種用于檢測tnf-a基因snp位點rs1799724基因型的試劑盒，所述的試劑盒包括有上述的引物對和特異探針，所述的特異探針序列probe-c：ccccttaacgaagacag，序列5’段使用fam標記，3’端用mgb標記；特異探針序列probe-t:ccccttaatgaagacag,序列5’段使用vic標記，3’端用mgb標記。

一種檢測tnf-a基因snp位點rs1799724基因型的方法，所述的方法包括如下步驟：

1)、提取待測樣本的外周血基因組dna；

2)、pcr擴增：所使用的擴增引物序列為：正向引物primer-f：cagcaatgggtaggaga，反向引物primer-r：cttctcagggccccag；特異探針序列probe-c：ccccttaacgaagacag，其中序列5’段使用fam標記，3’端用mgb標記，特異探針序列probe-t:ccccttaatgaagacag,其中序列5’段使用vic標記，3’端用mgb標記；

pcr擴增反應(yīng)組分：

擴增程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，58℃退火20s；65℃延伸40s；40個循環(huán)；

4)、熒光信號的收集：選擇fam和vic，數(shù)據(jù)的采集定在65℃；

5)、通過收集的fam和vic的熒光信號進行結(jié)果分析，對基因型進行判定。

進一步的，步驟5)中的判定方法為：進行allelicdiscrimination(等位基因的檢測)分析，x軸為allele1信號,y軸為allele2，進行散點圖判讀：

如果位置靠近x軸，判讀為cc樣品為cc型；

如果位置靠近y軸，判讀為tt樣品為tt型；

如果位置靠近對角線，判讀為ct樣品為ct型。

進一步的，步驟5)中的判定方法為采用曲線分析判讀：

如果只有一條擴增曲線，判讀為cc或者tt型；

如果有2條擴增曲線，判讀為ct樣品為ct型；

如果無擴增曲線，樣本基因型無法判讀，需要重新檢測。

一種檢測tnf-a基因snp位點rs1799724基因型的應(yīng)用，通過檢測tnf-a基因snp位點rs1799724基因型預(yù)測as患者對tnf-α拮抗劑的治療有效性。

本發(fā)明的有益效果在于：創(chuàng)新性地檢測tnf-a基因snp位點rs1799724(-857c/t)基因型，使用熒光定量pcr技術(shù)，對tnf-a基因的rs1799724突變位點，設(shè)計pcr引物和探針進行基因型檢測，靈敏度高，特異性好，檢測迅速；利用標記熒光的探針能和模板特異性結(jié)合，根據(jù)特異結(jié)合的探針類型，pcr反應(yīng)時可以產(chǎn)生對應(yīng)的熒光信號的原理，通過熒光信號類型分辨不同樣本的基因型，應(yīng)用本發(fā)明對tnf-a基因snp位點rs1799724基因型的分型與測序結(jié)果完全一致，能夠用于as患者tnf-a拮抗劑治療效果的預(yù)測。

附圖說明

圖1為rs1799724基因分型散點圖結(jié)果判讀模式；

圖2為rs1799724基因分型擴增曲線結(jié)果判讀模式。

具體實施方式

一、樣本dna提取質(zhì)檢

使用常規(guī)的血液dna提取試劑盒進行樣本提?。簶颖緷M足10-100ng/μl、純度od260/280＝1.7-2.0。

二、pcr擴增

所使用的擴增引物序列為：正向引物primer-f：cagcaatgggtaggaga；反向引物primer-r：cttctcagggccccag。特異探針序列probe-c：ccccttaacgaagacag，序列5’段使用fam標記，3’端用mgb標記；特異探針序列probe-t:ccccttaatgaagacag,序列5’段使用vic標記，3’端用mgb標記。

pcr擴增反應(yīng)組分：

3.pcr擴增(在pcr擴增區(qū)進行)

將上述20μlpcr反應(yīng)管放入熒光定量pcr儀(abi7500)中，設(shè)置擴增程序如下：

熒光信號的收集選擇fam和vic，數(shù)據(jù)的采集定在65℃。

三、檢測結(jié)果的解釋

擴增反應(yīng)完成后，通過收集的fam和vic的熒光信號進行結(jié)果分析，abi熒光pcr儀進行allelicdiscrimination分析，x軸為allele1信號,y軸為allele2。

請參照圖1，以下以allele1是設(shè)置為fam(代表基因c)，allele2是設(shè)置為vic(代表基因t)為例分析。按照上述設(shè)置在基因分型散點圖中，cc型樣本聚集在靠近x軸位置，tt型樣本聚集在靠近y軸位置，ct型樣本聚集在x和y軸靠近對角線位置，陰性對照靠近原點。

(1)、散點圖判讀

1.位置靠近x軸，結(jié)果判讀為cc樣品為cc型(純和突變)；

2.位置靠近y軸，結(jié)果判讀為tt樣品為tt型(野生型)；

3.位置靠近對角線，結(jié)果判讀為ct樣品為ct型(雜合突變)；

(2)、amplificationplot模式判讀

如果只有一條擴增曲線，根據(jù)設(shè)置的allele，結(jié)果判讀為cc或者tt型(純合樣本)；如果有2條擴增曲線，結(jié)果判讀為ct樣品為ct型(雜合突變)；如果無擴增曲線，樣本基因型無法判讀，需要重新檢測(圖2為組合圖)。