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      一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的組合物及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):12300233閱讀:571來源:國(guó)知局

      本發(fā)明屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的技術(shù)。



      背景技術(shù):

      結(jié)直腸癌(colorectalcancer,crc)發(fā)生的遺傳因素包括染色體不穩(wěn)定性(chromosomeinstability,cin)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability,msi)。約80-85%的crc由cin引起,包括家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis,fap)(apc基因胚系突變)和散發(fā)性crc(apc、p53、dcc、kras等基因突變);而另外15-20%的crc則主要是由msi引起,包括遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer,hnpcc,又稱lynch綜合征)(錯(cuò)配修復(fù)基因胚系突變)和散發(fā)性msi(+)crc(錯(cuò)配修復(fù)基因mlh1基因啟動(dòng)子甲基化)。

      微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatalliteinstability,msi)表現(xiàn)為同一微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同個(gè)體之間以及同一個(gè)體的正常組織與某些異常組織之間,微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單位的數(shù)目不同。近年來的大量研究表明:msi與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),如結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等。尤其是結(jié)直腸癌,臨床上已將msi作為結(jié)直腸癌預(yù)后和制定輔助治療方案的重要分子標(biāo)志物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大約15%的結(jié)直腸癌中存在msi現(xiàn)象,與無(wú)msi的結(jié)直腸癌相比,攜帶有msi-h的ii期結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好,但從5-fu輔助化療獲益較少。

      lynch綜合征,亦稱遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hnpcc),是由mmr基因胚系突變所致的顯性遺傳病。90%以上的lynch綜合征具有msi特征,而散發(fā)性結(jié)直腸癌中只有約15%,所以臨床上可用msi檢測(cè)來進(jìn)行l(wèi)ynch綜合征的篩查。

      2015年在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表的nct01876511研究結(jié)果表明,pd-1單抗治療對(duì)msi-h的mcrc表現(xiàn)出高緩解率,因此pembro單抗治療msi-h的mcrc獲得fda突破性療法認(rèn)定。2016年asco年會(huì)上發(fā)布的checkmate-142,ⅱ期研究的數(shù)據(jù)表明,msi-h的mcrc患者不僅可從pd-1免疫治療獲益,而且對(duì)pd-1和ctla-4聯(lián)合治療的臨床活性和生存期都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了單獨(dú)使用pd-1的療效。2017年5月23日,美國(guó)fda批準(zhǔn)了默沙東公司的“明星”pd-1抗體pembrolizumab(商品名:keytruda)用于治療攜帶一種特定基因特征的任何一種實(shí)體瘤,具體來說,keytruda被批準(zhǔn)用于治療攜帶“msi-h/dmmr亞型”的成人和兒童實(shí)體瘤患者。

      1997年,nci推薦使用bat26、bat25、d5s346、d2s123和d17s2505個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)腫瘤,若其中2個(gè)或2個(gè)以上位點(diǎn)有改變則為高頻率msi(msi-h),有1個(gè)位點(diǎn)改變則為低頻率msi(msi-l),沒有改變則稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定(mss)。在2002年nci研討會(huì)中,由于雙核苷酸d5s346、d2s123和d17s250位點(diǎn)的靈敏度和特異性檢測(cè)受限、均低于單核苷酸,修改了msi檢測(cè)指南,主要推薦使用更多的單核苷酸進(jìn)行檢測(cè)(在雙核苷酸不穩(wěn)定情況下)。目前研究報(bào)道,檢測(cè)的單核苷酸位點(diǎn)有bat26、bat25、nr-21、nr-24、nr-27、mono-27,雙核苷酸位點(diǎn)有d5s346、d2s123和d17s250。

      因此,微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)對(duì)于結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)價(jià)及化療反應(yīng)性有重要意義。而目前檢測(cè)msi的核苷酸引物及方法敏感性和特異性較低,難以在臨床廣泛應(yīng)用。所以探索一種檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性快速可靠的核苷酸引物組及方法已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問題。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的組合物及其應(yīng)用,通過調(diào)整12對(duì)引物的配比、taq酶的用量和鎂離子的用量等,將12對(duì)引物放置到一管內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),只需檢測(cè)一次并可同時(shí)檢測(cè)出12個(gè)位點(diǎn)的分布情況。進(jìn)一步通過上述體系的調(diào)整,提高整個(gè)試劑盒的敏感性和特異性,敏感性和特異性分別能夠達(dá)到95%和100%,解決了以往檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性時(shí)敏感性和特異性較低的問題。

      為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的組合物,所述組合物包括分別針對(duì)用于檢測(cè)待檢樣品中與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)的特異性目的基因的引物對(duì),包括:

      nr-21基因正向引物f(nr-21-f):fam-gaagacacatcccttt,

      nr-21基因反向引物r(nr-21-r):cgcattcacactttc;

      nr-27基因正向引物f(nr-27-f):fam-agggggtggagattgc,

      nr-27基因反向引物r(nr-27-r):catagggcaagcagaaa;

      pentad基因正向引物f(pentad-f):fam-agttcctgtctctctgcca,

      pentad基因反向引物r(pentad-r):gctgtagccttttgcc;

      d5s346基因正向引物f(d5s346-f):fam-gcagttagttagttagtt,

      d5s346基因反向引物r(d5s346-r):agtttatagcagataagacag;

      bat-25基因正向引物f(bat-25-f):hex-gcaaagggcatggc,

      bat-25基因反向引物r(bat-25-r):gcttttaactatggctct;

      bat-26基因正向引物f(bat-26-f):hex-tcagccagtatatgaaattg,

      bat-26基因反向引物r(bat-26-r):agctcctttctaagccttct;

      pentac基因正向引物f(pentac-f):hex-agcagaggttttctaaata,

      pentac基因反向引物r(pentac-r):aagtcgtctttggacagg;

      d2s123基因正向引物f(d2s123-f):hex-gacaaaaacaggatgcct,

      d2s123基因反向引物r(d2s123-r):gggactttccacctatgggac;

      mono-27基因正向引物f(mono-27-f):tmr-gtgggagacagagca,

      mono-27基因反向引物r(mono-27-r):tggccaactaaaaaagaa;

      nr-24基因正向引物f(nr-24-f):tmr-aattttacctcctgactccaa,

      nr-24基因反向引物r(nr-24-r):caacctgggtgacagagt;

      amel基因正向引物f(amel-f):tmr-ggcgcgcgacaccgcag,

      amel基因反向引物r(amel-r):ccctttctcaagggaacc;

      d17s250基因正向引物f(d17s250-f):tmr-catacataaactttcaaat,

      d17s250基因反向引物r(d17s250-r):ggtttaaatatatatatggc。

      優(yōu)選地,對(duì)nr-21基因、nr-27基因、pentad基因和d5s346基因的正向引物的5’端進(jìn)行fam修飾;對(duì)bat-25基因、bat-26基因、pentac基因和d2s123基因的正向引物的5’端進(jìn)行hex修飾;對(duì)mono-27基因、nr-24基因、amel基因和d17s250基因的正向引物的5’端進(jìn)行tmr修飾;實(shí)現(xiàn)一管內(nèi)多重?zé)晒馕稽c(diǎn)的檢測(cè)。

      優(yōu)選地,進(jìn)行一次檢測(cè)時(shí),nr-21-f加入量0.1-0.3μl,nr-21-r加入量0.1-0.3μl,nr-27-f加入量0.01-0.2μl,nr-27-r加入量0.01-0.2μl,pentad-f加入量0.1-0.3μl,pentad-r加入量0.1-0.3μl,d5s346-f加入量0.01-0.2μl,d5s346-r加入量0.01-0.2μl,bat-25-f加入量0.1-0.3μl,bat-25-r加入量0.1-0.3μl,bat-26-f加入量0.1-0.3μl,bat-26-r加入量0.1-0.3μl,pentac-f加入量0.01-0.2μl,pentac-r加入量0.01-0.2μl,d2s123-f加入量0.1-0.3μl,d2s123-r加入量0.1-0.3μl,mono-27-f加入量0.01-0.2μl,mono-27-r加入量0.01-0.2μl,nr-24-f加入量0.01-0.2μl,nr-24-r加入量0.01-0.2μl,amel-f加入量0.1-0.3μl,amel-r加入量0.1-0.3μl,d17s250-f加入量0.01-0.2μl,d17s250-r加入量0.01-0.2μl。

      本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的試劑盒,所述試劑盒包括以上所述的用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的組合物。

      優(yōu)選地,所述試劑盒包括dna聚合酶(taq酶)、dntps、10×dna聚合酶buffer、udg酶和mg2+,進(jìn)行一次檢測(cè)時(shí),dna聚合酶加入量0.1-0.4μl,dntps加入量1-3μl,10×dna聚合酶buffer加入量1-4μl,udg酶加入量0.01-0.2μl,mg2+加入量2-5μl。

      本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的試劑盒的樣本處理方法,所述樣本處理方法包括:

      (1)提取樣本,提取對(duì)照樣本和檢測(cè)樣本,其中對(duì)照樣本可以選用全血樣本,檢測(cè)樣本可以選用石蠟包埋腫瘤組織樣本基因組dna;

      (2)將提取之后的樣本進(jìn)行濃度測(cè)定,并將濃度稀釋至10-20ng/μl后,進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng);

      (3)根據(jù)pcr反應(yīng)之后的結(jié)果分析:讀取對(duì)照樣本和檢測(cè)樣本中12個(gè)目的基因位點(diǎn)的片段分布情況,進(jìn)而判斷檢測(cè)樣本是否出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)。

      優(yōu)選地,pcr反應(yīng)過程為:37℃下udg酶反應(yīng)2min,95℃預(yù)變性3min,94℃變性15s,60℃退火延伸45s,45個(gè)循環(huán)。

      本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的組合物及其應(yīng)用,具有如下有益效果:

      本發(fā)明綜合檢測(cè)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)bat26、bat25、nr-21、nr-24、nr-27、mono-27和雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)d5s346、d2s123、d17s250,提高試劑盒的檢測(cè)特異性和靈敏度。并再此檢測(cè)基礎(chǔ)上,本試劑盒增加五核苷酸重復(fù)多態(tài)性pentac和pentad以及性別決定位點(diǎn)amel的檢測(cè),旨在監(jiān)測(cè)樣本檢測(cè)過程中是否出現(xiàn)污染情況。本試劑盒提高了檢測(cè)位點(diǎn)的全面性,同時(shí)增加了監(jiān)測(cè)樣本污染過程,進(jìn)一步提高試劑盒檢測(cè)穩(wěn)定性和可靠性。

      本發(fā)明采用這種技術(shù)進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè),操作簡(jiǎn)便、易于判讀,對(duì)儀器的要求不高,并且整個(gè)pcr過程采用全封閉形式,避免了交叉污染的可能,使結(jié)果更加精準(zhǔn)。

      基于多重?zé)晒鈖cr片段分析毛細(xì)管電泳法進(jìn)行一管法檢測(cè),即通過一管可以同時(shí)檢測(cè)幾種甚至十幾個(gè)位點(diǎn),提高檢測(cè)的簡(jiǎn)便性,進(jìn)而達(dá)到將目的位點(diǎn)精準(zhǔn)有效的檢測(cè)。

      本發(fā)明在檢測(cè)過程中對(duì)檢測(cè)樣本的要求嚴(yán)格,每一個(gè)檢測(cè)過程都需要對(duì)照樣本的參與,即對(duì)照樣本和檢測(cè)樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。這樣增加后續(xù)結(jié)果判讀的準(zhǔn)確性和一致性。

      本發(fā)明通過調(diào)整12對(duì)引物的配比、taq酶的用量和鎂離子的用量等,提高整個(gè)試劑盒的敏感性和特異性,敏感性和特異性分別能夠達(dá)到95%和100%。

      附圖說明

      圖1為本實(shí)施例1中對(duì)照樣本的12個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的基因峰。

      具體實(shí)施方式

      為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明方案,下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

      本發(fā)明提出的相關(guān)位點(diǎn):6個(gè)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)bat26、bat25、nr-21、nr-24、nr-27、mono-27;3個(gè)雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)d5s346、d2s123、d17s250;2個(gè)五核苷酸重復(fù)多態(tài)性pentac、pentad以及性別決定位點(diǎn)amel。

      實(shí)施例1:本發(fā)明在多重?zé)晒鈖cr的基礎(chǔ)上,配制成已經(jīng)預(yù)混好的檢測(cè)12個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的引物組合物。直接可對(duì)提取完成的樣本進(jìn)行檢測(cè),這樣使檢測(cè)步驟更為簡(jiǎn)便。

      具體步驟如下:

      1)提取對(duì)照樣本(如全血樣本)和石蠟包埋腫瘤組織樣本(5-10片,5um左右)基因組dna(采用商業(yè)化的外周血基因組dna和石蠟包埋組織基因組dna提取試劑盒)。

      2)將提取之后的基因組dna進(jìn)行濃度測(cè)定,并將濃度稀釋至10-20ng/μl進(jìn)行后續(xù)的pcr反應(yīng)過程。

      3)反應(yīng)體系的成分組成:dntps、mg2+、dna聚合酶buffer、反轉(zhuǎn)錄buffer、12個(gè)基因的引物對(duì)、dna聚合酶等。

      4)pcr反應(yīng)條件:37℃下udg酶反應(yīng)2min;95℃預(yù)變性3min;94℃變性15s,60℃下退火延伸45s,45個(gè)循環(huán)。

      5)pcr反應(yīng)體系的配置:

      pcr擴(kuò)增mix(12.5μl,其余用純化水補(bǔ)齊)

      pcr引物混合液體系(6.5μl,其余用純化水補(bǔ)齊)

      pcr擴(kuò)增體系

      pcr擴(kuò)增程序如下:

      第一擴(kuò)增階段:37℃udg酶反應(yīng)2min;

      第二擴(kuò)增階段:95℃預(yù)變性3min;

      第三擴(kuò)增階段:94℃變性15s,60℃退火延伸45s,45個(gè)循環(huán)。

      6)取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl、liz-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)1μl和hi-diformamide(高純甲酰胺)8μl置于0.2mlpcr單管中渦旋振蕩10秒,2000rpm離心15秒。按照毛細(xì)管電泳機(jī)器的上樣說明,在合適的毛細(xì)管電泳檢測(cè)機(jī)器上進(jìn)行檢測(cè)。

      7)結(jié)果分析

      ①先分析性別位點(diǎn)amel、pentac、pentad,amel位點(diǎn)在206bp或者212bp處有規(guī)則的等位基因峰,pentac和pentad具有規(guī)則的等位基因峰,這三者用于確認(rèn)腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的正常樣本是否為同一來源,然后進(jìn)行后續(xù)分析,否則可能存在樣本混雜或污染,建議重新提取樣本再行檢測(cè)。

      ②微衛(wèi)星穩(wěn)定型(mss):6個(gè)單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物中沒有發(fā)生改變,均為規(guī)則的等位基因峰。

      ③微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定型(msi-l):6個(gè)單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物中僅有1個(gè)發(fā)生改變,其余均為規(guī)則的等位基因峰。

      ④微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型(msi-h):6個(gè)單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物中有≥2發(fā)生改變,其余均為規(guī)則的等位基因峰。

      ⑤對(duì)照樣本(如全血樣本)屬于微衛(wèi)星穩(wěn)定型(mss)。

      ⑥檢測(cè)樣本(石蠟包埋腫瘤組織)根據(jù)對(duì)照樣本比較單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物發(fā)生改變的數(shù)目,進(jìn)行結(jié)果判讀。

      8)成品試劑盒的性能驗(yàn)證

      利用配置完成的成品試劑盒進(jìn)行產(chǎn)品特異性和靈敏度檢測(cè)。

      收集已知msi型別的結(jié)直腸癌樣本40例,利用上述成品試劑盒進(jìn)行特異性檢測(cè),結(jié)果如下:

      從上述結(jié)果可以得出,本試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確性達(dá)到100%,特異性也達(dá)到100%。

      利用本試劑盒檢測(cè)發(fā)生約1%、5%、20%、50%、100%msi-h的樣本進(jìn)行檢測(cè),本試劑盒最低檢測(cè)分布比例至5%,因此,本試劑盒的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到95%左右。

      實(shí)施例2:

      收集來自武漢同濟(jì)醫(yī)院的400例隨機(jī)結(jié)直腸癌樣本和400例對(duì)應(yīng)的外周血對(duì)照樣本,利用上述的成品試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。具體操作步驟如實(shí)施案例1所述。400例隨機(jī)結(jié)直腸癌樣本中檢測(cè)出60例msi-h型別的樣本,13例msi-l型別的樣本,其余樣本均為mss型別。根據(jù)上述結(jié)果可以得出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的表現(xiàn)在結(jié)直腸癌的比例約占18%,與相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道相符。

      本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行了詳細(xì)闡述,以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離該發(fā)明構(gòu)思的前提下,所做的任何顯而易見的修改、等同替換或其他改進(jìn),均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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      <110>北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司

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      agttcctgtctctctgcca19

      <210>6

      <211>16

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>6

      gctgtagccttttgcc16

      <210>7

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>7

      gcagttagttagttagtt18

      <210>8

      <211>21

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>8

      agtttatagcagataagacag21

      <210>9

      <211>14

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>9

      gcaaagggcatggc14

      <210>10

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>10

      gcttttaactatggctct18

      <210>11

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>11

      tcagccagtatatgaaattg20

      <210>12

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>12

      agctcctttctaagccttct20

      <210>13

      <211>19

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>13

      agcagaggttttctaaata19

      <210>14

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>14

      aagtcgtctttggacagg18

      <210>15

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>15

      gacaaaaacaggatgcct18

      <210>16

      <211>21

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>16

      gggactttccacctatgggac21

      <210>17

      <211>15

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>17

      gtgggagacagagca15

      <210>18

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>18

      tggccaactaaaaaagaa18

      <210>19

      <211>21

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>19

      aattttacctcctgactccaa21

      <210>20

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>20

      caacctgggtgacagagt18

      <210>21

      <211>17

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>21

      ggcgcgcgacaccgcag17

      <210>22

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>22

      ccctttctcaagggaacc18

      <210>23

      <211>19

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>23

      catacataaactttcaaat19

      <210>24

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>24

      ggtttaaatatatatatggc20

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