本發(fā)明是關于植物抗病育種，具體而言，是關于一種抗tobrfv病毒的tm-22/tm-2蛋白突變體及其在植物抗病育種中的相關應用。
背景技術：
：：1、近年來，一種煙草花葉病毒屬(tobamovirus)的新型病毒——番茄褐色皺紋果病毒(tomato?brown?rugose?fruit?virus，tobrfv)在世界范圍內傳播，對番茄等茄科作物的產(chǎn)量和品質造成了巨大影響。2、在番茄育種和生產(chǎn)過程中，抗病基因tm-1、tm-2以及tm-22(又名tm-2a或tm-2-2)可用于抵抗來自煙草花葉病毒屬的病毒。其中，tm-2和tm-22互為等位基因，都編碼一長861個氨基酸的蛋白，且兩者之間只有4個氨基酸的差異。tm-22/tm-2蛋白作為一個能夠結合核苷酸且富含亮氨酸重復的受體(nucleotide-binding,leucine-rich?repeat?receptor，nlr)，由卷曲螺旋(coiled-coil，cc)結構域、核苷酸結合(nucleotide-binding，nb)結構域以及富含亮氨酸重復(leucine-rich?repeat，lrr)結構域組成。在tm-1、tm-2以及tm-22這三種抗病基因中，tm-22對煙草花葉病毒屬病毒的抗性更為持久，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應用更廣泛，具有廣譜抗性，能夠抵抗包括煙草花葉病毒(tobacco?mosaic?virus，tmv)與番茄花葉病毒(tomato?mosaic?virus，tomv)等多種病毒在內的tobamovirus。作為nlr類型的抗病蛋白，tm-22/tm-2在識別其對應的效應因子——煙草花葉病毒屬的運動蛋白(movementprotein，mp)后，能夠開啟效應因子誘導的免疫反應(effector-triggered?immunity，eti)，發(fā)揮對tobamovirus的抗性。3、新興的tobrfv雖然屬于煙草花葉病毒屬，但該病毒能夠突破tm-1，tm-2以及tm-22的抗性，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上針對該病毒還沒有有效的治理措施。有研究表明，雖然tobrfv與其同屬病毒tmv的mp氨基酸序列相似性較高，但tm-22與mptmv共表達時能夠引發(fā)肉眼可見的強烈細胞死亡，而tm-22與mptobrfv共表達時沒有明顯細胞死亡產(chǎn)生，這代表tm-22能有效識別mptmv，卻不能成功識別mptobrfv，這也是造成tobrfv突破tm-22基因抗性的根本原因。4、wo2022091104a1公開了一種可識別mptobrfv的tm-22蛋白突變體，其氨基酸序列的突變包括f528s、s604n或i652m，其他考慮的突變包括p579q、s604i、s651i、m704t、l842s、n522d、s723f、l560s、n522d、h737r、i652v、h817r、p736l。5、wo2022117884a1也公開了一種可識別mptobrfv的tm-22蛋白突變體，所述tm-22蛋白突變體第767位氨基酸為酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)或色氨酸(w)，以及包含c848r、n822c中的至少一種突變，進一步包括的突變?yōu)閚822f、n822m、n822y、n822w、n825h、n825k和n825t，并且這些突變可與f655l突變組合。6、在wo2022091104a1中，實驗驗證部分僅限于瞬時表達的結果，該發(fā)明者首先展現(xiàn)了所發(fā)現(xiàn)的tm-22突變體與mptobrfv共表達時能夠產(chǎn)生細胞死亡，在稍進一步的研究(如其fig.7f所示)，瞬時表達含有f528s、s604n或i652m的tm-22突變體相對于表達野生型tm-22能夠阻礙tmv-gfpmp-tobrfv(將原本攜帶gfp標簽蛋白的tmv病毒中的mp替換為來自tobrfv的mp)的擴散，但仍有相當數(shù)量的病毒擴散至植物的系統(tǒng)葉，這意味著f528s、s604n或i652m有一定的抗tobrfv的作用，但不能完全抑制病毒的繁殖和擴散。而且瞬時表達的結果不代表真正的轉基因植物或者基因編輯植物運用到生產(chǎn)時有效，亟需轉基因或基因編輯植物來驗證這些突變位點的有效性。在wo2022117884a1中，該發(fā)明者的實驗結果展現(xiàn)了其所發(fā)現(xiàn)的tm-22突變體與mptobrfv共表達時能夠產(chǎn)生細胞死亡，并且制作了表達tm-22單突變體c848r或者雙突變體c848r與f655l的轉基因植物。但轉基因植物在接種tobrfv病毒21天時，病癥指數(shù)打分為7(small?phenotypic?difference?but?not?clearly?attributable?to?a?diseasesymptom)，即這些植物表現(xiàn)出可能和病毒相關的較弱的表型差異，雖然抗性好于打分為1(very?strong?symptoms)的易感植物，但達不到病癥打分為9(no?visible?symptoms)的水平，即這些轉基因植物發(fā)揮了一定抗病作用，但是不能完全消除植物體內病毒，并且感染的植物出現(xiàn)一定病癥。所以上述研究具有一定局限性。7、綜上，在目前本領域中，仍需要尋找更多的能夠識別mptobrfv的tm-22/tm-2突變體以達到完全抗tobrfv的效果，并且通過建立轉基因植物的形式進一步確認突變體對病毒的抑制作用。技術實現(xiàn)思路1、本發(fā)明的目的在于提供一種抗tobrfv的tm-22/tm-2突變體，為植物的抗病育種提供良好基礎。2、本案發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)了多個可以增強對mptobrfv識別能力的tm-22/tm-2突變位點，并通過實驗證明了表達這些tm-22/tm-2突變體能夠增強植物對tobrfv病毒的抗性，可便于以后對農(nóng)作物進行轉基因或基因編輯育種。3、具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種tm-22/tm-2蛋白突變體，其氨基酸序列與tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列相比，具有以下突變：4、s723y；5、n744；6、v697；和/或7、l608。8、本發(fā)明中，如無特別說明，所述tm-22蛋白是指未經(jīng)突變的野生型tm-22蛋白。具體地，tm-22蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。9、本發(fā)明中，如無特別說明，所述tm-2蛋白是指未經(jīng)突變的野生型tm-2蛋白。具體地，tm-2蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。10、tm-22的氨基酸序列(seq?id?no:1)：11、maeilltsvinksveiagnlliqegkrlywlkedidwlqremrhirsyvdnakakeaggdsrvknllkdiqelagdvedllddflpkiqqsnkfnyclkrssfadefameiekikrrvvdidrirktyniidtdnnnddcvlldrrrlflhadeteiigldddfnmlqakllnqdlhygvvsivgmpglgkttlakklyrlirdqfecsglvyvsqqpraseilldiakqiglteqkmkenlednlrsllkikryvillddiwdveiwddlklvlpecdskvgsrmiitsrnsnvgryiggesslhalqpleseksfelftkkifnfddnnswanaspdlvnigrnivgrcggiplaivvtagmlrarertehawnrvlesmghkvqdgcakvlalsyndlpiasrpcflyfglypedheirafdlinmwiaekfivvnsgnrreaedlaedvlndlvsrnliqlakrtyngrisscrihdllhslcvdlakesnffhtahdafgdpgnvarlrritfysdnvmieffrsnpkleklrvlfcfakdpsifshmayfdfkllhtlvvvmsqsfqayvtipskfgnmtclrylrlegnicgklpnsivkltrletididrrsliqppsgvweskhlrhlcyrdygqacnscfsissfypniyslhpnnlqtlmwipdkffeprllhrlinlrklgilgvsnstvkmlsifspvlkalevlklsfssdpseqiklssyphiaklhlnvnrtmalnsqsfppnlikltlayfsvdryilavlktfpklrklkmfickyneekmdlsgeangysfpqlevlhihspnglsevtctddvsmpklkkllltgfhcrislserlkklsk。12、tm-2的氨基酸序列(seq?id?no:2)：13、maeilltsvinksveiagnlliqegkrlywlkedidwlqremrhirsyvdnak?akeaggdsrvknllkdiqelagdvedllddflpkiqqsnkfnyclkrssfadefameiekikrrvvdidrirktyniidtdnnnddcvlldrrrlflhadeteiigldddfnmlqakllnqdlhygvvsivgmpglgkttlakklyrlirdqfecsglvyvsqqpraseilldiakqiglteqkmkenlednlrsllkikryvfllddiwdveiwddlklvlpecdskvgsriiitsrnsnvgryiggesslhalqpleseksfelftkkifnfddnnswanaspdlvnigrnivgrcggiplaivvtagmlrarertehawnrvlesmghkvqdgcakvlalsyndlpiasrpcflyfglypedheirafdlinmwiaekfivvnsgnrreaedlaedvlndlvsrnliqlakrtyngrisscrihdllhslcvdlakesnffhtahdafgdpgnvarlrritfysdnvmieffrsnpkleklrvlfcfakdpsifshmayfdfkllhtlvvvmsqsfqayvtipskfgnmtclrylrlegnicgklpnsivkltrletididrrsliqppsgvweskhlrhlcyrdygqacnscfsissfypniyslhpnnlqtlmwipdkffeprllhrlinlrklgilgvsnstvkmlsifspvlkalevlklsfssdpseqiklssyphiaklhlnvnrtmalnsqsfppnlikltlanftvdryilavlktfpklrklkmfickyneekmdlsgeangysfpqlevlhihspnglsevtctddvsmpklkkllltgfhcrislserlkklsk。14、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，是指在tm-22蛋白或tm-2蛋白的基礎上，氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸進行突變(替換、缺失和/或增加)獲得的衍生蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其氨基酸序列與tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列相比，具有99％以上的相似性，進一步優(yōu)選具有99.5％以上的相似性，更進一步優(yōu)選具有99.7％以上的相似性，更進一步優(yōu)選具有99.8％以上的相似性。優(yōu)選地，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其氨基酸序列與tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列相比，僅具有9個以下的氨基酸的突變，優(yōu)選僅具有5個以下氨基酸的突變，進一步優(yōu)選僅具有4個以下氨基酸的突變，更優(yōu)選僅具有3個、2個或1個氨基酸的突變。15、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其中，n744突變?yōu)閚744d。16、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其中，v697突變?yōu)関697a。17、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其中，l608突變?yōu)閘608f。18、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其氨基酸序列相比于tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列，僅具有s723y、n744d、v697a、l608f中的一個突變位點。19、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其氨基酸序列相比于tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列，具有s723y、n744d、v697a、l608f中的兩個、三個或四個突變位點。20、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體，其氨基酸序列相比于tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列，具有突變位點s723y，并具有n744d、v697a、l608f中的一個或兩個突變位點。21、另一方面，本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其編碼本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體。22、另一方面，本發(fā)明還提供了一種表達載體，其含有編碼本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體的基因。23、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的表達載體中，編碼本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體的基因可以由tm-22/tm-2基因的天然啟動子或者35s啟動子驅動表達。24、另一方面，本發(fā)明還提供了一種完整植物，或所述植物的花、果實、種子、根、葉或莖部分，其能夠表達本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體。25、具有本發(fā)明的tm-22/tm-2蛋白突變體的植物(或所述植物的花、果實、種子、根、葉或莖部分)，可具有tobrfv抗性。26、另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備具有tobrfv抗性植物的方法，該方法包括：利用轉基因的方式，在植物中表達含有編碼本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體的基因；或者，在植物細胞中直接導入基因編輯所需的dna、rna和/或蛋白質，將tm-22或tm-2編輯為本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體。所獲得的能夠表達本發(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體的植物即為具有tobrfv抗性的植物。27、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，可以采用領域中任何可行的轉基因方式制備本發(fā)明的能夠表達所述tm-22/tm-2蛋白突變體的植物。28、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的制備具有tobrfv抗性植物的方法中，利一種基因編輯載體對植物進行轉基因，獲得表達權利要求13任一項所述的tm-22/tm-2蛋白突變體的植物。具體地，所述基因編輯載體通過堿基編輯或者引導編輯或者同源重組，或者通過其他以巨型核酸酶、鋅指核酸酶、轉錄激活樣效應因子核酸酶和成簇規(guī)律間隔短回文重復為基礎的基因編輯方法，將tm-22或tm-2編輯為權利要求1-3任一項所述的tm-22/tm-2蛋白突變體。29、另一方面，本發(fā)明還提供了一種誘導植物tm-22或tm-2基因突變的方法，該方法包括：通過化學誘變和/或物理誘變的方式或者通過自然突變群體，進行定向誘導基因組局部突變技術，將植物的tm-22或tm-2蛋白突變?yōu)楸景l(fā)明所述的tm-22/tm-2蛋白突變體。具體地，所述化學誘變選自甲基磺酸乙酯(ems)誘變；所述物理誘變選自輻射誘變。所獲得的具有所述tm-22/tm-2蛋白突變體的植物即為具有tobrfv抗性的植物。30、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備具有tobrfv抗性的植物的方法，該方法包括：用tm-22天然啟動子驅動編碼所述的tm-22蛋白突變體的tm-22基因的表達，并配合一個卡那霉素抗性基因的表達框，制備轉基因植物。該tm-22基因突變體的表達模塊和卡那霉素抗性基因的表達模塊可以插入同一個轉移dna(transferred?dna，t-dna),或者不同t-dna，后者利于通過傳代后性狀分離得到只含有tm-22基因突變體的轉基因植物。其中，在進行本生煙草轉化的載體中，tm-22基因突變體的表達模塊和卡那霉素抗性基因通過串聯(lián)的方式插入同一個t-dna；在進行番茄轉化的載體中，tm-22基因突變體的表達模塊和卡那霉素抗性基因插入兩個t-dna。具體地，該方法還包括：收取轉基因煙草t0代的種子，在卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選，選出具有編碼卡那霉素抗性基因和編碼tm-22基因突變體的t1代植物，之后收取轉基因t1代的種子，繼續(xù)通過卡那霉素抗性篩選，選出具有編碼卡那霉素抗性基因和編碼tm-22基因突變體的t2代植物。以及，具體方法還包括獲得并驗證t0代轉入tm-22基因突變體的番茄植物。31、另一方面，本發(fā)明還提供了所述的具有tobrfv抗性的植物。更具體地，本發(fā)明所述的植物還能抗tmv病毒。32、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，所述植物包括但不限于煙草、番茄或辣椒或其他茄科植物等。33、本發(fā)明的tm-22/tm-2突變體的突變位點s723y、n744d、v697a、l608f，單點或組合能夠增強tm-22與mptobrfv共表達時產(chǎn)生細胞死亡能力。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，把這些位點單獨突變或者進行多個位點組合突變，構建含有tm-22天然啟動子-tm-22突變體-tm-22天然終止子表達模塊和卡那霉素抗性基因表達模塊的質粒載體。在茄科植物的代表物種本生煙草中，利用農(nóng)桿菌侵染法進行轉基因操作，通過含有卡那霉素培養(yǎng)基的篩選，最終得到表達tm-22突變體的轉基因煙草。在轉基因煙草上，接種tobrfv病毒，通過觀察是否有病毒表型，或者提取植物rna進行反轉錄(reverse?transcription，rt)-pcr以及侵染力檢測的方式判定tobrfv病毒的存在與否，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草能抗tobrfv病毒。并且，本發(fā)明還驗證了轉基因煙草對tmv-gfp病毒的抗性。此外，本發(fā)明還制作了表達tm-22突變體的轉基因番茄，并通過侵染力檢測法證實到其沒有被tobrfv侵染，即轉基因番茄抗tobrfv病毒。本發(fā)明證實了表達本發(fā)明的tm-22突變體能夠賦予植物對tobrfv和tmv病毒的抗性，可便于日后對農(nóng)作物進行轉基因或基因編輯育種。當前第1頁12當前第1頁12