本發(fā)明屬于生物制劑，具體涉及一種具有廣譜裂解活性的抗菌肽lysph1-cp、肽聚糖水解酶lysph1及其突變體lysph1-k和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、抗生素曾被認(rèn)為是治療細(xì)菌感染性疾病最有力的武器，然而隨著抗生素的濫用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益加劇，新抗生素研發(fā)的速度遠(yuǎn)低于耐藥菌產(chǎn)生的速度?？勺鳛樘娲男驴股赜譃閿?shù)極少，且費(fèi)用昂貴，造成臨床上大量耐藥菌感染者因無(wú)藥可醫(yī)而死亡，在這樣嚴(yán)峻的抗生素耐藥形式作用下，作為可替代抗生素成為新型抗菌制劑的噬菌體，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。

2、噬菌體是一類(lèi)以微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體）為宿主的病毒，沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，僅由衣殼蛋白和其內(nèi)部的遺傳物質(zhì)組成，必須依賴(lài)宿主進(jìn)行復(fù)制和增殖。噬菌體作為細(xì)菌的天然殺手，廣泛存在于自然界中，是地球上最豐富多樣的生物體，它們的數(shù)量大約是細(xì)菌的10倍。近一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，噬菌體治療的安全性和有效性已經(jīng)在大量動(dòng)物試驗(yàn)中得到了證實(shí)。裂解性噬菌體在感染宿主細(xì)菌細(xì)胞后即立即啟動(dòng)自身早期基因的表達(dá)，通過(guò)這些早期基因表達(dá)產(chǎn)物降解宿主dna，從而終止宿主的基因表達(dá)，奪取宿主的dna復(fù)制機(jī)器大量合成自身核酸；當(dāng)產(chǎn)生足夠的噬菌體后，這些核酸被當(dāng)作模板產(chǎn)生大量的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行加工和包裝，產(chǎn)生下一代噬菌體顆粒。一旦噬菌體調(diào)控蛋白積累到一定水平，即啟動(dòng)噬菌體的穿孔素大量表達(dá)，穿孔素在宿主細(xì)胞內(nèi)形成孔洞，導(dǎo)致噬菌體裂解酶穿過(guò)內(nèi)膜并接近細(xì)胞壁，將細(xì)胞壁裂解，從而達(dá)到裂解細(xì)菌的目的。

3、除了完整的噬菌體顆?？梢宰鳛榭咕鷦┩?，噬菌體編碼的肽聚糖水解酶-裂解酶（lysin）也是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)潛力的新型抗菌分子。裂解酶是雙鏈dna噬菌體在感染宿主的后期編碼的一類(lèi)水解酶，可以水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)菌裂解并釋放子代噬菌體。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌裂解酶有比較系統(tǒng)和成熟的研究，眾多天然裂解酶和嵌合裂解酶在動(dòng)物感染模型中被證實(shí)安全有效，其中抗耐藥金黃色葡萄球菌感染的多個(gè)裂解酶已進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段。裂解酶的高效性、特異性、低耐藥性以及與現(xiàn)有抗生素的協(xié)同作用等優(yōu)勢(shì)使其成為新的、極具前景的抗菌藥物。

4、目前，關(guān)于噬菌體裂解酶的應(yīng)用主要是裂解革蘭氏陽(yáng)性菌，例如：金黃色葡萄球菌、李斯特菌等，對(duì)革蘭氏陰性菌具有裂解活性的噬菌體裂解酶研究較少。因此，有必要開(kāi)發(fā)新的、對(duì)革蘭氏陰性菌具有高效裂解活性的噬菌體裂解酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜裂解活性的肽聚糖水解酶lysph1及其突變體和應(yīng)用。本發(fā)明中的抗菌肽lysph1-cp、肽聚糖水解酶lysph1和肽聚糖水解酶突變體lysph1-k具有廣譜的裂解活性，能廣譜裂解革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種具有廣譜裂解活性的抗菌肽lysph1-cp，抗菌肽lysph1-cp的氨基酸序列如seq?id?no:?1所示。

3、在第二方面，本發(fā)明提供了一種具有廣譜裂解活性的肽聚糖水解酶lysph1，肽聚糖水解酶lysph1包含上述抗菌肽lysph1-cp，并且肽聚糖水解酶lysph1選自如下任一所示的蛋白質(zhì)：a1）氨基酸序列如seq?id?no:?2所示的蛋白質(zhì)；a2）將如seq?id?no:?2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的變化得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)，其中，變化選自取代、缺失、添加中的至少一種；a3）與a1）-a2）中任一項(xiàng)所限定的氨基酸序列具有90%以上（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性并且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

4、在第三方面，本發(fā)明提供了一種具有廣譜裂解活性的肽聚糖水解酶突變體lysph1-k，肽聚糖水解酶突變體lysph1-k包含上述抗菌肽lysph1-cp或上述肽聚糖水解酶lysph1；并且肽聚糖水解酶突變體lysph1-k選自如下任一所示的蛋白質(zhì)：a1）氨基酸序列如seq?id?no:?3所示的蛋白質(zhì)；a2）將如seq?id?no:?3所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的變化得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)，其中，變化選自取代、缺失、添加中的至少一種；a3）與a1）-a2）中任一項(xiàng)所限定的氨基酸序列具有90%以上（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性并且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

5、本發(fā)明提供的上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k可以是天然、重組或合成的活性多肽，該活性多肽可以是天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成的產(chǎn)物，或是使用重組技術(shù)從原核宿主（例如大腸桿菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中產(chǎn)生的產(chǎn)物。

6、在一些實(shí)施方案中，上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k是通過(guò)將含有其編碼基因的重組載體導(dǎo)入表達(dá)宿主（例如大腸桿菌bl21(de3)）中得到重組基因工程菌株，然后將該重組基因工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到肽聚糖水解酶lysph1或肽聚糖水解酶突變體lysph1-k。

7、在第四方面，本發(fā)明提供了編碼上述抗菌肽lysph1-cp或上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k的核酸分子，核酸分子選自如下任一所示的核酸分子：b1）具有如seq?id?no:?4所示、如seq?id?no:?5所示或如seq?id?no:?6所示的核苷酸序列的核酸分子；b2）與b1）限定的核酸分子雜交且編碼上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k的核酸分子；b3）與b1）或b2）限定的核酸分子具有90%以上（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同一性且編碼上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k的核酸分子。

8、本發(fā)明提供的上述核酸分子通常可以通過(guò)pcr擴(kuò)增或人工合成的方法獲得。

9、如本文所用，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”是指兩個(gè)核酸分子片段在如sambrook等的分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)(冷泉巷實(shí)驗(yàn)室出版，紐約，美國(guó))的“大腸桿菌中克隆基因的表達(dá)”一節(jié)里所述的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下互相雜交。這樣的條件如在45℃的6.0×ssc中雜交，然后在50℃的2×ssc中進(jìn)行洗滌的步驟。為了選擇嚴(yán)格性，可以例如在用于低嚴(yán)格性的50℃下的2.0×ssc和用于高嚴(yán)格性50℃下的2.0×ssc之間選擇洗滌步驟中的鹽濃度。另外，洗滌步驟中溫度可在用于低嚴(yán)格性的約22℃的室溫和用于高嚴(yán)格性的65℃之間變化。

10、如本文所用，術(shù)語(yǔ)“序列同一性”可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件（比如ausubel?et?al.eds.（2007）在current?protocols?in?molecular?biology中所述的軟件程序）進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)被比較的序列中的位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是同一的。兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列與另一序列具有一定百分比（例如90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”是指當(dāng)序列比對(duì)時(shí)，所比較的兩個(gè)序列中該百分比的堿基或氨基酸相同。

11、在第五方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒，包含上述核酸分子。

12、本發(fā)明中的表達(dá)盒還可以包括增強(qiáng)序列或其他調(diào)控元件。

13、在第六方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，包含上述核酸分子或上述表達(dá)盒。

14、本發(fā)明中的重組載體包括克隆載體和表達(dá)載體，克隆載體用于復(fù)制相關(guān)序列，表達(dá)載體用于表達(dá)相關(guān)基因，其中構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)用到的載體可以為pet28b載體。

15、在第七方面，本發(fā)明提供了一種重組細(xì)胞，包含上述核酸分子、上述表達(dá)盒或上述重組載體。

16、在一些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞的制備方法包括將上述重組載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主細(xì)胞中的步驟。

17、在第八方面，本發(fā)明提供了上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：對(duì)上述重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，得到培養(yǎng)物；從培養(yǎng)物中分離肽聚糖水解酶lysph1或肽聚糖水解酶突變體lysph1-k。

18、本發(fā)明中，培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒(méi)有特殊要求，保證重組細(xì)胞正常生長(zhǎng)即可。并且從培養(yǎng)物中分離出上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k的方法均是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

19、在一些實(shí)施方案中，上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k的制備方法中所使用的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域內(nèi)可表達(dá)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，優(yōu)選lb培養(yǎng)基。

20、在第九方面，本發(fā)明提供了上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突變體lysph1-k在如下任一種中的應(yīng)用：c1）裂解革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽(yáng)性菌中的應(yīng)用；c2）制備抗革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽(yáng)性菌感染藥物中的應(yīng)用；c3）制備抗革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽(yáng)性菌感染飼料添加劑中的應(yīng)用。

21、在一些實(shí)施方案中，革蘭氏陰性菌包括鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌中的一種或多種；革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、豬鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、化膿鏈球菌和肺炎鏈球菌中的一種或多種。

22、本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明中的抗菌肽lysph1-cp、包含該抗菌肽lysph1-cp的肽聚糖水解酶lysph1或包含該肽聚糖水解酶lysph1的肽聚糖水解酶突變體lysph1-k均具有較好的熱穩(wěn)定性，并且在體外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、豬鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、化膿鏈球菌和肺炎鏈球菌具有較好的裂解效果，能廣譜裂解革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌；同時(shí)該肽聚糖水解酶lysph1、該肽聚糖水解酶突變體lysph1-k能在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)，酶活性高。因此，該抗菌肽lysph1-cp、該肽聚糖水解酶lysph1、該肽聚糖水解酶突變體lysph1-k在制備抗感染類(lèi)藥物以及飼料添加劑的研發(fā)中具有較好的應(yīng)用前景。