本發(fā)明涉及基因檢測(cè)，具體而言，涉及一種耐藥基因檢測(cè)方法及系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、抗生素的大量使用，導(dǎo)致細(xì)菌通過獲得基因或染色體突變，使之能夠耐受這些藥物，從而產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，使得多種傳染病可能沒有可行的抗生素治療，對(duì)人類健康造成巨大的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)菌耐藥性已成為威脅全球公共衛(wèi)生健康的重要因素之一。2017年世界衛(wèi)生組織(world?health?organization，who)發(fā)布對(duì)人類健康最具威脅的12種“超級(jí)細(xì)菌”，表明細(xì)菌抗生素耐藥性已成為全球公共衛(wèi)生問題。

2、根據(jù)我國2014至2019年及2022上半年的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，耐藥性大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌為我國臨床主要耐藥菌。其中除金黃色葡萄球菌外均為革蘭氏陰性菌。我國臨床分離肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2005年的3％快速攀升至2019年的25％以上，上升幅度高達(dá)8倍。2018年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(carss)數(shù)據(jù)顯示，全國1429所醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為10.1％，部分省市甚至超過20％。

3、基于細(xì)菌的耐藥基因檢測(cè)技術(shù)，目前已有商業(yè)化產(chǎn)品應(yīng)用到了臨床，如unyvero在對(duì)呼吸道常見病原體鑒定的同時(shí)納入10種耐藥基因?yàn)榕R床用藥提供指導(dǎo)，有助于提高呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(icu?vap)與醫(yī)院獲得相關(guān)性肺炎(hap)患者的早期精準(zhǔn)診斷并減少廣譜抗生素的使用；xpert?carba-r?assay可以檢測(cè)四種碳青霉烯耐藥基因(kpc，ndm，vim，imp，and?oxa-48)；最新升級(jí)的filmarray的血培養(yǎng)鑒定panel包含了11種常見的耐藥基因。

4、然而，傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法雖能提供細(xì)菌耐藥的表型信息，但需要長時(shí)間的培養(yǎng)和鑒定，且無法檢測(cè)耐藥基因；因此，本發(fā)明提出了一種耐藥基因檢測(cè)方法及系統(tǒng)，以至少部分解決現(xiàn)有技術(shù)中可能存在的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種耐藥基因檢測(cè)方法及系統(tǒng)，其能夠針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出解決方案，以至少部分解決現(xiàn)有技術(shù)中可能存在的問題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種耐藥基因檢測(cè)方法，包括：

4、引物組配：按照預(yù)設(shè)基因序列參數(shù)表，將由hplc純化后，且純度至少為95％的引物，組配成5x引物混合物；

5、2.5x?reaction?mix組配：按照預(yù)設(shè)比例將緩沖液、化學(xué)鹽、有機(jī)物助劑以及dna聚合酶混合組成2.5x反應(yīng)組合物；

6、樣本提?。韩@取滅活后的菌株濃度為100cfu/ml的混合檢測(cè)樣本，并分別進(jìn)行10倍、100倍以及1000倍稀釋，再通過buffer?ave試劑洗脫，獲得1000cfu/ml，100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液的樣本dna；

7、pcr體系和擴(kuò)增：將所述5x引物混合物、所述2.5x反應(yīng)組合物以及所述樣本dna按預(yù)設(shè)配置表配置，并按照預(yù)設(shè)次序循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，獲得pcr產(chǎn)物；

8、pcr檢測(cè)：將預(yù)先處理好的熒光染色劑與所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行混合，并依次通過加熱變性第一預(yù)設(shè)時(shí)長，冰浴第二預(yù)設(shè)時(shí)長，以及通過基因測(cè)序儀進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得檢測(cè)結(jié)果；

9、片段分析：通過片段分析軟件，基于檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)峰和樣本的擴(kuò)增峰相對(duì)的降低情況，確定是否檢出耐藥基因。

10、可選地，所述按照預(yù)設(shè)基因序列參數(shù)表，將由hplc純化后，且純度至少為95％的引物，組配成5x引物混合物，包括：

11、獲取包括kpc基因，vim基因，ndm基因，oxa-23基因，oxa-24基因，oxa-48基因，oxa-58基因，oxa-163基因、imp基因、ctx-m基因、tem基因、meca基因和mcr-基因的13個(gè)耐藥基因序列模板；

12、從基因序列參數(shù)表中，獲得序列g(shù)enebank號(hào)與基因系列進(jìn)行比對(duì)，確定所述基因系列的保守區(qū)域和突變區(qū)域，并選擇其中最保守的區(qū)域確定引物，以及通過hplc純化所述引物，獲得純度至少為95％的引物；

13、按照預(yù)設(shè)的13個(gè)耐藥基因檢測(cè)引物和內(nèi)參引物表，確定引物系列和濃度，以及所述基因序列的擴(kuò)增物大小的對(duì)應(yīng)關(guān)系；

14、根據(jù)所述對(duì)應(yīng)系和純化后的所述引物進(jìn)行配置得到5x引物混合物。

15、可選地，所述按照預(yù)設(shè)比例將緩沖液、化學(xué)鹽、有機(jī)物助劑以及dna聚合酶混合組成2.5x反應(yīng)組合物，包括：

16、按照如下組分配置：125mm的tricine-koh在25℃時(shí)其ph值為8.8、100mm的kcl、40mm的(nh4)2so4、6mm的mgcl2、1.2mm的dntps、2.5mm的dtt、2.5mg/ml的bsa、1m濃度為1％～20％的甜菜堿以及0.25u/μl的dna聚合酶，進(jìn)行混合制得2.5x反應(yīng)組合物。

17、可選地，所述獲取滅活后的菌株濃度為100cfu/ml的混合檢測(cè)樣本，并分別進(jìn)行10倍、100倍以及1000倍稀釋，再通過buffer?ave試劑洗脫，獲得1000cfu/ml，100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液的樣本dna，包括：

18、在基于ngs驗(yàn)證含耐藥基因的菌中，每種耐藥基因各選擇一株，取各種菌液1000cfu，配置成一定量的混合菌液；

19、對(duì)所述混合菌液進(jìn)行滅活處理，并至少分為三份，分別進(jìn)行10倍、100倍以及1000倍稀釋；

20、將稀釋后的每份所述混合菌液，通過qiaamp?minelute?virus?spin?kit試劑進(jìn)行提取，再以50μl的buffer?ave試劑洗脫，獲得1000cfu/ml，100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液的樣本dna。

21、從ngs(二代測(cè)序技術(shù))驗(yàn)證含耐藥基因的菌中，每種耐藥基因各選擇一株，取各種菌液1000cfu，配置成1ml混合菌液。樣本由某省疾控中心惠贈(zèng)，滅活后混合成檢測(cè)樣本，每種菌株濃度為100cfu/ml。對(duì)混好的樣本，分別稀釋10倍，100倍，經(jīng)qiaamp?minelute?virusspin?kit(貨號(hào)57704，qiagen)提取，按說明書操作，最后以50μl微升buffer?ave洗脫。獲得1000cfu/ml，100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液的提取dna。

22、可選地，所述將所述5x引物混合物、所述2.5x反應(yīng)組合物以及所述樣本dna按預(yù)設(shè)配置表配置，并按照預(yù)設(shè)次序循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，獲得pcr產(chǎn)物，包括：

23、將所述5x引物混合物、所述2.5x反應(yīng)組合物以及所述樣本dna按預(yù)設(shè)配置表進(jìn)行混合配置，通過95℃環(huán)境下預(yù)變性處理2min；

24、將預(yù)變性處理后的混合物，依次通過94℃持續(xù)10s，54℃～64℃持續(xù)30s以及72℃持續(xù)30s，進(jìn)行熱循環(huán)處理至少30次，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；

25、將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物，在60℃下持續(xù)或者54℃～64℃階梯式進(jìn)行2min的終延伸處理，獲得pcr產(chǎn)物。

26、可選地，所述將預(yù)變性處理后的混合物，依次通過94℃持續(xù)10s，54℃～64℃持續(xù)30s以及72℃持續(xù)30s，進(jìn)行熱循環(huán)處理至少30次，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物，包括：

27、所述將預(yù)變性處理后的混合物，依次通過94℃持續(xù)10s，以54℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃階梯式升溫持續(xù)30s，以及72℃持續(xù)30s，進(jìn)行熱循環(huán)處理30～32次，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

28、可選地，還包括對(duì)所述pcr產(chǎn)物在4℃的恒溫下進(jìn)行保藏。

29、可選地，所述將預(yù)選處理好的熒光染色劑與所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行混合，并依次通過加熱變性第一預(yù)設(shè)時(shí)長，冰浴第二預(yù)設(shè)時(shí)長，以及通過基因測(cè)序儀進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得檢測(cè)結(jié)果，包括：s5

30、由去離子甲酰胺與liz-120熒光染色劑進(jìn)行混合，獲得熒光混合物；

31、將12.5ul劑量的所述熒光混合物和1ul的pcr產(chǎn)物進(jìn)行混合，并去除其中的氣泡，得到混合有熒光劑的pcr產(chǎn)物；

32、將混合有熒光劑的pcr產(chǎn)物，在95℃的環(huán)境中進(jìn)行變性處理3min；

33、在變性處理后，進(jìn)行3min的冰浴處理；

34、通過一代基因測(cè)序儀，對(duì)冰浴處理后的產(chǎn)物，進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得檢測(cè)結(jié)果。

35、可選地，所述通過片段分析軟件，基于檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)峰和樣本的擴(kuò)增峰相對(duì)的降低情況，確定是否檢出耐藥基因，包括：s6

36、使用片段分析軟件genemapper和遺傳分析儀對(duì)所述檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析；

37、依據(jù)檢測(cè)1000cfu/ml、100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液樣本和三種濃度混合樣本中的13個(gè)耐藥基因及內(nèi)參均的擴(kuò)增峰進(jìn)行分析，當(dāng)樣本稀釋后檢測(cè)峰相對(duì)于所述擴(kuò)增峰有明顯降低，確定全部耐藥基因均檢出。

38、一種耐藥基因檢測(cè)系統(tǒng)，所述裝置用于實(shí)現(xiàn)上述的耐藥基因檢測(cè)方法；所述裝置包括：

39、引物組配模塊：按照預(yù)設(shè)基因序列參數(shù)表，將由hplc純化后，且純度至少為95％的引物，組配成5x引物混合物；

40、2.5x?reaction?mix組配模塊：按照預(yù)設(shè)比例將緩沖液、化學(xué)鹽、有機(jī)物助劑以及dna聚合酶混合組成2.5x反應(yīng)組合物；

41、樣本提取模塊：獲取滅活后的菌株濃度為100cfu/ml的混合檢測(cè)樣本，并分別進(jìn)行10倍、100倍以及1000倍稀釋，再通過buffer?ave試劑洗脫，獲得1000cfu/ml，100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液的樣本dna；

42、pcr體系和擴(kuò)增模塊：將所述5x引物混合物、所述2.5x反應(yīng)組合物以及所述樣本dna按預(yù)設(shè)配置表配置，并按照預(yù)設(shè)次序循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，獲得pcr產(chǎn)物；

43、pcr檢測(cè)模塊：將預(yù)先處理好的熒光染色劑與所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行混合，并依次通過加熱變性第一預(yù)設(shè)時(shí)長，冰浴第二預(yù)設(shè)時(shí)長，以及通過基因測(cè)序儀進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得檢測(cè)結(jié)果；

44、片段分析模塊：通過片段分析軟件，基于檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)峰和樣本的擴(kuò)增峰相對(duì)的降低情況，確定是否檢出耐藥基因。

45、本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點(diǎn)或有益效果：

46、通過引物組配：按照預(yù)設(shè)基因序列參數(shù)表，將由hplc純化后，且純度至少為95％的引物，組配成5x引物混合物；2.5x?reaction?mix組配：按照預(yù)設(shè)比例將緩沖液、化學(xué)鹽、有機(jī)物助劑以及dna聚合酶混合組成2.5x反應(yīng)組合物；樣本提?。韩@取滅活后的菌株濃度為100cfu/ml的混合檢測(cè)樣本，并分別進(jìn)行10倍、100倍以及1000倍稀釋，再通過buffer?ave試劑洗脫，獲得1000cfu/ml，100cfu/ml和10cfu/ml三種濃度混合菌液的樣本dna；pcr體系和擴(kuò)增：將所述5x引物混合物、所述2.5x反應(yīng)組合物以及所述樣本dna按預(yù)設(shè)配置表配置，并按照預(yù)設(shè)次序循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，獲得pcr產(chǎn)物；pcr檢測(cè)：將預(yù)先處理好的熒光染色劑與所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行混合，并依次通過加熱變性第一預(yù)設(shè)時(shí)長，冰浴第二預(yù)設(shè)時(shí)長，以及通過基因測(cè)序儀進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得檢測(cè)結(jié)果；片段分析：通過片段分析軟件，基于檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)峰和樣本的擴(kuò)增峰相對(duì)的降低情況，確定是否檢出耐藥基因。解決了傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法雖能提供細(xì)菌耐藥的表型信息，需要長時(shí)間的培養(yǎng)和鑒定，且無法檢測(cè)耐藥基因的問題，突破現(xiàn)有技術(shù)的限制，可以在不進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)和鑒定的情況下，進(jìn)行檢測(cè)耐藥基因，實(shí)現(xiàn)高效快速檢測(cè)。